Summary
Uma tela genética para a frente baseada na elevação de Ca2+ como leitura leva à identificação de componentes genéticos envolvidos em vias de sinalização dependentes de cálcio nas plantas.
Abstract
Telas genéticas avançadas têm sido ferramentas importantes na identificação imparcial de componentes genéticos envolvidos em várias vias biológicas. A base da tela é gerar uma população mutante que pode ser rastreada com um fenótipo de interesse. EMS (sulfonato de metano etílico) é um agente alquilante comumente usado para induzir mutação aleatória em uma tela genética clássica para a frente para identificar múltiplos genes envolvidos em qualquer processo. A elevação do cálcio citosomico (Ca2+) é uma via de sinalização inicial chave que é ativada após a percepção do estresse. No entanto, a identidade dos receptores, canais, bombas e transportadores do Ca2+ ainda é evasiva em muitos sistemas de estudo. Aequorin é uma proteína repórter de cálcio celular isolada da Aequorea victoria e expressa em Arabidopsis. Explorando isso, projetamos uma tela genética avançada na qual ems-mutagenizamos a aequorin transgênica. As sementes das plantas mutantes foram coletadas (M1) e a triagem para o fenótipo de interesse foi realizada na população segregadora (M2). Usando um protocolo de medição Ca2+ de alta produtividade de 96 poços, vários novos mutantes podem ser identificados que têm uma resposta de cálcio variada e são medidos em tempo real. Os mutantes com o fenótipo de interesse são resgatados e propagados até que uma população de plantas mutantes homozigosa seja obtida. Este protocolo fornece um método para encaminhar telas genéticas em fundo de repórter Ca2+ e identificar novos alvos regulamentados ca2+.
Introduction
Uma mudança na concentração de cálcio citosomico (Ca2+) na percepção de estímulo biótico ou abiótico é um evento de sinalização precoce bem estudado que ativa muitas vias de sinalização1,,2,,3,4. Uma célula em seu estado de repouso basal mantém uma concentração ca2+ mais baixa no citosol e sequesters em excesso ca2+ em várias organelas intracelulares e apoplasto extracelular levando a um gradiente Ca2+ íngreme5,6. Após a percepção do sinal, os níveis de Ca2+ aumentam no citosol devido a um influxo de Ca2+ de fontes extracelulares e/ou intracelulares e geram uma assinatura específica de cálcio7,,8,,9. As elevações ca2+ no citosol são ativadas por muitos estímulos, mas a especificidade é mantida por lojas distintas que liberam Ca2+,uma assinatura ca2+ exclusiva e proteínas sensoriais apropriadas10,,11.
O uso de agente alquilante, sulfonato de metano etílico (EMS) para mutagênese é uma ferramenta poderosa em telas genéticas avançadas clássicas para identificar múltiplos genes independentes envolvidos em um processo. EMS é um mutagênico químico que induz as transições C para T e G para A aleatoriamente em todo o genoma e produz uma mudança de 1 bp em cada 125 kb do genoma. A mutagênese EMS induzirá ≈1000 alterações de par de base única, inserção/exclusões (InDel) ou polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) por genoma12. Mutações induzidas pelo EMS são mutações de vários pontos com uma frequência de mutação que varia de 1/300 a 1/30000 por lócus. Isso reduz o número de plantas M1 necessárias para encontrar uma mutação em um determinado gene. Uma faixa populacional de sementes M1 de 2000-3000 é tipicamente usada para obter mutações de interesse em Arabidopsis thaliana13,14.
Os transgênicos de aequorin são plantas ecotipos Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) expressando p35S-apoaequorin (pMAQ2) no citosol15. Aequorina é uma proteína de ligação Ca2+ composta de apoproteína e um grupo protético composto por molécula de luciferina, coelenterazina. A ligação de Ca2+ à aequorina, que possui três sítios ca2+ de ligação EF-hands, resulta em coelenterazina sendo oxidada e ciclizada para dar o intermediário dioxetanona, seguida de uma alteração conformacional da proteína acompanhada pela liberação de dióxido de carbono e coelenteramida singlet-excited16. A coelenteramida tão produzida emite uma luz azul (λmax, 470 nm) que pode ser detectada pelo luminômetro17. As elevações extremamente rápidas de Ca2+ podem, portanto, ser medidas em tempo real e exploradas para telas genéticas rápidas. Este protocolo visa usar a especificidade da resposta ao cálcio para identificar novos atores-chave que estão envolvidos na assinatura do Ca2+. Para alcançar essa tarefa, usamos mutagênese EMS em aequorina transgênica e identificamos os SNPs associados à sinalização alterada de Ca2+. O protocolo identifica mutantes que não mostram elevações de Ca2+ reduzidas após a adição de estímulos. Esses mutantes podem então ser mapeados para identificar os genes responsáveis pela resposta ca2+. O método é aplicável a qualquer tipo de estímulo líquido em plantas que resulte em uma elevação de Ca2+. Uma vez que a elevação do Ca2+ é uma das primeiras respostas na via de sinalização de defesa vegetal, a identificação de componentes de resposta a montante pode fornecer candidatos para a engenharia genética para desenvolver plantas resistentes.
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Protocol
1. Mutagênese EMS e coleção única de sementes baseadas em pedigree (1-3 meses)
- Pesar 150 mg de sementes (~7500) de aequorina para mutagênese EMS (sementes M0). Pese mais 150 mg de sementes para serem usadas como controle.
- Transfira as sementes para um tubo de 50 mL e adicione 25 mL de 0,2% EMS (v/v) (ATENÇÃO) (para tratamento) ou 25 mL de água autoclavada (para controle).
NOTA: O sulfonato de metano é um agente químico para mutagenizar o material vegetal. - Sele o tubo com parafilm e enrole-o em papel alumínio. Gire o tubo de ponta a ponta por 18 h em temperatura ambiente.
- Deixe as sementes se instalarem. Remova cuidadosamente a solução EMS e descarte em um recipiente de resíduos contendo 1 M NaOH em volumes iguais (o NaOH ajuda a neutralizar/inativar o EMS tornando-o seguro para descartar). Descarte o plástico usado em uma solução NaOH de 1 M.
NOTA: Após 24 horas, descarte os descartes de acordo com as práticas laboratoriais de materiais perigosos. - Lave bem as sementes mutagenizadas com 40 mL de água autoclavada pelo menos 8 vezes. Descarte o EMS contendo água em um recipiente de resíduos NaOH como mencionado acima.
- Para a lavagem final, adicione 40 mL de tiossulfito de sódio de 100 mM e enxágue 3 vezes para remover traços de EMS.
- Mergulhe as sementes em 40 mL de água autoclavada por ~1h para difundir o EMS das sementes e, em seguida, coloque-as no papel do filtro até secar completamente.
- Transfira as sementes para um tubo de microcentrífuga e estratifice as sementes a 4 °C em 40 mL de água autoclavada por 2-4 dias. Isso ajuda a quebrar a dormência das sementes e garante um crescimento homogêneo.
- Transfira tanto as sementes mutagenizadas (M0) quanto as sementes de controle para o solo (composição do solo: agropet: soilrite, 1:1) e transfira-as para salas de crescimento com um fotoperíodo escuro de 16h/8h, uma intensidade leve de 150 μmol∙m−2∙s−1 e ~70% de umidade relativa.
- Para determinar se a mutagênese foi bem sucedida, procure a redução da velocidade de germinação e o crescimento das mudas, e o setor de clorofila18 (Figura 1A). Compare as plantas mutagenizadas com as plantas de controle para identificar essas diferenças fisiológicas e de desenvolvimento.
NOTA: Diferentes métodos podem ser usados para a colheita de sementes de plantas M1. Neste protocolo, usamos o método único de coleta de sementes baseado em pedigree. Cada planta M1 recebe um número único, começando de A1 a A3500. - Manter plantas numeradas individualmente como linhas de plantas discretas(Figura 1B).
- Após a maturação, colhem sementes dessas plantas mutantes individuais e armazenam como linhas individuais de M1 (Figura 2). A partir da única coleção de sementes baseadas em pedigree, obtivemos cerca de 5000 linhas M1 das quais 3500 M1 foram rastreadas.
2. Triagem de alto rendimento para selecionar mutantes (8 meses)
- Identifique novos mutantes com base na resposta ca2+ a um estímulo selecionado. Aqui, usamos H2O2 como exemplo.
- Para identificar mutantes, tela a geração M2. Uma vez que os mutantes recessivos segregam-se em 1/8 de frequência na geração M2 sobre a mutagênese EMS14, a triagem de 8-12 M2-segregando plantas cobre uma linha M1 e identifica um mutante recessivo homozigoso (usando 12 mudas aumenta a probabilidade de encontrar um mutante). De cada linha Independente M1, teste 12 M2 mudas para resposta Ca2+ para H2O2 (12 M2 mudas por linha M1).
- Use um protocolo de esterilização de sementes de alto rendimento e protocolo de crescimento de plantas hidropônicas19. Coloque quase 12-15 M2 sementes por linha M1 em poços individuais de uma placa de cultura tecidual de 24 poços e estérilize usando gás cloro (40 mL de hipoclorito de sódio de 12% e ácido clorídrico, 3:1, v/v) em um desiccator por 4h em um capô de fumaça. Após o procedimento, abra o desiccador e deixe durante a noite para que o gás cloro evapore.
- Após a esterilização, leve as placas para fora e adicione mídia líquida de 1/2 MS (MS sem ágar) a poços individuais. Sele as placas com parafilm e estratifice as sementes por 2-4 dias a 4 °C e depois mova as sementes para uma câmara de crescimento com 10h de luz/ 14h de fotoperíodo escuro a 20-22 °C com 70% de umidade relativa.
- Uma vez que as mudas têm 8-12 dias de idade, coloque 12 M2 mudas de cada linha individualmente em uma placa de 96 poços de luminômetro. Para medir a resposta ca2+ para H2O2,use um leitor de placas de luminômetro.
- Após a transferência de mudas, adicione 150 μL de solução de coelentrazina de 5-10 μM (diluída em água autoclavada a partir de um estoque de 5 mM em metanol) (CUIDADO) em poços individuais em uma área escura/baixa luz e armazenar no escuro a 21 °C por 8h.
NOTA: Coelentrazina é um grupo protético que se liga à apo-aequorina e a reconstitui à aequorina funcional. A coelentrazina é sensível à luz e, portanto, é armazenada em garrafas de cor escura, protegidas da luz. - No dia seguinte, realize a tela mutante usando 10 mM H2O2 como estímulo e meça a resposta ca2+ subsequente.
- Para medição simultânea de 24 poços, crie um programa cinético automatizado que mede o fundo por 1 min, seguido de adição de estímulos (40 μL) e medição de 10 min, seguido de descarga total de aequorina (2 M CaCl2 em 150 μL 20% etanol) por 1-2 min.
NOTA: É necessária uma descarga final para a aequorina total para quantificar o Ca2+ medido e como controle adicional para a aequorina funcional. A descarga final é de um curto prazo de 1-2 min e não causa morte significativa da planta. Alternativamente, se as plantas morrerem após a etapa de descarga, então re-tela a linha M1 específica e resgate sem descarga. Tais mutantes podem ser confirmados nas gerações M3 e M4 usando a etapa de descarga. - Use um método de digitalização de formato de 24 poços que mede cada linha em intervalo de 7 s com tempo de integração de 300 ms por poço por ponto de medição. Use uma muda tipo selvagem como controle em cada linha para comparação e avaliação do mutante.
NOTA: Uma única placa de 96 poços contendo mudas M2 cobrirá 8 linhas individuais M1 (8 M1*12= 96 M2) e poderá ser examinada em 2,5 h e a cada dia 32 linhas M1 seriam rastreadas, 640 M1 plantas por mês. Todo o procedimento de triagem após as plantas estarem prontas levaria cerca de 8 meses. - Identificar mutantes com base na perda ou redução da resposta Ca2+ com H2O2. Resgate os mutantes selecionados através de um processo de lavagem à base de antibióticos. Lave a muda com solução de cefotaxime de 25 mg/L duas vezes e depois transfira para o meio de resgate que contém 25 mg/L cefotaxime em 1/2 MS ágar.
- Plante as placas a um fotoperíodo escuro de 10h/ 14h para obter uma planta mutante. A lavagem do cefotaxime ajuda a remover quaisquer microrganismos prejudiciais na muda. Uma vez que as mudas após a reconstituição são mantidas não seladas, minimize a contaminação ao transferir de volta para condição estéril.
- Transfira a planta mutante para o solo para obter a população homozigosa M3.
3. Análise de dados e identificação de mutantes (1-3 meses)
NOTA: As leituras fornecidas a partir do método acima estão em unidades de luz relativa (RLU).
- Para calcular [Ca2+] concentraçãode cite, use a seguinte equação de concentração20.
pCa = 0,332588 (-log (L/Lmax)) + 5,5593
Contagem de luminescência () e contagem total restante(max). - Converta os valores pCa obtidos para [Ca2+] valoresde cite em μM multiplicando por 106. Em seguida, plote graficamente contra um controle de aequorina (Col-0 transgênico) para identificar mutantes putativos H2O2 para resposta Ca2+.
- Mudas de resgate mostrando uma perda ou redução da resposta ao aplicativo H2O2 resgatado.
- Após o amadurecimento, colhem sementes do mutante resgatado e re-tela para resposta a H2O2 em M3 mudas. Se todas as mudas de 12 M3 apresentarem uma resposta Ca2+ semelhante à planta mãe, considere a população como uma população mutante homozigosa M3. Se todas as 12 mudas não mostrarem tal resposta, então leve-as para a geração M4 e re-tela para obter população homoziga.
- Uma vez que uma linha de plantas homozigos tenha sido obtida, identifique o gene que leva ao fenótipo alterado usando sequenciamento de próxima geração.
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Representative Results
A população ems foi examinada para elevação H2O2 induzida ca2+. Como discutido anteriormente, 12 mudas individuais M2 foram examinadas de cada linha M1. Na Figura 3,uma dessas linhas M1 é traçada com cada painel mostrando 12 mudas individuais M2. Uma aequorina tipo selvagem é usada como controle para comparar e avaliar a resposta mutante. Um mutante recessivo segrega na proporção de 1:7 (mutante: não mutante). Ao selecionar 12 mudas individuais por linha M1, podemos identificar 1 ou 2 mutantes por linha. Identificamos 2 mutantes putativos de 12 M2 mudas(Figura 3). Estes mutantes são ainda levados para M3 e M4 e uma população homozigosa é gerada. O mutante homozigoso é ainda mais mapeado para identificar o gene causal.
Figura 1: EMS mutagenizado Arabidopsis. (A) Para determinar uma mutagênese EMS bem sucedida, procuramos setorizar clorofila na população de plantas mutagenizadas (indicada por seta). Estatisticamente, 0,1 a 1% das plantas M1 devem apresentar setores clorotóticos. (B) O vaso individual das plantas M1 foi feito para realizar uma única coleção de sementes à base de pedigree. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Uma representação esquemática da metodologia da tela genética para a frente. 7500 plantas de Arabidopsis transgênicas que expressam Aequorin citosolic (Aeq) em Col-0 são mutagenizadas com metanosulphonato etílico (EMS) na geração M0. Cerca de 5000 mudas da geração M1 são propagadas individualmente pelo método de pedigree único e propagadas para a geração M2. 12 plantas de cada linha M2 são rastreadas para o fenótipo de interesse (cerca de 3000-3500 M1 linhas). Mutante para o fenótipo de interesse é resgatado e propagado para a geração M3 e exibido para homozigosidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Identificação de mutantes com resposta alterada aotratamento H2O2. Uma figura representativa para retratar a seleção mutante de uma única linha segregadora M1 é mostrada. Os painéis mostram o resultado da triagem (12 mudas M2 segregadas por linha M1 individual) após a estimulação com 10 mM H2O2. O controle WT (Aequorin) (linha verde), em média de todas as 12 M2 mudas é a resposta média (linha vermelha) e A1-X (linha preta) são mudas individuais numeradas de 1-12. Para cada gráfico, o eixo y é ocite [Ca2+] (μM) e o eixo x é o tempo (min). [Ca2+] os níveis de cit foram calculados a partir de unidades de luz relativas (RLUs). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A mutagênese EMS é uma ferramenta poderosa para gerar mutações na população. As telas genéticas avançadas clássicas usando EMS têm sido uma ferramenta eficaz para identificar novos genes por duas razões principais: em primeiro lugar, eles não exigem quaisquer suposições prévias sobre identidade genética e, em segundo lugar, eles não introduzem qualquer viés. Existem vários métodos para gerar uma triagem de populações como EMS, inserções de T-DNA, radiações etc. De todos os métodos, a mutagênese baseada em EMS tem poucas vantagens em relação aos outros métodos. Em primeiro lugar, é mais fácil gerar uma população mutante pela exposição ao EMS, conforme descrito no protocolo atual21,22. Em segundo lugar, pode-se gerar um número suficientemente grande de sementes mutantes, que podem ser usadas para múltiplas telas para um ou mais estímulos. Em terceiro lugar, pode-se identificar um alelo fraco de um gene essencial gerado devido a uma mutação missense. Em quarto lugar, uma série de efeitos da função genética podem ser identificados usando a tela EMS, incluindo perda total de função, perda parcial da função, função alterada e uma função genética constitutiva. Pode ajudar na identificação de mutantes duplos que não são viáveis por outros métodos de mutagênese23,24,25. A única coleção de sementes M1 baseada em pedigree usada neste protocolo também é vantajosa, pois permite que se volte para a população materna para identificar o mesmo mutante novamente, se a descendência for perdida nas gerações futuras subsequentes. Oferece a possibilidade de recuperar mutações que são inférteis quando homozigosas e podem ser recuperadas através dos irmãos heterozigos das plantas mutantes. Em segundo lugar, essa estratégia garante a independência de todos os mutantes isolados quando comparados com o volume de sementes na geração M1. Ele garante que mutações isoladas da coleção M2 são alelos diferentes no mesmo lócus em vez do mesmo evento mutacional26.
Os genes identificados através das telas de mutagênese EMS dependem do fenótipo utilizado para a triagem da população. Quanto mais rápido o fenótipo de interesse pode ser exibido, mais fácil é identificar novos caminhos. Ca2+ é um onipresente mensageiro secundário que está entre as primeiras cascatas de sinalização a serem ativadas. Atua como mediador da resposta vegetal contra uma ampla gama de estímulos bióticos e abióticos. Além disso, a aequorina repórter de cálcio pode ser localizada em vários compartimentos subcelulares e organelas27,,28,,29. Isso abre caminhos para a identificação de papéis de proteína localizada nesses compartimentos na dinâmica de resposta ao cálcio30,31,32.
Telas genéticas avançadas baseadas na EMS-mutagênese em aequorina e usando Ca2+ como leituras têm permanecido contemporâneas desde sua descoberta. As vantagens deste método superaram as armadilhas. No entanto, poucas limitações da técnica ainda precisam ser cuidadosamente avaliadas. A tela é trabalhosa e demorada e requer a identificação de plantas mutantes de uma vasta população mutagenizada. Assim, um planejamento detalhado com base na disponibilidade de recursos, exigência de pessoal de trabalho e restrições espaciais deve ser feito antes de embarcar no plano experimental. O segundo grande desafio com as telas Ca2+ baseadas em aequorin é a possibilidade de falsos positivos sem uma etapa de descarga. Portanto, uma etapa de alta muito curta está incluída no protocolo. Mutações aleatórias também podem levar à geração de plantas estéreis que não podem ser resgatadas devido a múltiplas mutações. Em terceiro lugar, a assinatura do Ca2+ é altamente específica do tecido e a consistência na triagem deve ser garantida4.
Poucas telas genéticas avançadas identificaram receptores, canais, bombas e transportadores de Ca2+ como uso de Ca2+ como um fenótipo de triagem na genética avançada era raro. Estímulos (por exemplo, H2O2) induzidos A elevação de Ca2+ é usada como marcador para uma tela genética avançada em nossa metodologia, para identificar novos componentes genéticos envolvidos no processo. Uma estratégia semelhante usando a população de aequorina mutagenizada em EMS levou à descoberta de muitos receptores como o DORN1, que é o receptor eATP33, o canal de cálcio OSCA34,o receptor LORE envolvido na sensor de lipopólise35 e a ribonuclease PARN136. Um estudo recente publicado por Wu et al. utilizou uma metodologia muito semelhante de triagem de plantas de aequorina mutagenizadas em EMS após a obtenção de H2O2 para identificar o novo sensor de peróxido de hidrogênio HPCA137. Portanto, o protocolo usando mutagênese EMS em fundo de repórter Ca2+ é um método promissor para a descoberta de novos genes envolvidos na detecção de estímulos.
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Disclosures
Nenhum dos autores tem conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Instituto Nacional de Pesquisa de Genomas Vegetais - Instalação Fitotrona pelo crescimento da planta, Bombaim Locale pela filmagem, e pelo Departamento de Biotecnologia- Consórcio ELibrary por fornecer acesso aos recursos eletrônicos. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Biotecnologia da Índia através do Programa de Núcleo de Pesquisa de Genomas Vegetais do Instituto Nacional de Plantas, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group; e CSIR-Junior Research Fellowship (para D.M e S.M) e Departamento de Biotecnologia-Junior Research Fellowship (para R.P).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
