Summary
En fremadrettet genetisk skærm baseret på Ca2 + elevation som en udlæst fører til identifikation af genetiske komponenter involveret i calcium afhængige signalering veje i planter.
Abstract
Fremadrettede genetiske skærme har været vigtige redskaber til objektiv identifikation af genetiske komponenter, der er involveret i flere biologiske veje. Grundlaget for skærmen er at generere en mutant population, der kan screenes med en fænotype af interesse. EMS (ethylmetansulfonat) er et almindeligt anvendt alkyldannemiddel til at fremkalde tilfældig mutation i en klassisk fremadskulds genetisk skærm for at identificere flere gener, der er involveret i en given proces. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation er en vigtig tidlig signalering vej, der aktiveres på stress perception. Men identiteten af receptorer, kanaler, pumper og transportører af Ca2 + er stadig undvigende i mange studiesystemer. Aequorin er en cellulær calcium reporter protein isoleret fra Aequorea victoria og stabilt udtrykt i Arabidopsis. Udnytte dette, vi designet en fremad genetisk skærm, hvor vi EMS-mutagenized aequorin transgene. Frøene fra mutantplanterne blev indsamlet (M1), og screening for den fænotype af interesse blev udført i den adskillende (M2)population. Ved hjælp af en 96-brønds ca2+ måleprotokol med højt gennemløb kan der identificeres flere nye mutanter, som har varierende calciumrespons og måles i realtid. Mutanterne med den interesse fænotype reddes og formeres, indtil der opnås en homozygot mutant plantepopulation. Denne protokol giver en metode til sende genetiske skærme i Ca2 + reporter baggrund og identificere nye Ca2 + regulerede mål.
Introduction
En ændring i cytosolic calcium (Ca2+) koncentration på opfattelsen af biotiske eller abiotiske stimulus er et godt undersøgt tidligt signaleringbegivenhed,der aktiverer mange signalering veje1,2,,3,4. En celle i sin basal hviletilstand opretholder en lavere Ca2+ koncentration i cytosol og sequesters overskydende Ca2+ i forskellige intracellulære organeller og ekstracellulære apoplast, hvilket fører til en stejl Ca2 + gradient5,6. Ved signalopfattelse stiger Ca2+ niveauerne i cytosolen på grund af en tilstrømning af Ca2+ fra ekstracellulære og/eller intracellulære kilder og genererer en stimulispecifik calciumsignatur7,8,9. Ca2 + stigninger i cytosol aktiveres af mange stimuli, men specificitet opretholdes af forskellige butikker frigive Ca2 +, en unik Ca2 + signatur og passende sensor proteiner10,11.
Brugen af alkylatingsmiddel, ethyl-metansulfonat (EMS) til mutagenese er et effektivt værktøj i klassiske fremsende genetiske skærme til at identificere flere uafhængige gener, der er involveret i en proces. EMS er et kemisk mutagen, der overvejende fremkalder C til T og G til A-overgange tilfældigt i hele genomet og producerer en 1 bp-ændring i hver 125 kb af genomet. EMS mutagenesis vil fremkalde ændringer af enkeltbaseparet (enkeltbasepar), enten indsættelse/sletninger (InDel) eller enkelt nukleotidpolymorfi (SNP) pr. genom12. EMS-inducerede mutationer er multiple point mutationer med en mutation frekvens spænder fra 1/300 til 1/30000 pr locus. Dette reducerer antallet af M1 planter er nødvendige for at finde en mutation i et givet gen. En M1 frøpopulationsinterval på 2000-3000 anvendes typisk til at opnå mutationer af interesse i Arabidopsis thaliana13,14.
Aequorin transgenics er Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) økotype planter udtrykker p35S-apoaequorin (pMAQ2) i cytosol15. Aequorin er et Ca2+ bindende protein, der består af apoprotein og en protesegruppe bestående af luciferinmolekyle, coelenterazin. Bindingen af Ca2+ til aequorin, som har tre Ca2+ bindende EF-hænder, resulterer i, at coelenterazin oxideres og cykliseres for at give dioxetanon-mellemproduktet efterfulgt af en konformationel ændring af proteinet ledsaget af frigivelse af kuldioxid og singlet-ophidset coelenteramid16. Den således producerede coelenteramid udsender et blåt lys (λmax, 470 nm), som kan detekteres ved hjælp af luminometeret17. De ekstremt hurtige Ca2 + stigninger kan således måles i realtid, og udnyttes til hurtige fremad genetiske skærme. Denne protokol har til formål at bruge specificiteten af calcium svar til at identificere nye centrale aktører, der er involveret i Ca2 + signatur. For at opnå denne opgave bruger vi EMS mutagenesis i transgene aequorin og identificerer de SNPs, der er forbundet med ændret Ca2+ signalering. Protokollen identificerer mutanter, der viser ingen eller reducerede Ca2+ stigninger ved stimuli tilsætning. Disse mutanter kan derefter kortlægges for at identificere de gener, der er ansvarlige for Ca2+-responset. Metoden gælder for enhver form for flydende stimuli i planter, der resulterer i en Ca2 + højde. Da Ca2 + elevation er en af de første svar i anlægget forsvar signalering vej, identifikation af opstrøms respons komponenter kan give kandidater til genteknologi til at udvikle modstandsdygtige planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EMS mutagenesis og enkelt stamtavle-baserede frø indsamling (1-3 måneder)
- 150 mg frø (~7500) aequorin til EMS-mutagenese (M0 frø). Der vejes yderligere 150 mg frø, der skal anvendes som kontrol.
- Frøene overføres til et 50 ml rør og tilsættes 25 ml 0,2% EMS (v/v) (FORSIGTIG) (til behandling) eller 25 ml autoklaveret vand (til kontrol).
BEMÆRK: Ethyl-metansulfonat er en kemisk agens til mutagenisering af plantemateriale. - Forsegle røret med parafilm og pak det ind i aluminiumsfolie. Rørdets ende-over-end for 18 timer ved stuetemperatur.
- Lad frøene falde til ro. Fjern EMS-opløsningen forsigtigt og kassér den i en affaldsbeholder, der indeholder 1 M NaOH i lige store mængder (NaOH hjælper med at neutralisere/inaktivere EMS, hvilket gør det sikkert at skille sig af med den). Kassér det anvendte plastmateriale i en 1 M NaOH-opløsning.
BEMÆRK: Efter 24 timer bortskaffes udsmid i henhold til laboratoriepraksis for farligt materiale. - De mutageniserede frø vaskes grundigt med 40 ml autoklaveret vand mindst 8 gange. Udsmid EMS indeholdende vand i en NaOH-affaldsbeholder som nævnt ovenfor.
- Til den endelige vask tilsættes 40 ml 100 mm natrium thiosulfat og skylles 3 gange for at fjerne spor af EMS.
- Sættetid frøene i 40 ml autoklaveret vand i ~ 1 time til diffuse EMS ud af frø og derefter placere dem på filterpapir, indtil helt tør.
- Frøene overføres til et mikrocentrifugerør, og frøene stratificeres ved 4 °C i 40 ml autoklaveret vand i 2-4 dage. Dette hjælper med at bryde frø hvile i dvale og sikrer homogen vækst.
- Overfør både de mutageniserede frø (M0) og kontrolfrøene til jorden (jordsammensætning: agropet: soilrite, 1:1) og overfør dem til vækstrum med en 16 timer lys/8 h mørk lysperiode, en lysintensitet på 150 μmol∙m−2∙s−1 og ~70% fugtighed relativ.
- For at afgøre, om mutagenese var en succes, kigge efter nedsat spiring hastighed og kimplante vækst, og klorofylsektorstã ̧ring 18 (Figur 1A). Sammenlign de mutageniserede planter med kontrolplanterne for at identificere disse fysiologiske og udviklingsmæssige forskelle.
BEMÆRK: Forskellige metoder kan anvendes til høst af frø fra M1 planter. I denne protokol har vi brugt den enkelt stamtavle-baserede frø indsamling metode. Hvert M1-anlæg får et unikt nummer, startende fra A1 til A3500. - Bevar individuelt nummererede planter som diskrete plantelinjer (figur 1B).
- Ved modning høstes frø fra disse individuelle mutantplanter, og de opbevares som individuelle M1-linjer (Figur 2). Fra den enkelte stamtavle-baserede frø indsamling, fik vi omkring 5000 M1 linjer, hvoraf 3500 M1 linjer blev screenet.
2. Screening med høj kapacitet for at vælge mutanter (8 måneder)
- Identificer nye mutanter baseret på Ca2+ respons på en udvalgt stimulus. Her brugte vi H2O2 som et eksempel.
- Til identifikation af mutanter skal du screene M2-generationen. Da recessive mutanter adskille ved 1 / 8 frekvens i M2 generation ved EMS mutagenesis14, screening af 8-12 M2-adskillelse planter dækker en M1 linje og identificerer en homozygot recessiv mutant (ved hjælp af 12 planter øger sandsynligheden for at finde en mutant). Fra hver uafhængig M1-linje testes 12 M2 planter for Ca2+ respons på H2O2 (12 M2 planter pr. M1 linje).
- Brug en høj gennemløb frø sterilisation og hydroponiske plante vækst protokol19. Placer næsten 12-15 M2 frø pr M1 linje i individuelle brønde af en 24-brønd vævskultur plade og steriliseres ved hjælp af klor gas (40 ml 12% natriumhypchlorit og saltsyre, 3:1, v / v) i en desiccator for 4 timer i en røghætte. Efter proceduren åbnes eksikatoren, og der efterlades natten over klorgas til at fordampe.
- Efter sterilisation, bringe plader udenfor og tilføje flydende 1/2 MS medier (halv styrke MS uden agar) til de enkelte brønde. Pladerne forsegles med parafilm, og frøene stratificeres i 2-4 dage ved 4 °C, og derefter flyttes frøene til et vækstkammer med 10 h lys/ 14 timer mørk fotoperiode ved 20-22 °C med 70% relativ luftfugtighed.
- Når frøplanterne er 8-12 dage gamle, placeres 12 M2 sætteplante fra hver linje individuelt i en 96-brønds luminometerplade. Til måling af Ca2+ respons på H2O2anvendes en luminometerpladelæser.
- Efter overføring af kimurføring tilsættes 150 μL 5-10 μM coelentrazinopløsning (fortyndet i autoklaveret vand fra et 5 mM-lager i methanol) (CAUTION) i individuelle brønde i et mørkt/svagt lysområde og opbevares i mørke ved 21 °C i 8 timer.
BEMÆRK: Coelentrazin er en protese gruppe, der binder sig til apo-aequorin og rekonstituerer det til funktionelle aequorin. Coelentrazin er lysfølsom og opbevares derfor i mørke farvede flasker, beskyttet mod lys. - Den næste dag, udføre mutant skærm ved hjælp af 10 mM H2O2 som en stimulus og måle den efterfølgende Ca2 + respons.
- Til samtidig måling af 24 brønde skal du oprette et automatiseret kinetisk program, der måler baggrunden i 1 min. efterfulgt af stimulitilsætning (40 μL) og måling i 10 min. efterfulgt af den samlede aequorin udledning (2 M CaCl2 i 150 μL 20% ethanol) i 1-2 min.
BEMÆRK: En slutafladning for det samlede aequorin er nødvendigt for at kvantificere den målte Ca2+ og som ekstra kontrol for funktionel aequorin. Enden udledning er en kort løbetur på 1-2 min og forårsager ikke betydelig plantedød. Alternativt, hvis planterne dør efter udledning trin, derefter re-screene den specifikke M1 linje og redning uden udledning. Sådanne mutanter kan bekræftes i M3 og M4 generationer ved hjælp af udledningstrinnet. - Brug en 24-brønds scanningsmetode, der måler hver række i 7's interval med 300 ms integrationstid pr. brønd pr. målepunkt. Brug en wild-type paropning som kontrol i hver række til sammenligning og evaluering af mutanten.
BEMÆRK: En enkelt 96 godt plade indeholdende M2 planter vil dække 8 individuelle M1 linje (8 M1*12 = 96 M2)og kan screenes i 2,5 h og hver dag 32 M1 linjer ville blive screenet, 640 M1 planter om måneden. Hele screening procedure efter planterne er klar ville tage omkring 8 måneder. - Identificer mutanter baseret på tab af eller reduceret Ca2+ respons med H2O2. Redde de udvalgte mutanter gennem en antibiotikabaseret vaskeproces. Der vaskes 25 mg/l cefotaxime opløsning to gange, hvorefter der overføres til redningsmediet, der indeholder 25 mg/l cefotaxime, i 1/2 MS agar.
- Pladerne vokser med 10 timer i lys/ 14 timer mørk lysperiode for at opnå en mutant plante. Cefotaxime vasken hjælper med at fjerne eventuelle skadelige mikroorganismer på blandingen. Da frøplanter efter rekonstitution holdes un-forseglet, minimere forurening, når overførsel tilbage til steril tilstand.
- Overfør den mutante plante til jord for at opnå homozygot M3-populationen.
3. Dataanalyse og mutant identifikation (1-3 måneder)
BEMÆRK: Aflæsningerne fra ovenstående metode er i relative lysenheder (RLU).
- Til beregning afcytkoncentrationen [Ca2+] skal der anvendes følgende koncentrationsligning20.
pCa = 0,332588(−log (L/Lmax))+ 5,5593
Luminescens tæller () og det samlede antal resterende antal (maks. ). - De opnåede pCa-værdier konverteres til [Ca2+ ]cytværdier i μM ved at gange med 106. Derefter grafisk plot mod en aequorin (transgene Col-0 aequorin) kontrol for at identificere formodede H2O2 mutanter til Ca2 + respons.
- Rescue planter viser et tab af eller reduceret reaktion på H2O2 ansøgning reddet.
- Ved modning høstes frø fra den reddede mutant og screenes igen for at reagere på H2O2 i M3-planter. Hvis alle 12 M3 planter viser en Ca2 + respons svarende til moderplanten, overveje befolkningen at være en homozygot M3 mutant befolkning. Hvis alle 12 planter ikke viser en sådan reaktion, så tag dem til M4 generation og re-screen for at opnå homozygot befolkning.
- Når en homozygote plante linje er opnået, identificere genet fører til ændret fænotype ved hjælp af næste generation sekventering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EMS-populationen blev screenet for H2O2 induceret Ca2+ højde. Som diskuteret tidligere, 12 individuelle M2 planter blev screenet fra hver M1 linje. I figur 3afbildes en sådan M1-linje, hvor hvert panel viser 12 individuelle M2-planter. En vildtype aequorin anvendes som kontrol til sammenligning og evaluering af det mutante respons. En recessiv mutant segregates i forholdet 1:7 (mutant: ikke mutant). Ved screening 12 individuelle planter pr M1 linje, kan vi identificere 1 eller 2 mutanter per linje. Vi har identificeret 2 formodede mutanter fra 12 M2 planter (Figur 3). Disse mutanter er yderligere taget til M3 og M4 og en homozygot population genereres. Homozygotmutet kortlægges yderligere for at identificere kausalgenet.
Figur 1: EMS mutagenized Arabidopsis. (A) For at bestemme en vellykket EMS mutagenese, vi kiggede efter klorofyl sektori mutagenized plantepopulationen (angivet med pil). Statistisk set skal 0,1 til 1% af M1 planter viser klortiske sektorer. (B) Individuel potteplanter af M1-planter blev udført for at udføre en enkelt stamtavlebaseret frøsamling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: En skematisk repræsentation af den fremadrettede genetiske skærmmetode. 7500 transgene Arabidopsis-planter, der udtrykker cytosolisk Aequorin (Aeq) i Col-0, mutageniseres med0 ethylsulfonat (EMS) i M 0-generationen. Omkring 5000 planter fra M1 generation formeres individuelt ved enkelt stamtavle metode og formeret til M2 generation. 12 planter fra hver M2 linje er screenet for fænotype af interesse (ca. 3000-3500 M1 linjer). Mutant for fænotype af interesse er reddet og formeret til M3 generation og screenet for homozygosity. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Identifikation af mutanter med ændret respons på behandling med H2O2. Der vises en repræsentativ figur til at vise mutantvalg fra en enkelt separat M1-linje. Panelerne viser screeningresultatet (12 segregerede M2-planter pr. enkelt M1-linje) ved stimulering med 10 mM H2O2. WT (Aequorin) kontrol (grøn linje), gennemsnit af alle 12 M2 planter er den gennemsnitlige respons (rød linje) og A1-X (sort linje) er individuelle planter nummereret fra 1-12. For hver graf er y-aksen [Ca2+]cyt (μM), og x-aksen er tid (min). [Ca2+] cytniveauer blev beregnet ud fra relative lysenheder ( RLE'er). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EMS mutagenese er et effektivt værktøj til at generere mutationer i befolkningen. De klassiske fremadrettede genetiske skærme ved hjælp af EMS har været et effektivt redskab til at identificere nye gener af to hovedårsager: For det første kræver de ingen forudgående antagelser om genidentitet, og for det andet indfører de ikke nogen bias. Der er flere metoder til at generere en screening befolkninger som EMS, T-DNA indsættelser, stråling osv. Ud af alle de metoder, EMS-baserede mutagenesis har få fordele i forhold til de andre metoder. For det første er det lettere at generere en mutant population ved at blive udsat for EMS som beskrevet i den nuværende protokol21,22. For det andet kan der genereres et tilstrækkeligt stort antal mutantfrøpopulationer, som kan bruges til flere skærme til en eller flere stimuli. For det tredje kan en svag allele af et essentielt gen genereret på grund af en missense mutation identificeres. For det fjerde kan en række genfunktionseffekter identificeres ved hjælp af EMS-skærmen, herunder fuldstændig funktionstab, partielt funktionstab, ændret funktion og en konstituerende genfunktion. Det kan hjælpe med at identificere dobbeltmutanter,som ikke er muligt ved andre mutagenesemetoder23,24,25. Den enkelt stamtavle baseret M1 frø indsamling, der anvendes i denne protokol er også en fordel, da det giver mulighed for at gå tilbage til moderen befolkningen til at identificere den samme mutant igen, hvis afkommet er tabt i de efterfølgende kommende generationer. Det giver mulighed for at inddrive mutationer, der er ufrugtbar, når homozygot og kan inddrives via heterozygot søskende af mutant planter. For det andet garanterer denne strategi uafhængigheden af alle isolerede mutanter i forhold til bulking af frø i M1-generationen. Det sikrer, at mutationer isoleret fra M2-samlingen er forskellige alleler på samme sted i stedet for den samme mutationshændelse26.
De gener, der identificeres gennem EMS-mutageneseskærme, er afhængige af den fænotype, der anvendes til screening af populationen. Jo hurtigere fænotype af interesse kan screenes, jo lettere er at identificere nye veje. Ca2 + er en allestedsnærværende sekundær messenger, der er blandt de første signalering kaskader, der skal aktiveres. Det fungerer som en mægler for plante reaktion mod en bred vifte af biotiske og abiotiske stimuli. Derudover kan calcium reporter aequorin lokaliseres til forskellige subcellulære rum og organeller27,28,29. Dette åbner muligheder for at identificere roller protein lokaliseret i disse rum i calcium respons dynamik30,31,32.
Fremadrettede genetiske skærme baseret på EMS-mutagenesis i aequorin og ved hjælp af Ca2 + som udlæsninger har været moderne siden deres opdagelse. Fordelene ved denne metode har opvejet faldgruberne. Der er dog kun få begrænsninger af teknikken, der stadig skal evalueres nøje. Skærmen er arbejdskraft og tidskrævende og kræver identifikation af mutant planter fra en stor mutagenized befolkning. Derfor skal der foretages en detaljeret planlægning baseret på ressourcetilgængelighed, arbejdspersonalebehov og pladssbegrænsende foranstaltninger, før forsøgsplanen påbegyndes. Den anden store udfordring med aequorin-baserede Ca2 + skærme er muligheden for falske positiver uden en udledning trin. Derfor er protokollen et meget kort dechargeskridt medtaget. Tilfældige mutationer kan også føre til generering af sterile planter, der ikke kan reddes på grund af flere mutationer. For det tredje er Ca2+ signaturen meget vævsspecifik, og der skal sikres konsekvens iscreeningen 4.
Ikke mange frem genetiske skærme har identificeret receptorer, kanaler, pumper og transportører af Ca2 + som brug af Ca2 + som en screening fænotype i fremad genetik var sjælden. Stimuli (f.eks H2O2)induceret Ca2 + elevation bruges som markør for en fremadrettet genetisk skærm i vores metode, at identificere nye genetiske komponenter, der er involveret i processen. En lignende strategi ved hjælp af EMS mutagenized aequorin befolkning har ført til opdagelsen af mange receptorer som DORN1, som er eATP receptor33, calcium kanal OSCA34, LORE receptor involveret i lipopolysaccharid sensing35 og ribonuclease PARN136. En nylig undersøgelse offentliggjort af Wu et al. har brugt en meget lignende metode til screening EMS-mutagenized aequorin planter på H2O2 elicitation at identificere den nye brintoverilte sensor HPCA137. Derfor protokollen ved hjælp af EMS mutagenese i Ca2 + reporter baggrund er en lovende metode til nye genopdagelse involveret i stimuli sensing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har nogen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi takker National Institute of Plant Genome Research - Phytotron Facility for plantevækst, Bombay Locale for videooptagelse, og Institut for Bioteknologi-eLibrary Consortium for at give adgang til e-ressourcer. Dette arbejde blev støttet af Institut for Bioteknologi, Indien gennem National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-Indien Partner Group program; og CSIR-Junior Research Fellowship (til D.M. og S.M) og Institut for Bioteknologi-Junior Forskningsstipendium (til R.P).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
