Summary
Ein vorwärtsgerichteter genetischer Screen, der auf der Ca2+-Höhe als Auslese basiert, führt zur Identifizierung genetischer Komponenten, die an kalziumabhängigen Signalwegen in Pflanzen beteiligt sind.
Abstract
Vorwärtsgenetische Screens waren wichtige Werkzeuge bei der unvoreingenommenen Identifizierung genetischer Komponenten, die an mehreren biologischen Pfaden beteiligt sind. Die Grundlage des Bildschirms ist es, eine mutierte Population zu erzeugen, die mit einem Phänotyp von Interesse gescreent werden kann. EMS (Ethylmethansulfonat) ist ein häufig verwendetes Alkylierungsmittel zur Induktion zufälliger Mutation in einem klassischen Vorwärts-Genbild, um mehrere Gene zu identifizieren, die an einem bestimmten Prozess beteiligt sind. Zytosololische Kalzium (Ca2+) Höhe ist ein wichtiger früher Signalweg, der bei der Stresswahrnehmung aktiviert wird. Die Identität von Rezeptoren, Kanälen, Pumpen und Transportern von Ca2+ ist jedoch in vielen Studiensystemen noch immer schwer fassbar. Aequorin ist ein zelluläres Kalziumreporter-Protein, das aus Aequorea victoria isoliert und stabil in Arabidopsis exprimiert wird. Unter Ausnutzung dieser, haben wir einen vorwärts genetischen Bildschirm entworfen, in dem wir EMS-mutagenisiert die Aequorin transgen. Die Samen der mutierten Pflanzen wurden gesammelt (M1) und screening für den Phänotyp von Interesse wurde in der Segrekung (M2) Population durchgeführt. Mit einem 96-Well-High-Throughput Ca2+ Messprotokoll können mehrere neuartige Mutanten identifiziert werden, die eine unterschiedliche Kalziumantwort haben und in Echtzeit gemessen werden. Die Mutanten mit dem Phänotyp von Interesse werden gerettet und vermehrt, bis eine homozygote mutierte Pflanzenpopulation gewonnen wird. Dieses Protokoll bietet eine Methode für vorwärtsgerichtete genetische Bildschirme im Ca2+-Reporterhintergrund und identifiziert neuartige Ca2+ regulierte Ziele.
Introduction
Eine Veränderung der zytosolischen Kalziumkonzentration (Ca2+)bei wahrnehmungsgemäßem biotischem oder abiotischem Reiz ist ein gut untersuchtes frühentwickeltes Signalereignis, das viele Signalwege1,2,3,4aktiviert. Eine Zelle in ihrem basalen Ruhezustand behält eine niedrigere Ca2+-Konzentration im Cytosol und Sequester-Überschuss Ca2+ in verschiedenen intrazellulären Organellen und extrazellulären Apoplasten bei, was zu einem steilen Ca2+ Gradienten5,6führt. Bei der Signalwahrnehmung steigen ca2+-Spiegel im Cytosol aufgrund eines Zustroms von Ca2+ aus extrazellulären und/oder intrazellulären Quellen und erzeugen eine Reize spezifische Calciumsignatur7,8,9. Ca2+ Höhen im Cytosol werden durch viele Reize aktiviert, aber spezifität wird durch verschiedene Speicher, die Ca2+,eine einzigartige Ca2+ Signatur und geeignete Sensorproteine10,11.
Die Verwendung von Alkylierungsmittel, Ethylmethansulfonat (EMS) für die Mutagenese, ist ein leistungsfähiges Werkzeug in klassischen vorwärtsgenetischen Bildschirmen, um mehrere unabhängige Gene zu identifizieren, die an einem Prozess beteiligt sind. EMS ist ein chemisches Mutagen, das hauptsächlich C bis T und G zu A überführt, nach dem Zufallsprinzip im gesamten Genom übergeht und eine Veränderung von 1 bp in jedem 125 kb des Genoms erzeugt. Die EMS-Mutagenese induziert 1000 Einzelbasispaaränderungen, entweder Insertion/Deletionen (InDel) oder Single Nukleotide Polymorphism (SNP) pro Genom12. EMS-induzierte Mutationen sind mehrfache Punktmutationen mit einer Mutationshäufigkeit von 1/300 bis 1/30000 pro Ort. Dies reduziert die1 Anzahl der M 1-Pflanzen, die benötigt werden, um eine Mutation in einem bestimmten Gen zu finden. Ein M 1-Saatgut-Bevölkerungsbereich von 2000-3000 wird in der Regel verwendet, um Mutationen von Interesse in Arabidopsis thaliana13,14zu erhalten.1
Aequorin-Transgenen sind Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) Ökotyp-Pflanzen, die p35S-Apoaequorin (pMAQ2) im Cytosol15exdrücken. Aequorin ist2+ ein Ca 2+-Bindungsprotein, das aus Apoprotein und einer prothetischen Gruppe besteht, die aus Luziferinmolekül Coelenterazin besteht. Die Bindung von Ca2+ an Aequorin, das drei Ca2+ bindende EF-Hands-Standorte hat, führt dazu, dass Coelenterazin oxidiert und gecyclt wird, um das Dioxetanon-Zwischenprodukt zu erhalten, gefolgt von einer konformen Veränderung des Proteins, begleitet von der Freisetzung von Kohlendioxid und Singlet-erregtem Coelenteramid16. Das so erzeugte Coelenteramid strahlt einmaxblaues Licht aus, das durch das Leuchtkraftmesser17erfasst werden kann. Die extrem schnellen Ca2+ Höhen können so in Echtzeit gemessen und für schnelle vorwärts gerichtete genetische Abschirmungen genutzt werden. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Spezifität der Kalzium-Antwort zu nutzen, um neue Schlüsselakteure zu identifizieren, die an der Ca2+-Signatur beteiligt sind. Um diese Aufgabe zu erfüllen, verwenden wir EMS-Mutagenese in transgenem Aequorin und identifizieren die SNPs, die mit veränderter Ca2+-Signalisierung verbunden sind. Das Protokoll identifiziert Mutanten, die keine oder reduzierte Ca2+-Höhen bei Anuleaddition aufweisen. Diese Mutanten können dann kartiert werden, um die Gene zu identifizieren, die für die Ca2+-Antwort verantwortlich sind. Die Methode ist auf jede Art von flüssigen Reizen in Pflanzen anwendbar, die zu einer Ca2+ Höhe führt. Da ca2+ Höhe eine der ersten Reaktionen in der Pflanzenabwehr Signalweg ist, kann die Identifizierung von vorgelagerten Reaktionskomponenten Kandidaten für die Gentechnik liefern, um widerstandsfähige Pflanzen zu entwickeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EMS-Mutagenese und Einzelstammbaum-basierte Saatgutsammlung (1-3 Monate)
- Wiegen Sie 150 mg Samen (7500) Aequorin für EMS-Mutagenese (M0 Samen). Wiegen Sie weitere 150 mg Samen als Kontrolle verwendet werden.
- Die Samen in ein 50 ml-Rohr geben und 25 ml 0,2% EMS (v/v) (VORSICHT) (zur Behandlung) oder 25 ml autoklaviertes Wasser (zur Kontrolle) hinzufügen.
HINWEIS: Ethylmethansulfonat ist ein chemisches Mittel zur Erbeinung von Pflanzenmaterial. - Versiegeln Sie das Rohr mit Parafilm und wickeln Sie es in Aluminiumfolie. Drehen Sie das Rohr Ende-über-Ende für 18 h bei Raumtemperatur.
- Lassen Sie die Samen absetzen. Entfernen Sie die EMS-Lösung sorgfältig und entsorgen Sie sie in einem Abfallbehälter mit 1 M NaOH in gleichen Mengen (NaOH hilft, EMS zu neutralisieren/inaktivieren, damit es sicher entsorgt werden kann). Entsorgen Sie die gebrauchten Kunststoffe in einer 1 M NaOH-Lösung.
HINWEIS: Entsorgen Sie die Rückwürfe nach 24 h gemäß den Laborverfahren für gefährlicheS Material. - Waschen Sie die mutagenisierten Samen mindestens 8 Mal mit 40 ml autoklavierten Wassers gründlich. Entsorgen Sie EMS, das Wasser in einem NaOH-Abfallbehälter enthält, wie oben erwähnt.
- Für die Endwäsche 40 ml 100 ml Natriumthiosulfat hinzufügen und 3 Mal ausspülen, um Emsspuren zu entfernen.
- Die Samen in 40 ml autoklaviertem Wasser für 1 h einweichen, um EMS aus den Samen zu diffundieren, und legen Sie sie dann auf Filterpapier, bis sie vollständig trocken sind.
- Die Samen in ein Mikrozentrifugenrohr geben und die Samen bei 4 °C in 40 ml autoklaviertem Wasser für 2-4 Tage schichten. Dies hilft bei der Bruch samenRuhe und sorgt für homogenes Wachstum.
- Übertragen Sie sowohl die mutagenisierten Samen (M0) als auch die Kontrollsamen auf den Boden (Bodenzusammensetzung: Agropet: Bodenrit, 1:1) und übertragen Sie sie in Wachstumsräume mit einer 16 h hellen/8 h dunklen Photoperiode, einer Lichtintensität von 150 molm, 2s1 und 70% relative Luftfeuchtigkeit.
- Um festzustellen, ob die Mutagenese erfolgreich war, achten Sie auf eine reduzierte Keimgeschwindigkeit und das Kornlingswachstum und die Chlorophyll-Sektorierung18 (Abbildung 1A). Vergleichen Sie die mutagenisierten Pflanzen mit den Kontrollpflanzen, um diese physiologischen und Entwicklungsunterschiede zu identifizieren.
HINWEIS: Für die Ernte von Samen aus M1-Pflanzen können verschiedene Methoden verwendet werden. In diesem Protokoll haben wir die Single-Stammbaum-basierte Saatgutsammlungsmethode verwendet. Jede M1-Anlage erhält eine eindeutige Nummer, beginnend von A1 bis A3500. - Bewahren Sie einzeln nummerierte Pflanzen als diskrete Anlagenlinien auf (Abbildung 1B).
- Nach der Reifung Samen aus diesen einzelnen mutierten Pflanzen ernten und als einzelne M1-Linien lagern (Abbildung 2). Aus der einzelnen Stammbaum-basierten Saatgutsammlung erhielten wir rund 5000 M1 Linien, von denen 3500 M1 Linien abgeschirmt wurden.
2. Hochdurchsatz-Screening zur Auswahl von Mutanten (8 Monate)
- Identifizieren Sie neue Mutanten basierend auf der Ca2+-Antwort auf einen ausgewählten Stimulus. Hier haben wir H2O2 als Beispiel verwendet.
- Zur Identifizierung von Mutanten wird die M2-Generation überprüft. Da sich rezessive Mutanten bei 1/8-Frequenz in der Generation M2 nach EMS-Mutagenese14trennen, deckt das Screening von 8-12 M2-Segrederpflanzen eine2M1-Linie ab und identifiziert einen homozygoten rezessiven Mutanten (mit 12 Sämlingen erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, einen Mutanten zu finden). Testen Sie von jeder unabhängigen M1-Linie 12 M2 Sämlinge auf Ca2+-Antwort auf H2O2 (12 M2 Sämlinge pro M1 Linie).
- Verwenden Sie eine hochdurchsatzhohe Samensterilisation und hydroponisches Pflanzenwachstumsprotokoll19. Fast 12-15 M2 Samen pro M1 Linie in einzelne Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte legen und mit Chlorgas (40 ml 12% Natriumhypochlorit und Salzsäure, 3:1, v/v) in einem Trockenhaus für 4 h in einer Dunstabzugshaube sterilisieren. Öffnen Sie nach dem Eingriff den Trockenbau und lassen Sie ihn über Nacht, damit Chlorgas verdunstet.
- Nach der Sterilisation Platten nach draußen bringen und flüssige 1/2 MS-Medien (halbfeste MS ohne Agar) in einzelne Brunnen geben. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm und schichten Sie die Samen für 2-4 Tage bei 4 °C und bewegen Sie dann Dies in eine Wachstumskammer mit 10 h Licht / 14 h dunkle Photoperiode bei 20-22 °C mit 70% relativer Luftfeuchtigkeit.
- Sobald die Sämlinge 8-12 Tage alt sind, legen Sie 12 M2 Sämlinge aus jeder Linie einzeln in eine 96-Well-Leuchtkraftplatte. Verwenden Sie zur Messung des Ca2+-Ansprechs auf H2O2einen Luminometer-Plattenleser.
- Nach der Setzlingsübertragung 150 l 5-10 M Coelentrazin-Lösung (in autoklaviertem Wasser aus einem 5 mM-Bestand in Methanol verdünnt) (VORSICHT) in einzelne Brunnen in einem dunklen/schwachlichten Bereich geben und bei 21 °C 8 h im Dunkeln lagern.
HINWEIS: Coelentrazin ist eine prothetische Gruppe, die an Apo-Aequorin bindet und es zu funktionellem Aequorin umbildet. Coelentrazin ist lichtempfindlich und wird daher in dunkel gefärbten Flaschen gelagert, die vor Licht geschützt sind. - Führen Sie am nächsten Tag einen mutierten Bildschirm mit 10 mM H2O2 als Stimulus aus und messen Sie die anschließende Ca2+-Antwort.
- Für die gleichzeitige Messung von 24 Bohrwerten können Sie ein automatisiertes kinetisches Programm erstellen, das den Hintergrund für 1 min misst, gefolgt von Reizzugabe (40 l) und Messung für 10 min, gefolgt von einer Gesamtaquorinentladung (2 M CaCl2 in 150 l 20% Ethanol) für 1-2 min.
ANMERKUNG: Zur Quantifizierung des gemessenen Ca2+ und als zusätzliche Kontrolle für funktionelles Aequorin ist eine Endentladung für das gesamte Aequorin erforderlich. Die Endentladung ist eine kurze Laufzeit von 1-2 min und verursacht keinen signifikanten Pflanzentod. Alternativ können die Pflanzen nach dem Entladungsschritt absterben, dann die spezifische M1-Leitung erneut abschirmen und ohne Entladung retten. Solche Mutanten können in M3- und M4-Generationen mit dem Entladungsschritt bestätigt werden. - Verwenden Sie eine Scanmethode im 24-Well-Format, die jede Zeile im 7-s-Intervall mit 300 ms Integrationszeit pro Messpunkt misst. Verwenden Sie einen Wildtyp sämungsmittel als Steuerelement in jeder Zeile für den Vergleich und die Auswertung der Mutante.
HINWEIS: Eine einzelne 96-Well-Platte mit M2 Sämlingen deckt 8 einzelne M1-Linie (8 M1*12= 96 M2) ab und kann in 2,5 h gesiebt werden und jeden Tag würden 32 M1 Linien gesiebt, 640 M1 Pflanzen pro Monat. Das gesamte Screening-Verfahren, nachdem die Pflanzen fertig sind, würde etwa 8 Monate dauern. - Identifizieren Sie Mutanten basierend auf dem Verlust oder reduzierten Ca2+ Antwort mit H2O2. Retten Sie die ausgewählten Mutanten durch einen antibiotischen Waschprozess. Waschen Sie den Sämling mit 25 mg/L Cefotaxame Lösung zweimal und dann auf Rettungsmedium übertragen, das 25 mg/L Cefotaxme in 1/2 MS Agar enthält.
- Wachsen Sie die Platten bei einem 10 h Licht / 14 h dunkle Photoperiode, um eine mutierte Pflanze zu erhalten. Die Cefotaxame-Waschanlage hilft, schädliche Mikroorganismen am Sämling zu entfernen. Da die Sämlinge nach der Rekonstitution unversiegelt gehalten werden, minimieren Sie die Kontamination, wenn sie wieder in einen sterilen Zustand zurückversetzt werden.
- Übertragen Sie die mutierte Pflanze auf den Boden, um die homozygote M3-Population zu erhalten.
3. Datenanalyse und Mutantenidentifikation (1-3 Monate)
HINWEIS: Die Messwerte der obigen Methode sind in relativen Lichteinheiten (RLU) angegeben.
- Für die Berechnung der [Ca2+]Zytkonzentration verwenden Sie die folgende Konzentrationsgleichung20.
pCa = 0,332588(-log (L/Lmax))+ 5,5593
Lumineszenzzählungen () und gesamtzahlshaltig (max ). - Konvertieren Sie die erhaltenen pCa-Werte in [Ca2+]Cyt-Werte in M, indem Sie mit 106multiplizieren. Dann grafisch gegen eine Aequorin (transgene Col-0 aequorin) Steuerung zur Identifizierung vonvermeintlichenH 2 O2 Mutanten auf Ca2+ Antwort.
- Rettungssämlinge, die einen Verlust oder eine reduzierte Reaktion auf H2O2 Anwendung gerettet zeigen.
- Nach der Reifung Samen von der geretteten Mutante ernten und auf H2O2 in M3 Sämlinge reagieren. Wenn alle 12 M3 Sämlinge eine Ca2+-Antwort aufweisen, die der Mutterpflanze ähnelt, betrachten Sie die Population als eine homozygote M3-mutierte Population. Wenn alle 12 Sämlinge nicht eine solche Antwort zeigen, dann nehmen Sie sie zu M4 Generation und re-screen, um homozygote Bevölkerung zu erhalten.
- Sobald eine homozygote Pflanzenlinie erhalten wurde, identifizieren Sie das Gen, das zu einem veränderten Phänotyp führt, indem Sie die Nächste Generation sequenzieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die EMS-Population wurde auf H2O2 induzierte Ca2+ Höhe untersucht. Wie bereits erwähnt, wurden aus jeder M1-Linie 12 einzelne M2 Sämlinge gescreent. In Abbildung 3wird eine solche M1-Linie mit jedem Panel dargestellt, das 12 einzelne M2 Sämlinge zeigt. Ein Wildtyp-Aequorin wird als Steuerung für den Vergleich und die Bewertung der mutierten Reaktion verwendet. Eine rezessive Mutante trennt sich im Verhältnis 1:7 (Mutant: nicht mutiert). Beim Screening von 12 einzelnen Sämlingen pro M1 Linie können wir 1 oder 2 Mutanten pro Linie identifizieren. Wir haben 2 vermeintliche Mutanten von 12 M2 Sämlingen identifiziert (Abbildung 3). Diese Mutanten werden weiter auf M3 und M4 gebracht und eine homozygote Population erzeugt. Der homozygote Mutant wird weiter kartiert, um das kausale Gen zu identifizieren.
Abbildung 1: EMS mutagenisierte Arabidopsis. (A) Um eine erfolgreiche EMS-Mutagenese zu bestimmen, suchten wir nach Chlorophyll-Sektor in der mutagenisierten Pflanzenpopulation (durch Pfeil angezeigt). Statistisch gesehen müssen 0,1 bis 1 % der M1-Anlagen chlorotische Sektoren aufweisen. (B) Für die Durchführung einer einzigen Stammbaum-basierten Saatgutsammlung wurde eine individuelle Vergussung von M1-Pflanzen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Eine schematische Darstellung der Vorwärts-Genetik-Screen-Methodik. 7500 transgene Arabidopsis-Pflanzen, die in Col-0 zytosolisches Aequorin (Aeq) exexzigen, werden in der Generation M0 mit Ethylmethansulfonat (EMS) erdimiert. Rund 5000 Sämlinge der Generation M1 werden einzeln nach einem Stammbaum propagiert und zur Generation M2 vermehrt. 12 Pflanzen aus jeder M2-Linie werden auf den Phänotyp von Interesse gesiekt (ca. 3000-3500 M1 Linien). Mutant für den Phänotyp von Interesse wird gerettet und auf die M3-Generation propagiert und auf Homozygosität gescreent. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Identifizierung von Mutanten mit verändertem Ansprechverhalten auf die BehandlungvonH2O2. O Es wird eine repräsentative Abbildung zur Darstellung der mutierten Auswahl aus einer einzelnen Segregierenden Linie M1 dargestellt. Die Panels zeigen das Screening-Ergebnis (12 Segregieren M2 Sämlinge pro einzelfachem M1-Linie) bei Stimulation mit 10 mM H2O2. WT (Aequorin) Steuerung (grüne Linie), Durchschnitt aller 12 M2 Sämlinge ist die mittlere Antwort (rote Linie) und A1-X (schwarze Linie) sind einzelne Sämlinge nummeriert von 1-12. Für jedes Diagramm ist die y-Achse die [Ca2+]cyt (M) und die x-Achse ist Zeit (min). [Ca2+] Cyt-Werte wurden aus relativen Lichteinheiten (RLUs) berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EMS-Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Mutationen in der Population zu erzeugen. Die klassischen Vorwärts-Gen-Screens, die EMS verwenden, waren aus zwei Hauptgründen ein wirksames Instrument, um neuartige Gene zu identifizieren: Erstens erfordern sie keine vorherigen Annahmen über die Genidentität, und zweitens führen sie keine Verzerrung ein. Es gibt mehrere Methoden, um ein Screening-Populationen wie EMS, T-DNA-Einfügungen, Strahlungen usw. zu erzeugen. Von allen Methoden hat die EMS-basierte Mutagenese nur wenige Vorteile gegenüber den anderen Methoden. Erstens ist es einfacher, eine mutierte Population durch Ems-Exposition zu erzeugen, wie im aktuellen Protokoll21,22beschrieben. Zweitens kann eine ausreichend große Anzahl mutierter Samen erzeugt werden, die für mehrere Bildschirme für einen oder mehrere Reize verwendet werden kann. Drittens kann ein schwaches Allel eines essentiellen Gens identifiziert werden, das aufgrund einer Fehlsinne-Mutation erzeugt wurde. Viertens kann eine Reihe von Genfunktionseffekten mithilfe des EMS-Bildschirms identifiziert werden, einschließlich vollständiger Funktionsverlust, partieller Funktionsverlust, veränderter Funktion und einer konstitutiven Genfunktion. Es kann bei der Identifizierung von Doppelmutanten helfen, die durch andere Mutagenese-Methoden nicht möglich ist23,24,25. Die in diesem Protokoll1 verwendete Einzelne Stammbaum-basierte M 1-Saatgutsammlung ist ebenfalls von Vorteil, da sie es ermöglicht, zur Mutterpopulation zurückzukehren, um dieselbe Mutante wieder zu identifizieren, wenn die Nachkommenschaft in den nachfolgenden zukünftigen Generationen verloren geht. Es bietet die Möglichkeit, Mutationen zu erholen, die unfruchtbar sind, wenn homozygot und über die heterozygoten Geschwister der mutierten Pflanzen zurückgewonnen werden können. Zweitens garantiert diese Strategie die Unabhängigkeit aller Mutanten, die im Vergleich zur Massenmenge von Saatgut in der Generation M1 isoliert sind. Es stellt sicher, dass Mutationen, die aus der M2-Sammlung isoliert sind, unterschiedliche Allele am selben Ort und nicht am gleichen Mutationsereignis26sind.
Die durch EMS-Mutagenese-Screens identifizierten Gene sind abhängig von dem Phänotyp, der zum Screening der Population verwendet wird. Je schneller der Phänotyp des Interesses abgeschirmt werden kann, desto einfacher ist es, neue Wege zu identifizieren. Ca2+ ist ein allgegenwärtiger sekundärer Messenger, der zu den ersten Signalkaskaden gehört, die aktiviert werden. Es fungiert als Vermittler für die Reaktion der Pflanzen gegen eine breite Palette von biotischen und abiotischen Reizen. Zusätzlich kann der Calciumreporter Aequorin in verschiedene subzelluläre Kompartimente und Organellen27,28,29lokalisiert werden. Dies eröffnet Möglichkeiten zur Identifizierung von Rollen von Protein in diesen Fächern in Kalzium-Antwort-Dynamik30,31,32lokalisiert.
Vorwärtsgenetische Screens auf der Grundlage von EMS-Mutagenese in Aequorin und verwendung ca2+ als Auslesungen sind seit ihrer Entdeckung zeitgemäß geblieben. Die Vorteile dieser Methode haben die Fallstricke überwiegen. Allerdings müssen nur noch wenige Einschränkungen der Technik sorgfältig bewertet werden. Der Bildschirm ist arbeits- und zeitintensiv und erfordert die Identifizierung mutierter Pflanzen aus einer riesigen mutagenisierten Population. Daher muss vor Beginn des Versuchsplans eine detaillierte Planung auf der Grundlage der Ressourcenverfügbarkeit, des Personalbedarfs und der Platzbeschränkungen durchgeführt werden. Die zweite große Herausforderung mit den Aequorin-basierten Ca2+ Bildschirmen ist die Möglichkeit von Fehlalarmen ohne Entlastungsschritt. Daher ist ein sehr kurzer Entlastungsschritt im Protokoll enthalten. Zufällige Mutationen können auch zur Erzeugung steriler Pflanzen führen, die aufgrund mehrerer Mutationen nicht gerettet werden können. Drittens ist die Ca2+-Signatur sehr gewebespezifisch, und die Konsistenz des Screenings muss sichergestellt werden4.
Nicht viele vorwärts gerichtete genetische Screens haben Rezeptoren, Kanäle, Pumpen und Transporter von Ca2+ identifiziert, da die Verwendung von Ca2+ als Screening-Phänotyp in der Vorwärtsgenetik selten war. Stimuli (z.B. H2O2) induzierte Ca2+ Höhe wird als Marker für einen vorwärts genetischen Bildschirm in unserer Methodik verwendet, um neue genetische Komponenten in den Prozess involviert zu identifizieren. Eine ähnliche Strategie mit EMS mutagenisierte Aequorin Population hat zur Entdeckung von vielen Rezeptoren wie DORN1, die eATP-Rezeptor33, Calciumkanal OSCA34, LORE-Rezeptor in Lipopolysaccharid-Erkennung35 und die Ribonuklease PARN136beteiligt geführt. Eine kürzlich von Wu et al. veröffentlichte Studie hat eine sehr ähnliche Methode des Screenings von EMS-mutagenisierten Aequorin-Pflanzen nachH2O2-Entlösung verwendet, um den neuartigen Wasserstoffperoxidsensor HPCA137zu identifizieren. Daher ist das Protokoll mit EMS-Mutagenese im Ca2+-Reporterhintergrund eine vielversprechende Methode zur neuartigen Genentdeckung, die an der Reizerkennung beteiligt ist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Wir danken dem National Institute of Plant Genome Research - Phytotron Facility for plant growth, Bombay Locale für das Videoshooting und dem Department of Biotechnology- eLibrary Consortium für den Zugang zu E-Ressourcen. Diese Arbeit wurde vom Department of Biotechnology, Indien durch das National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max-Planck Gesellschaft-India Partner Group-Programm, unterstützt; und CSIR-Junior Research Fellowship (zu D.M und S.M) und Department of Biotechnology-Junior Research Fellowship (zu R.P).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
