המסך הגנטי הקדמי באמצעות כתבת סידן טרנסגניים Aequorin כדי לזהות יעדים הרומן איתות סידן

Summary

המסך הגנטי הקדמי מבוסס על Ca^{2 +} העלאת כקריאה החוצה מוביל זיהוי של רכיבים גנטיים מעורבים התלויים סידן מסלולים איתות בצמחים.

Abstract

מסכים גנטיים הקדמי היו כלים חשובים בזיהוי משוחדת של רכיבים גנטיים המעורבים מסלולים ביולוגיים מספר. הבסיס של המסך הוא ליצור אוכלוסיית מוטציה שניתן להקרין באמצעות פנוטיפ של עניין. EMS (אתיל מתאן סולולאט) הוא סוכן al, המשמש בדרך כלל לגרימת מוטציה אקראית במסך הקלאסי קדימה גנטי כדי לזהות גנים מרובים המעורבים בכל תהליך נתון. סידן ציטוסולג (Ca^{2 +}) העלאת הוא מפתח מוקדם איתות במסלול המופעל על תפיסת המתח. עם זאת, הזהות של קולטני, ערוצים, משאבות ומובילים של Ca^{2 +} הוא עדיין חמקמק במערכות לימוד רבות. Aequorin הוא חלבון כתבת הסידן התאי מבודד מ aequorin ויקטוריה ובאופן מאוד מבוטא באריידאופזיס. אנו מנצלים את המצב הגנטי הקדמי. בו אנו מוטגנים את הטרנסאוגניים הזרעים של צמחי מוטציה נאספו (M₁) והקרנה עבור הפנוטיפ של עניין נעשה בפנקסי (m₂) אוכלוסיה. באמצעות פרוטוקול Ca^{2 +} מדידה של 96-היטב, מוטציות הרומן מספר ניתן לזהות כי יש תגובת סידן משתנה והם נמדדים בזמן אמת. המוטציות עם הפנוטיפ של עניין חולצו והופץ עד homozygous מוטציה האוכלוסייה הצמח מתקבל. פרוטוקול זה מספק שיטה עבור מסכים גנטיים מתקדמים ברקע של Ca^{2 +} עיתונאי ולזהות הרומן ca^{2 +} מוסדר מטרות.

Introduction

שינוי בסידן ציטוסולג (Ca^{2 +}) הריכוז על תפיסת של גירוי ביוטי או אביוטיים הוא אירוע מוקדם ללמוד איתות המפעיל הרבה^{1מסלולים איתות 1,2,3,4}. תא במצב מנוחה בסיס שלו שומר על הנמוך ca^{2 +} ריכוז ב ציטוזול ו-העודפים ca^{2 +} ב אורגאואותאים שונים מוליך המוביל האחרון של ca תלולה^{2 +} הדרגתי^5,6. עם תפיסת האות, Ca^{2 +} רמות עלייה ציטוסול בשל זרם של ca^{2 +} מתוך החילוץ ו/או מקורות תאיים וליצור גירוי מסוים סידן חתימה^7,8,9. Ca^{2 +} הגבהים ב ציטוסול מופעלים על ידי גירויים רבים, אבל הייחוד מתוחזק על ידי חנויות נפרדות שחרור Ca^{2 +}, Ca ייחודי^{2 +} חתימה המתאים חלבונים חיישן^10,11.

השימוש בסוכן אלקיטינג, אתיל-מתאן סולולאט (EMS) עבור מוטאוסיס הוא כלי רב עוצמה במסכים הגנטיים הקלאסיים הקדמיים כדי לזהות גנים עצמאיים מרובים המעורבים בתהליך. EMS הוא מוטגנים כימיים בעיקר גרימת C ל T ו-G כדי מעברים באופן אקראי ברחבי הגנום ומייצרת 1 שינוי bp ב כל 125 kb של הגנום. EMS מוטארסיס יהיה לגרום ≈ 1000 משני זוגות בסיס יחיד שינויים, ההכנסה/מחיקות (InDel) או בודד פולימורפיזם (SNP) לכל גנום¹². מוטציות בהשפעת EMS הן מוטציות בנקודות מרובות עם תדר מוטציה הנע בין 1/300 ל 1/30000 לוקוס. זה מפחית את מספר M₁ צמחים הדרושים כדי למצוא מוטציה בגן נתון. טווח של אוכלוסיית M₁ הזרע של 2000-3000 משמש בדרך כלל כדי להשיג מוטציות של עניין ב arabidopsis thaliana^13,14.

Aequorin transgenics הם Arabidopsis קולומביה-0 (Col-0) צמחים אקולוגיים המבטא p35S-apoaequorin (pMAQ2) ב ציטוסול¹⁵. Aequorin הוא חלבון Ca^{2 +} מאגד המורכב האפופרוטאין וקבוצה תותבת המורכבת של מולקולה לוציב, קומרכאזין. הכריכה של Ca^{2 +} כדי aequorin, אשר יש שלוש Ca^{2 +} מאגד הידיים האתרים, התוצאות בתוך מחזוריות החיידקים והמחזוריות כדי לתת את dioxetanone ביניים, ואחריו שינוי מאוד של החלבון מלווה על ידי שחרורו של פחמן דו חמצני ו זינגתן-נרגש קוקונב¹⁶. Coelenteramide כל כך המיוצר פולט אור כחול (λ_max, 470 nm) כי ניתן לזהות על ידי לומימטר¹⁷. מהיר ביותר Ca² הגבהים יכולים ובכך להיות נמדד בזמן אמת, ומנוצלת מהירה קדימה מסכי גנטיות. פרוטוקול זה נועד להשתמש בספציפיות של תגובת הסידן כדי לזהות נגני מפתח חדשניים המעורבים בחתימת Ca^{2 +} . כדי להשיג משימה זו, אנו משתמשים במוטזיס EMS בתוך הטרנסגניים aequorin ומזהים את ה-SNPs המשויך ל-Ca^{2 +} איתות שהשתנה. הפרוטוקול מזהה מוטציות שאינן מראות או מופחת Ca^{2 +} הגבהים על תוספת הגירוי. לאחר מכן ניתן למפות מוטציות אלה כדי לזהות את הגנים האחראים על Ca^{2 +} תגובה. השיטה ישימה לכל סוג של גירוי נוזלי בצמחים שתוצאתו Ca^{2 +} העלאה. מאז Ca^{2 +} העלאה היא אחת התגובות הראשונות במסלול ההגנה הצמח איתות, זיהוי של רכיבי תגובה במעלה הזרם יכול לספק מועמדים הנדסה גנטית לפתח צמחים גמישים.

Protocol

1. מוטזיס EMS ואוסף זרעים יחיד המבוסס על אילן יוחסין (1-3 חודשים)

1. שוקל 150 מ ג של זרעים (~ 7500) של aequorin עבור מוטארסיס EMS (M₀ זרעים). שוקלים עוד 150 מ ג של זרעים לשמש כפקד.
2. להעביר את הזרעים לצינור 50 mL ולהוסיף 25 מ ל 0.2% EMS (v/v) (התראה) (לטיפול) או 25 מ ל של מים אוטומטיים (עבור שליטה).
   הערה: אתיל-מתאן סולולאט הוא סוכן כימי לחומרים צמחיים מוטוניים.
3. אטום את הצינור עם parafilm ולעטוף אותו רדיד אלומיניום. סובב את הצינור קצה-מעל-קצה עבור 18 h בטמפרטורת החדר.
4. . הניחו לזרעים להתיישב הסר את הפתרון EMS בקפידה ולהשליך במיכל פסולת המכילה 1 M NaOH בנפחים שווים (NaOH מסייע לנטרל/inactivate EMS מה שהופך אותו בטוח להשליך). התעלם מכלי הפלסטיק המשמשים בפתרון של 1 מ-NaOH.
   הערה: לאחר 24 שעות, להיפטר ממחיקה על פי נוהלי מעבדה חומרים מסוכנים.
5. שטוף את זרעי המוטמושים ביסודיות עם 40 מ ל של מים אוטוקלבים לפחות 8 פעמים. התעלם מהאמס המכיל מים במיכל פסולת NaOH כפי שהוזכר לעיל.
6. עבור השטיפה הסופית, להוסיף 40 mL של 100 mM הנתרן תיוסולפט ולשטוף 3 פעמים כדי להסיר עקבות של EMS.
7. להשרות את הזרעים ב 40 mL של מים אוטוקלשים עבור ~ 1 h כדי לפזר EMS מתוך הזרעים ולאחר מכן למקם אותם על נייר סינון עד יבש לחלוטין.
8. העבירו את הזרעים לצינור מיקרוצנטריפוגה, ומעבירים את הזרעים ב -4 ° c ב-40 mL של מים אוטוקלבים במשך 2-4 ימים. זה עוזר לשבור את הזרעים הזרע ומבטיח צמיחה הומוגנית.
9. העברת הן את זרעי המוטטזים (M₀) ואת הזרעים לשלוט על הקרקע (הרכב הקרקע: אגרופט: soilrite, 1:1) ולהעביר אותם חדרי צמיחה עם 16 h אור/8 h photoperiod כהה, עוצמת אור של 150^{μ:∙ M 2}∙ s-¹ ו ~ 70% לחות יחסית.
10. כדי לקבוע אם מוטגנזה הצליחה, חפש מהירות נביטה מופחתת צמיחה שתיל, ו כלורופיל sectoring¹⁸ (איור 1a). השוו את הצמחים המוטוטניים למפעלי הבקרה כדי לזהות את ההבדלים הפיסיולוגיים וההתפתחותיים.
    הערה: ניתן להשתמש בשיטות שונות לקצירת זרעים מצמחי M₁ . בפרוטוקול זה, השתמשנו בשיטת איסוף הזרעים המבוססת על אילן יוחסין אחת. כל מפעל M₁ מוענק מספר ייחודי, החל A1 ל A3500.
11. שמור על צמחים ממוספרים בנפרד כקווי צמחים נפרדים (איור 1B).
12. עם התבגרות, הקציר זרעים מן הצמחים האלה בודדים מוטציה ולאחסן כמו M₁ קווים (איור 2). מן האוסף המבוסס על אילן יוחסין אחד, הגענו סביב 5000 M₁ שורות מתוך אשר 3500 M₁ קווים הוקרן.

2. הקרנת תפוקה גבוהה כדי לבחור מוטציות (8 חודשים)

1. לזהות מוטציות הרומן מבוסס על Ca^{2 +} תגובה לגירוי שנבחר. . הנה, השתמשנו ב_-2או₂ כדוגמה
2. לזיהוי מוטציות, להקרין את הדור M₂ . מאז המוטנטים_{הרצתיים} ביניהם בשנת 1/8 תדירות ב-M 2 דור על מוטזיס EMS¹⁴, הקרנה של 8-12 m₂-פנקסי צמחים מכסה אחד מ₁ קו ומזהה מוטציה homozygous רצסיבי (באמצעות 12 שתילים מגביר את ההסתברות של מציאת מוטציה). מכל קו₁ עצמאי, לבדוק 12 m₂ שתילים עבור Ca^{2 +} תגובה H₂O₂ (12 m₂ שתילים לכל שורה₁ ).
3. השתמש בתפוקה גבוהה של זרע סירוס ועיקור ידרופוני צמח פרוטוקול¹⁹. מקום כמעט 12-15 M₂ זרעים לכל M₁ קו בארות בודדות של לוח 24-היטב של הרקמה התרבותית ולעקר באמצעות גז כלור (40 mL של 12% נתרן רדמה ו חומצה הידרוכלורית, 3:1, v/v) ב desiccator עבור 4 h ב מכסה המנוע. לאחר ההליך, לפתוח את הdesiccator ולהשאיר לילה על הגז כלור להתאדות.
4. לאחר עיקור, להביא צלחות החוצה ולהוסיף נוזלי 1/2 MS מדיה (למחצה כוח MS ללא אגר) בארות בודדות. חותם את הצלחות עם parafilm ו stratify את הזרעים עבור 2-4 ימים ב 4 ° צ' ולאחר מכן להעביר זרעים לחדר גידול עם 10 h אור/14 h photoperiod כהה ב 20-22 ° צ' עם 70% לחות יחסית.
5. לאחר השתילים הם 8-12 ימים, מקום 12 M₂ שתילים מכל שורה בנפרד בלוח 96-ולומימטר. למדידת Ca 2⁺ תגובה H₂O₂, השתמש בקורא צלחת לומילומטר.
6. לאחר העברת שתיל, להוסיף 150 μL של 5-10 μM הפתרון האוטומטי (מדולל במים אוטוקלשים מ 5 מ"מ מלאי ב מתנול) (זהירות) בבארות בודדים באזור כהה/נמוך אור לאחסן בחושך ב 21 ° c עבור 8 h.
   הערה: קומנטראטין היא קבוצה תותבת הקושרת אל איי-אאקוורין ומהווה אותה מחדש ל-aequorin תפקודית. קונטראטין הוא רגיש באור ולכן מאוחסן בבקבוקים בצבע כהה, מוגן מפני אור.
7. למחרת, לבצע מסך מוטציה באמצעות 10 מ"מ H₂O₂ הגירוי ולמדוד Ca^{2 +} תגובה הבאים.
8. עבור מדידה בו של 24 בארות, ליצור תוכנית קינטית אוטומטית המודד את הרקע עבור 1 דקות, ואחריו תוספת גירויים (40 μL) ומדידה עבור 10 דקות, ואחריו פריקה הכולל aequorin (2 M CaCl₂ ב 150 μl 20% אתנול) עבור 1-2 דקות.
   הערה: הפריקה הסופית עבור aequorin סה כ נדרש כדי לכמת את Ca נמדד^{2 +} וכתוספת בקרת aequorin פונקציונלי. הפריקה הסופית היא ריצה קצרה של 1-2 דקות ואינו גורם מוות צמחי משמעותי. לחילופין, אם הצמחים למות לאחר הפריקה צעד, ואז לחדש את המסך הספציפי₁ קו והצלה ללא השחרור. מוטציות כאלה ניתן אישר ב M₃ ו-m₄ הדורות באמצעות צעד פריקה.
9. השתמש בשיטת סריקה בתבנית 24 שעות המודד כל שורה במרווח של 7 עם 300 ms זמן האינטגרציה לכל נקודת מדידה. השתמש שתיל מסוג פראי כמו שליטה בכל שורה להשוואה והערכה של המוטציות.
   הערה: יחידה 96 הבאר המכילה M₂ שתילים יכסה 8 הפרט m₁ קו (8 M₁* 12 = 96 M₂) ניתן לוקרן ב 2.5 h ו כל יום 32 M₁ קווים יהיה מוקרן, 640 m₁ צמחים לחודש. כל תהליך ההקרנה לאחר הצמחים מוכנים ייקח בערך 8 חודשים.
10. זיהוי מוטציות מבוסס על אובדן או מופחת Ca^{2 +} תגובה עם H₂O₂. להציל את המוטציות שנבחרו באמצעות תהליך כביסה המבוסס על אנטיביוטיקה. לשטוף את שתיל עם 25 מ"ג/L cefo, פתרון פעמיים ולאחר מכן להעביר לאמצעי הצלה המכיל 25 מ"ג/L cefoסעה בשנת 1/2 MS אגר.
11. לגדל את לוחיות באור 10 h/14 h photoperiod כהה כדי להשיג צמח מוטציה. שטיפת הצ מסייעת להסרת כל מיקרו אורגניזמים מזיקים על שתיל. מאז שתילים לאחר החוקה נשמרים בלתי אטום, למזער זיהום כאשר מועבר חזרה למצב סטרילי.
12. להעביר את המפעל מוטציה קרקע להשגת homozygous M₃ אוכלוסיה.

3. ניתוח נתונים וזיהוי מוטציה (1-3 חודשים)

הערה: הקריאות שסופקו מהשיטה הנ ל הן יחידות אור יחסיות (RLU).

1. לחישוב [Ca^{2 +}] הריכוז_cyt , השתמש במשוואה הריכוז הבאה²⁰.
   pCa = 0.332588 (למטה-יומן (L/L_max) + 5.5593
   ספירות לומינסנציה () וספירות שנותרו (_{מקסימום}).
2. המר את ערכי ה-pCa שהתקבלו ל [Ca^{2 +}] ערכי_cyt ב-μm על-ידי הכפלה ב-10⁶. לאחר מכן להתוות באופן גרפי נגד aequorin (הטרנסגניים Col-0 aequorin) בקרה לזיהוי הבנה H₂O₂ מוטציות כדי Ca^{2 +} תגובה.
3. שתילי הצלה מראה אובדן או מופחת התגובה H₂O₂ יישום שחולצו.
4. עם התבגרות, הקציר זרעים מן המוטציות שחולצו והמסך מחדש עבור תגובה H₂O₂ ב M₃ שתילים. אם כל 12 M₃ שתילים להראות Ca^{2 +} תגובה דומה לצמח האם, לשקול את האוכלוסיה להיות homozygous M₃ מוטציה אוכלוסיה. אם כל 12 שתילים לא מראים תגובה כזאת, לאחר מכן לקחת אותם כדי₄ הדור והמסך מחדש כדי להשיג homozygous אוכלוסיה.
5. לאחר קו צמח homozygous הושג, לזהות את הגן המוביל שונה פנוטיפ באמצעות רצף הדור הבא.

Representative Results

אוכלוסיית EMS הוקרן עבור H₂O₂ המושרה Ca^{2 +} העלאת. כפי שהוזכר קודם לכן, 12 שתילים בודדים מ₂ הוקרן מכל קו M₁ . באיור 3, אחד כזה שורה M₁ מותווים עם כל פאנל המציג 12 בודדים M₂ שתילים. Aequorin מסוג פראי משמש כשליטה להשוואת והערכת תגובת המוטציות. ביחס של 1:7 (חשבונאי: לא מוטציה). כאשר ההקרנה 12 שתילים בודדים לשורה M₁ , אנחנו יכולים לזהות 1 או 2 מוטציות בכל שורה. זיהינו 2 מוטציות בפוטוטיבית מ 12 M₂ שתילים (איור 3). מוטציות אלה נלקחים לפני M₃ ו-m₄ ו homozygous אוכלוסיה נוצרת. המוטציה homozygous ממופה עוד יותר כדי לזהות את הגן סיבתי.

איור 1: EMS מוטנואידיזיס. (א) כדי לקבוע מוטזיס EMS מוצלח, חיפשנו כלורופיל sectoring באוכלוסיית הצמח מוטחזים (המצוין על ידי החץ). מבחינה סטטיסטית, 0.1 ל 1% של צמחים₁ מ חייב להציג סקטורים chlorotic. (ב) השתילה בודדים של M₁ צמחים נעשה כדי לבצע אוסף זרע יחיד מבוסס יוחסין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ייצוג סכמטי של מתודולוגיית המסך הגנטי הקדמי. 7500 התפלת צמחים Arabidopsis המבטא ציטוסולורין Aequorin (Aeq) ב-Col-0 הם מוטחזים עם אתיל מתיונין (EMS) בדור M₀ . סביב 5000 שתילים מדור₁ מופצים בנפרד על ידי שיטת אילן יחיד והופץ לדור m₂ . 12 צמחים מכל קו M₂ מוקרנים עבור פנוטיפ של עניין (סביב 3000-3500 M₁ קווים). מוטציה עבור הפנוטיפ של עניין הוא חולץ והופץ לדור M₃ והוקרן על ההומוזיסיטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: זיהוי של מוטציות עם תגובה שונה H₂O₂ טיפול. דמות ייצוגית המייצגת בחירת מוטציה משורת פנקסי₁ אחת מוצגת. הלוחות להראות את תוצאת ההקרנה (12 פנקסי M₂ שתילים לכל היחידה m₁ קו) על גירוי עם 10 מ"מ H₂O₂. WT (Aequorin) שליטה (קו ירוק), ממוצע של כל 12 M₂ שתילים היא התגובה הממוצע (הקו האדום) ו-A1-X (קו שחור) הם שתילים בודדים ממוספרים מ 1-12. עבור כל גרף, ציר ה-y הוא [Ca^{2 +}]_cyt (μm) וציר ה-x הוא הזמן (דקות). [Ca^{2 +}] רמות _cyt חושבו מיחידות אור יחסית (rlus). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מוטגנזה EMS היא כלי רב עוצמה להפקת מוטציות באוכלוסיה. המסכים הקלאסי קדימה הגנטי באמצעות EMS כבר כלי יעיל כדי לזהות גנים הרומן שתי סיבות עיקריות: ראשית, הם לא דורשים כל הנחות מראש על זהות גנטית ושנית, הם לא מציגים כל הטיה. ישנן מספר שיטות ליצירת אוכלוסיות הקרנה כמו EMS, T-DNA הוספות, רדיוציות וכו '. מתוך כל השיטות, מוטזיס המבוסס על EMS מספר יתרונות בשיטות אחרות. ראשית, קל יותר ליצור אוכלוסיית מוטציה באמצעות חשיפה ל-EMS כפי שמתואר בפרוטוקול הנוכחי^21,22. שנית, ניתן ליצור מספר גדול מספיק של אוכלוסיית מוטציות, שניתן להשתמש בה למסכים מרובים עבור גירוי אחד או יותר. שלישית, אלל חלש של גן חיוני שנוצר עקב מוטציה missense ניתן לזהות. רביעית, מערך של אפקטים של פונקציה גנטית ניתן לזהות באמצעות המסך EMS כולל אובדן מוחלט של פונקציה, אובדן פונקציה חלקית, פונקציה שונה ופונקציית גן מחוקה. זה יכול לעזור בזיהוי של מוטציות כפולות שאינו אפשרי על ידי שיטות מוטגנזה אחרות^23,24,25. מבוסס על אילן יוחסין אחד המבוסס₁ זרע בשימוש בפרוטוקול זה הוא גם יתרון כפי שהוא מאפשר אחד לחזור לאוכלוסיית האם כדי לזהות את אותו מוטציה שוב, אם צאצאי הוא איבד בדורות הבאים בעתיד. הוא מציע את האפשרות לשחזור מוטציות כי הם עקרים כאשר homozygous וניתן לשחזר דרך אחים heterozygous של צמחים מוטציה. שנית, אסטרטגיה זו מבטיחה את עצמאותה של כל המוטציות מבודדים בהשוואה bulking של זרעים בדור M₁ . זה מבטיח כי המוטציות מבודדים מהאוסף M₂ הם האללים שונים באותו מקום ולא באותו אירוע מוקצב²⁶.

הגנים המזוהים באמצעות מסכי מוטזיס EMS תלויים בפנוטיפים המשמשים לסינון האוכלוסיה. מהר יותר את הפנוטיפ של עניין ניתן לוקרן, קל יותר הוא לזהות את המסלולים החדשניים. Ca^{2 +} הוא שליח משני בכל מקום כי הוא בין איתות ראשון מפלי להיות מופעל. היא פועלת כמגשר על תגובת צמחים כנגד מגוון רחב של גירויים ביוטיים ובין-אבאטים. בנוסף, כתבת הסידן aequorin יכולה להיות מקומית לתאים תת-סלולריים שונים ואורגלים^27,28,29. זה פותח שדרות לזיהוי תפקידים של חלבון מקומי בתאים אלה בתגובה סידן דינמיקה^30,31,32.

המסכים הגנטיים הקדמיים המבוססים על EMS-מוטאוסיס ב-aequorin ושימוש ב-Ca^{2 +} כפי שהקריאות נותרו עכשוויות מאז גילויו. היתרונות של שיטה זו יש לעבור על החסרונות. עם זאת, מספר מגבלות של הטכניקה עדיין צריך להיות מוערך בקפידה. המסך הוא עבודה ואינטנסיבית בזמן ודורש זיהוי של צמחי מוטציה מאוכלוסיה מוטעת נרחבת. מכאן, תכנון מפורט המבוסס על זמינות המשאבים, הדרישה של עובדי העבודה ומגביל החלל חייבים להתבצע לפני היציאה לתוכנית הניסיונית. האתגר העיקרי השני עם Ca מבוססי aequorin^{2 +} מסכי היא אפשרות של תוצאות חיוביות שווא ללא צעד השחרור. מכאן שלב השחרור קצר מאוד כלול בפרוטוקול. מוטציות אקראיות יכול גם להוביל לדור של צמחים סטרילי כי לא ניתן להינצל בשל מוטציות מרובות. שלישית, Ca^{2 +} חתימה היא מאוד ספציפית רקמות ספציפיות ועקביות בהקרנה חייב להיות מובטחת⁴.

לא הרבה מסכי הגנטי הקדמי זיהו קולטנים, ערוצים, משאבות ומובילים של Ca^{2 +} כשימוש ca^{2 +} כמו פניטיפ ההקרנה גנטיקה קדימה היה נדיר. גירויים (למשל, H₂O₂) המושרה Ca^{2 +} העלאה משמש סמן עבור המסך הגנטי הקדמי במתודולוגיה שלנו, כדי לזהות רכיבים גנטיים חדשים המעורבים בתהליך. אסטרטגיה דומה באמצעות EMS מוטורין האוכלוסייה aequorin הובילה לגילוי של קולטנים רבים כמו DORN1 שהוא קולטן אטליז³³, ערוץ הסידן osca³⁴, קולטן התורה מעורב ליפופוליד חישה³⁵ ו ריבונוקלאז PARN1³⁶. מחקר האחרונות שפורסם על ידי וו et al. השתמש מתודולוגיה דומה מאוד של ההקרנה EMS מוטאוןצמחים aequorin על H₂O₂ מעורר כדי לזהות את הרומן מימן חמצן חיישן HPCA1³⁷. מכאן הפרוטוקול באמצעות מוטגנזה EMS ב-Ca^{2 +} רקע עיתונאי הוא שיטה מבטיחה גילוי גנטי הרומן מעורב גירויים חישה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well tissue culture plate	Jetbiofil	11024	for growing seedlings
96 well white cliniplate	Thermo Scientific	9502887	for luminometer measurements
Aequorin
Agropet	Lab Chem India		for plant growth
Calcium chloride	Fisher Scientific	12135	for discharge solution
Coelenterazine	PJK	55779-48-1	prosthetic group for aequorin
Ehtylmethane sulfonate	Sigma Aldrich	M0880-5G	for seed mutagenesis
Ethanol	Analytical reagent	1170	for discharge solution
Hydrochloric acid	Merck Life Sciences	1.93001.0521	sterlization solution
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	15465	as stimulus for Calcium elevation
Luminoskan ascent	Thermo Scientific	5300172	aequorin luminescence measurement
MES buffer	Himedia	RM1128-100G	plant growth
Murashige and skoog media	Himedia	PT021-25L	plant growth
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	27805	for neutralizing EMS
Sodium hypochlorite	Merck Life Sciences	1.93607.5021	sterlization solution
Sodium thiosulfate	Fisher Scientific	28005	for seed washing in step 1.6
soilrite	Lab Chem India		for plant growth
Square pots	Lab Chem India		for plant growth
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389	plant growth
Taxim	Alkem	7180720	for seedling rescue