Summary
Uno screening genetico in avanti basato sull'elevazione di Ca2 o più come lettura porta all'identificazione dei componenti genetici coinvolti nei percorsi di segnalazione dipendenti dal calcio nelle piante.
Abstract
Gli screening genetici in avanti sono stati strumenti importanti nell'identificazione imparziale dei componenti genetici coinvolti in diversi percorsi biologici. La base dello schermo è quello di generare una popolazione mutante che può essere vagliata con un fenotipo di interesse. L'EMS (ethyl eilfonato di metano) è un agente alchilante comunemente usato per indurre mutazioni casuali in uno screening genetico classico in avanti per identificare più geni coinvolti in un dato processo. L'elevazione del calcio citosolico (Ca2)è una via di segnalazione precoce chiave che si attiva sulla percezione dello stress. Tuttavia, l'identità di recettori, canali, pompe e trasportatori di Ca2 è ancora sfuggente in molti sistemi di studio. Aequorin è una proteina reporter di calcio cellulare isolata da Aequorea victoria e stabilmente espressa in Arabidopsis. Sfruttando questo, abbiamo progettato uno schermo genetico in avanti in cui abbiamo EMS-mutagenizzato l'aequorin transgenico. I semi delle piante mutanti sono stati raccolti (M1)e lo screening per il fenotipo di interesse è stato effettuato nella popolazione segregazione (M2). Utilizzando un protocollo di misurazione Ca2o, con 96 pozzedi ad alto rendimento, è possibile identificare diversi nuovi mutanti che hanno una risposta di calcio variabile e vengono misurati in tempo reale. I mutanti con il fenotipo di interesse vengono salvati e propagati fino a ottenere una popolazione di piante mutanti omozice. Questo protocollo fornisce un metodo per gli schermi genetici in avanti in secondo piano per i giornalisti ca2 e per identificare i nuovi obiettivi regolamentati ca2.
Introduction
Un cambiamento nella concentrazione di calcio citosolico (Ca2)dopo la percezione dello stimolo biotico o abiotico è un evento di segnalazione precoce ben studiato che attiva molte vie di segnalazione1,2,3,4.4 Una cellula nel suo stato di riposo basale mantiene una minore concentrazione di Ca2 o nel citosol e sequestri in eccesso Ca2 , in vari organelli intracellulari e apoplasta extracellulare che porta ad un ripido Ca2o gradiente5,6. Dopo la percezione del segnale, i livelli di Ca2 s in n nel citosol a causa di un afflusso di Ca2 o da fonti extracellulari e/o intracellulari e generano una firma di calcio specifica di stimoli7,8,9.9 Le elevazioni Ca2 nel citosol sono attivate da molti stimoli, ma la specificità è mantenuta da negozi distinti che rilasciano Ca2 ,firma unica Ca2 e proteine del sensore appropriate10,11.
L'uso di agente alchilante, il solfato di metano etilico (EMS) per la mutagenesi è un potente strumento negli schermi genetici classici in avanti per identificare più geni indipendenti coinvolti in un processo. L'eMS è un mutageno chimico che induce prevalentemente transizioni da C a T e da G ad A in modo casuale in tutto il genoma e produce un cambiamento di 1 bp ogni 125 kb del genoma. La mutagenesi EMS indurrà cambiamenti nella coppia di base singola di 1000 dollari, ovvero inserimenti/delezioni (InDel) o polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) per genoma12. Le mutazioni indotte da EMS sono mutazioni multiple puntiformi con una frequenza di mutazione che va da 1/300 a 1/30000 per locus. Questo riduce il numero di piante M1 necessarie per trovare una mutazione in un dato gene. Un aumento della popolazione di semi M1 di 2000-3000 è tipicamente utilizzato per ottenere mutazioni di interesse in Arabidopsis thaliana13,14.
Aequorin transgenics sono Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) piante di ecotipo che esprimono p35S-apoaequorin (pMAQ2) nel citosol15. Aequorin è una proteina legante Ca2 e un gruppo protesico composto da molecola di luciferina, coelenterazina. Il legame di Ca2o all'aequorina, che ha tre siti di mani di EF leganti Ca2, si traduce in ossidazione e celio eccitato singlet16. La coelenteramide così prodotta emette una luce blu (zmax, 470 nm) che può essere rilevata dal luminometro17. Le elevazioni estremamente veloci svolte Ca 2 opiù possono quindi essere misurate in tempo reale e sfruttate per schermi genetici rapidi in avanti. Questo protocollo ha lo scopo di utilizzare la specificità della risposta al calcio per identificare i nuovi attori chiave che sono coinvolti nella firma di Ca2. Per raggiungere questo compito, utilizziamo la mutagenesi EMS nell'equorina transgenica e identifichiamo gli SNP associati alla segnalazione di Ca2. Il protocollo identifica i mutanti che non mostrano o riducono le elevazioni di Ca 2 o l'aggiuntadi stimoli. Questi mutanti possono quindi essere mappati per identificare i geni responsabili della risposta ca2. Il metodo è applicabile a qualsiasi tipo di stimoli liquidi nelle piante che si traduce in un'elevazione Ca2. Dal momento che l'elevazione di Ca2 è una delle prime risposte nel percorso di segnalazione della difesa delle piante, l'identificazione dei componenti di risposta a monte può fornire candidati per l'ingegneria genetica per sviluppare piante resilienti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mutagenesi ems e raccolta di semi a base di un singolo albero genealogico (1-3 mesi)
- Pesare 150 mg di semi (7500 dollari) di aequorina per la mutagenesi EMS (M0 semi). Pesare altri 150 mg di semi da utilizzare come controllo.
- Trasferire i semi in un tubo da 50 mL e aggiungere 25 mL di 0,2% EMS (v/v) (CAUTION) (per il trattamento) o 25 mL di acqua autoclaved (per il controllo).
NOTA: il solfonato di metano etilico è un agente chimico per la mutagenizzazione del materiale vegetale. - Sigillare il tubo con parafilm e avvolgerlo in un foglio di alluminio. Ruotare l'estremità finale del tubo per 18 h a temperatura ambiente.
- Lasciare che i semi si depositino. Rimuovere con attenzione la soluzione EMS e scartare in un contenitore di rifiuti contenente 1 M NaOH in eguali (NaOH aiuta a neutralizzare/inattivare EMS rendendolo sicuro da scartare). Eliminare il materiale plastico usato in una soluzione NaOH da 1 M.
NOTA: Dopo 24 ore, smaltire gli scarti secondo le pratiche di laboratorio di materiali pericolosi. - Lavare accuratamente i semi mutageni con 40 mL di acqua autoclave almeno 8 volte. Eliminare eMS contenente acqua in un contenitore di rifiuti NaOH come accennato in precedenza.
- Per il lavaggio finale, aggiungere 40 mL di 100 mM di sodio tiosulfato e risciacquare 3 volte per rimuovere le tracce di EMS.
- Immergere i semi in 40 mL di acqua autoclave per 1 h per diffondere EMS dai semi e poi metterli su carta da filtro fino a completa asciugatura.
- Trasferire i semi in un tubo di microcentrifuga e stratificare i semi a 4 gradi centigradi in 40 mL di acqua autoclata per 2-4 giorni. Questo aiuta a rompere la doglienza dei semi e assicura una crescita omogenea.
- Trasferire i semi mutageniti (M0) e i semi di controllo sul suolo (composizione del suolo: agropet: soilrite, 1:1) e trasferirli in ambienti di crescita con un fotoperiodo scuro di 16 h/8 h, un'intensità di luce di 150 mol∙m−22 ∙ss. 1 e 70% di umidità relativa.
- Per determinare se la mutagenesi abbia avuto successo, cercare una riduzione della velocità di germinazione e della crescita delle piantine e della clorofilla18 (Figura 1A). Confrontare le piante mutagenizzate con gli impianti di controllo per identificare queste differenze fisiologiche e di sviluppo.
NOTA: Metodi diversi possono essere utilizzati per la raccolta di semi da piante M1. In questo protocollo, abbiamo usato il metodo di raccolta dei semi basato su un singolo pedigree. A ogni impianto M1 viene assegnato un numero univoco, a partire da A1 a A3500. - Mantenere gli impianti numerati singolarmente come linee di impianti discreti (Figura 1B).
- Alla maturazione, raccogliere semi da queste singole piante mutanti e conservare come singole linee M1 (Figura 2). Dalla collezione di semi a base di pedigree singolo, abbiamo ottenuto circa 5000 M1 linee di cui 3500 M1 linee sono state sottoposte a screening.
2. Screening ad alto contenuto di velocità effettiva per selezionare i mutanti (8 mesi)
- Identifica nuovi mutanti in base alla risposta di Ca2 a uno stimolo selezionato. Qui, abbiamo usato H2O2 come esempio.
- Per identificare i mutanti, vagliare la generazione M2. Dal momento che i mutanti recessivi si segregano a 1/8 frequenza nella generazione di M2 sulla mutagenesi EMS14, lo screening di piante a 8-12 M2-segregazione copre una linea M1 e identifica un mutante omozio recessivo (l'uso di 12 piantine aumenta la probabilità di trovare un mutante). Da ogni linea M1 indipendente, prova 12 M2 piantine per la risposta Ca2 a H2O2 (12 M2 piantine per linea M1).
- Utilizzare una sterilizzazione dei semi ad alta produttività e un protocollo di crescita delle piante idroponica19. Mettere quasi 12-15 M2 semi per M1 linea in singoli pozzi di una piastra di coltura dei tessuti 24-pozzi e sterilizzare utilizzando gas cloro (40 mL di 12% di ipoclorito di sodio e acido cloridrico, 3:1, v / v) in un desiccatore per 4 h in un cofano di fumi. Dopo la procedura, aprire il desiccatore e lasciare evaporare per una notte il gas cloro.
- Dopo la sterilizzazione, portare le piastre all'esterno e aggiungere i supporti liquidi 1/2 MS (mezza resistenza MS senza agar) ai singoli pozzi. Sigillare le piastre con il parafilm e stratificare i semi per 2-4 giorni a 4 gradi centigradi, quindi spostare i semi in una camera di crescita con 10 h luce / 14 h fotoperiodo scuro a 20-22 gradi centigradi con 70% di umidità relativa.
- Una volta che le piantine sono 8-12 giorni, mettere 12 M2 piantina da ogni linea singolarmente in una piastra di luminometro 96-well. Per misurare la risposta ca2 a H2O2, utilizzare un lettore di piastra per luminometro.
- Dopo il trasferimento delle piantine, aggiungere 150 gradi l di 5-10 M soluzione di coelentrazina (diluito in acqua autoclaved da uno stock di 5 mM in metanolo) (CAUTION) in singoli pozzi in una zona scura / bassa luce e conservare in scuro a 21 gradi C per 8 h.
NOTA: Coelentrazine è un gruppo protesico che si lega all'apo-aequorin e lo ricostituisce all'aequorin funzionale. La Coelentrazine è sensibile alla luce e viene quindi conservata in bottiglie di colore scuro, protette dalla luce. - Il giorno successivo, eseguire schermo mutante utilizzando 10 mM H2O2 come stimolo e misurare la successiva risposta Ca2.
- Per la misurazione simultanea di 24 pozzi, creare un programma cinetico automatizzato che misura lo sfondo per 1 min, seguito da aggiunta di stimoli (40 gradi) e misura per 10 min, seguita da una scarica totale di arin (2 M di scarico di rina (2 M Dirin2 in 150 - L 20% etanolo) per 1-2 min.
NOTA: È necessario uno scarico finale per l'aequorin totale per quantificare la Misurata Ca2 e come controllo aggiuntivo per l'equore funzionale. Lo scarico finale è un breve periodo di 1-2 min e non causa la morte significativa delle piante. In alternativa, se le piante muoiono dopo la fase di scarico, ri-schermare la linea M1 specifica e salvare senza scarico. Tali mutanti possono essere confermati in M3 e M4 generazioni utilizzando la fase di scarico. - Utilizzare un metodo di scansione formato a 24 pozzetti che misura ogni riga in intervallo di 7 s con 300 ms tempo di integrazione per pozzo per punto di misurazione. Utilizzare una piantina di tipo selvaggio come controllo in ogni riga per il confronto e la valutazione del mutante.
NOTA: Una singola piastra 96 contiene le piantine M2 coprirà 8 singole linee M1 (8 M1, 12 , 96 M2) e può essere esaminata in 2,5 h e ogni giorno verrebbero sottoposte a screening 32 M1 linee, 640 M1 piante al mese. L'intera procedura di screening dopo la preparazione degli impianti richiederebbe circa 8 mesi. - Identificare i mutanti in base alla perdita o alla ridotta risposta di Ca2 o con H2O2. Salva i mutanti selezionati attraverso un processo di lavaggio a base di antibiotici. Lavare la piantità con soluzione di 25 mg/L cefotaxime due volte e poi trasferire a mezzo di soccorso che contiene 25 mg/L cefotaxime in 1/2 agar MS.
- Far crescere le placche a un fotoperiodo scuro 10 h luce/ 14 h per ottenere una pianta mutante. Il lavaggio cefotaxime aiuta a rimuovere eventuali microrganismi nocivi sulla piantina. Poiché le piantine dopo la ricostituzione sono tenute non sigillate, ridurre al minimo la contaminazione durante il trasferimento in condizioni sterili.
- Trasferire la pianta mutante sul suolo per ottenere la popolazione omozice M3.
3. Analisi dei dati e identificazione dei mutanti (1-3 mesi)
NOTA: le letture fornite dal metodo di cui sopra sono in unità di luce relativa (RLU).
- Per calcolare la concentrazione dicit [Ca2], utilizzare la seguente equazione di concentrazione20.
pCa : 0,332588(-log (L/Lmax))
Conteggio luminescenza () e conteggio rimanenti totali (max). - Convertire i valori pCa ottenuti in [Ca2]cyt values in srl moltiplicando per 106. Quindi traccia graficamente contro un controllo di aequorin (transgenico Col-0 aequorin) per identificare i putativi H2O2 mutanti alla risposta di Ca2.
- Piantine di salvataggio che mostrano una perdita di o ridotta risposta all'applicazione H2O2 salvata.
- Dopo la maturazione, raccogliere i semi dal mutante salvato e ri-screen per la risposta a H2O2 in M3 piantine. Se tutte le piantine da 12 M3 mostrano una risposta Ca 2 opiù simile alla pianta madre, considerare la popolazione come una popolazione mutante Omozygous M3. Se tutte le 12 piantine non mostrano una tale risposta, portale alla generazione M4 e ri-schermata per ottenere la popolazione omozigota.
- Una volta ottenuta una linea vegetale omozivia, identificare il gene che porta al fenotipo alterato utilizzando il sequenziamento di prossima generazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La popolazione di EMS è stata sottoposta a screening per l'elevazione di H2O2 indotta da Ca2. Come discusso in precedenza, 12 singole piantine M2 sono state schermate da ogni linea M1. Nella Figura 3, una di queste linee M1 viene tracciata con ogni pannello che mostra 12 singole piantine M2. Un aequorin wild-type viene utilizzato come controllo per confrontare e valutare la risposta mutante. Un mutante recessivo segrega nel rapporto di 1:7 (mutante: non mutante). Durante lo screening di 12 piantine individuali per linea M1, possiamo identificare 1 o 2 mutanti per linea. Abbiamo identificato 2 mutanti putativi da 12 M2 piantine (Figura 3). Questi mutanti sono ulteriormente portati a M3 e M4 e viene generata una popolazione omozina. Il mutante omozigo è ulteriormente mappato per identificare il gene causale.
Figura 1: EMS mutagenizzato Arabidopsis. (A) Per determinare una mutagenesi dello SME di successo, abbiamo cercato la clorofilla nella popolazione delle piante mutagenezzate (indicata per freccia). Statisticamente, lo 0,1-1% degli impianti M1 deve mostrare i settori clorotici. (B) L'invaso individuale degli impianti M1 è stato fatto per eseguire una singola raccolta di semi a base di pedigree. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Una rappresentazione schematica della metodologia dello screening genetico in avanti. 7500 piante transgeniche di Arabidopsis che esprimono Aequorin citosolica (Aeq) nel Col-0 sono mutagenizzate con metanosulfora etilare (EMS) nella generazione M0. Circa 5000 piantine di generazione M1 vengono propagate singolarmente con un metodo a pedigree singolo e propagate alla generazione M2. 12 piante di ogni linea M2 sono sottoposte a screening per il fenotipo di interesse (circa 3000-3500 M1 linee). Mutante per il fenotipo di interesse viene salvato e propagato alla generazione M3 e sottoposto a screening per omozygosity. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Identificazione dei mutanti con risposta alterata altrattamento H2O2. Viene mostrata una figura rappresentativa per rappresentare la selezione mutante da un'unica linea M1 segregante. I pannelli mostrano il risultato dello screening (12 piantine M2 segreganti per singola linea M1) su stimolazione con 10 mM H2O2. Controllo WT (Aequorin) (linea verde), media di tutte le piantine 12 M2 è la risposta media (linea rossa) e A1-X (linea nera) sono singole piantine numerate da 1 a 12. Per ogni grafico, l'asse y è il [Ca2]cyt (M) e l'asse x è time (min). [Ca2o] i livelli di cit sono stati calcolati da unità di luce relative (RLI). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La mutagenesi EMS è un potente strumento per generare mutazioni nella popolazione. Gli schermi genetici classici che utilizzano lo SME sono stati uno strumento efficace per identificare nuovi geni per due motivi principali: in primo luogo, non richiedono alcuna ipotesi preliminare sull'identità genica e, in secondo luogo, non introducono alcuna distorsione. Ci sono diversi metodi per generare una popolazione di screening come EMS, inserimenti T-DNA, radiazioni ecc. Tra tutti i metodi, la mutagenesi basata su EMS ha pochi vantaggi rispetto agli altri metodi. In primo luogo, è più facile generare una popolazione mutata per esposizione a EMS come descritto nell'attuale protocollo21,22. In secondo luogo, può essere generato un numero sufficientemente elevato di popolazione di semi mutanti, che può essere utilizzato per più schermi per uno o più stimoli. In terzo luogo, è possibile identificare un allele debole di un gene essenziale generato a causa di una mutazione errata. In quarto luogo, è possibile identificare una serie di effetti sulla funzione genica utilizzando lo schermo EMS, tra cui la perdita completa di funzione, la perdita parziale della funzione, la funzione alterata e una funzione genica di tipo constitutivo. Può aiutare nell'identificazione di doppi mutanti che non è fattibile da altri metodi di mutagenesi23,24,25. La raccolta di semi M1 basata su singolo pedigree utilizzato in questo protocollo è anche vantaggiosa in quanto permette di tornare alla popolazione madre per identificare nuovamente lo stesso mutante, se la progenie viene persa nelle generazioni future successive. Offre la possibilità di recuperare mutazioni che sono sterili quando omozio e possono essere recuperati tramite i fratelli eterozici delle piante mutanti. In secondo luogo, questa strategia garantisce l'indipendenza di tutti i mutanti isolati rispetto al bulking di semi in generazione Di M1. Garantisce che le mutazioni isolate dalla collezione M2 siano alleli diversi nello stesso locus piuttosto che nello stesso evento mutazionale26.
I geni identificati attraverso gli schermi di mutagenesi EMS dipendono dal fenotipo utilizzato per lo screening della popolazione. Più veloce è il fenotipo di interesse può essere vagliato, più facile è identificare nuovi percorsi. Ca2 è un messaggero secondario onnipresente che è tra le prime cascate di segnalazione ad essere attivato. Funge da mediatore per la risposta delle piante contro una vasta gamma di stimoli biotici e abiotici. Inoltre, il reporter di calcio aequorin può essere localizzato in vari compartimenti subcellulari e organelli27,28,29. Questo apre strade per identificare i ruoli delle proteine localizzate in questi compartimenti nella dinamica di risposta al calcio30,31,32.
Gli schermi genetici in avanti basati sulla mutagenesi EMS in aequorina e l'uso di Ca2 , poiché le letture sono rimaste contemporanee fin dalla loro scoperta. I vantaggi di questo metodo hanno superato le insidie. Tuttavia, alcune limitazioni della tecnica devono ancora essere valutate attentamente. Lo schermo è laborioso e di spendivo in termini di tempo e richiede l'identificazione di piante mutanti da una vasta popolazione mutagenizzata. Pertanto, prima di intraprendere il piano sperimentale, è necessario effettuare una pianificazione dettagliata basata sulla disponibilità delle risorse, sui requisiti del personale di lavoro e sui vincoli di spazio. La seconda grande sfida con gli schermi Ca2 o basato su aequorin è la possibilità di falsi positivi senza un passo di scarico. Pertanto, nel protocollo è incluso un passo di scarico molto breve. Le mutazioni casuali possono anche portare alla generazione di piante sterili che non possono essere salvate a causa di mutazioni multiple. In terzo luogo, la firma di Ca2 è altamente specifica del tessuto e la coerenza nello screening deve essere garantita4 .
Non molti schermi genetici a placino hanno identificato recettori, canali, pompe e trasportatori di Ca2, come uso di Ca2, come fenotipo di screening nella genetica avanzata era raro. Gli stimoli (ad esempio,2l'elevazione di Ca2 o 2)indotta da stimoli vengono utilizzati come marcatore per uno screening genetico in avanti nella nostra metodologia, per identificare nuovi componenti genetici coinvolti nel processo. Una strategia simile utilizzando EMS popolazione di aequorin mutagenized ha portato alla scoperta di molti recettori come DORN1 che è recettore eATP33, canale di calcio OSCA34, recettore LORE coinvolti nel rilevamento lipopolissaccharide35 e il ribonucle PAN136. Un recente studio pubblicato da Wu et al. ha utilizzato una metodologia molto simile di screening EMS-mutagenized aequorin piante su H2O2 elicitation per identificare il nuovo sensore di perossido di idrogeno HPCA137. Per questo il protocollo che utilizza la mutagenesi EMS in background di reporter di Ca2 o è un metodo promettente per la scoperta di nuovi geni coinvolti nel rilevamento degli stimoli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessuno degli autori ha alcun conflitto di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Ringraziamo l'Istituto Nazionale di Ricerca sul Genoma Vegetale - Phytotron Facility per la crescita delle piante, Bombay Locale per le riprese video e il Consorzio Department of Biotechnology- eLibrary per aver fornito l'accesso alle risorse e-resources. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Biotecnologia, India attraverso il National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group programma; e CSIR-Junior Research Fellowship (a D.M e S.M) e Department of Biotechnology-Junior Research Fellowship (a R.P).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
