Summary
読み出しとしてCa2+の標高に基づく前方遺伝的スクリーンは、植物のカルシウム依存性シグナル伝達経路に関与する遺伝的成分の同定につながる。
Abstract
前方の遺伝的スクリーンは、いくつかの生物学的経路に関与する遺伝的構成要素の公平な同定において重要なツールであった。画面の基礎は、目的の表現型でスクリーニングすることができる変異体集団を生成することです。EMS(エチルメタンスルホン酸)は、古典的な前方遺伝子スクリーンでランダムな突然変異を誘導し、任意のプロセスに関与する複数の遺伝子を同定するために一般的に使用されるアルキル化剤である。細胞構造カルシウム(Ca2+)上昇は、ストレス知覚時に活性化される重要な初期シグナル伝達経路である。しかし、Ca2+の受容体、チャネル、ポンプ、トランスポーターのアイデンティティは、多くの研究システムにおいて依然として不可解です。Aequorinは、エーコレアビクトリアから分離され、シロイヌナズナで安定して発現する細胞カルシウムレポータータンパク質です。これを利用して、我々はEMS-変異原性のエクオリントランスジェニックを形成する前方遺伝子スクリーンを設計した。変異植物から種子を採取し(M1)、目的とする表現型のスクリーニングを分離(M2)集団で行った。96ウェルハイスループットCa2+測定プロトコルを使用して、様々なカルシウム応答を有し、リアルタイムで測定されるいくつかの新しい変異体を同定することができる。目的の表現型を有する変異体は、ホモ接合変異植物集団が得られるまで救出され、伝播される。このプロトコルは、Ca2+レポーターのバックグラウンドで遺伝的画面を転送するための方法を提供し、新しいCa2+規制対象を同定する。
Introduction
生物または非生物的刺激の知覚時の細胞細胞分解性カルシウム(Ca2+)濃度の変化は、多くのシグナル伝達経路1、2、3、42,を活性化する十分に1研究された早期シグナル伝達事象である。3,4その基底安静状態の細胞は、細胞質および隔離剤の細胞質2+濃度を、種々の細胞内小器官および細胞外アポプラストにおいてより低いCa2+濃度を維持し、急なCa2+勾配5,66に至る。5シグナル知覚の際に、細胞外および/または細胞内源からのCa2+の流入により、Ca2+レベルが細胞質ゾル内で上昇し、刺激特異的なカルシウムシグネチャ77、8、98,9を生成する。サイトゾル内のCa2+上昇は多くの刺激によって活性化されるが、特異性はCa2+を放出する別個の店舗によって維持され、ユニークなCa2+シグネチャと適切なセンサータンパク質10,11,11である。
アルキル化剤の使用、変異生成のためのエチルメタンスルホン酸塩(EMS)は、プロセスに関与する複数の独立した遺伝子を同定するための古典的な前方遺伝子スクリーンの強力なツールです。EMSは、主にCからT、GをAに誘導する化学変異原であり、ゲノム全体にランダムに移行し、ゲノムの125kbごとに1bpの変化を生じる。EMS変異生成は、ゲノム12当たり挿入/欠失(InDel)または一塩基多型(SNP)のいずれかの単一塩基対の変化を誘導する。EMS誘導突然変異は、1/300から1/30000の変異頻度を有する複数点突然変異である。これにより、所定の遺伝子に変異を見つけるために必要なM1植物の数が減少します。2000-3000のM1シード集団範囲は、典型的には、シロイヌナズナ13、14,14で関心のある変異を得るために使用される。
エケオリントランスジェニックは、シロイヌナズミシコロンビア-0(Col-0)の植物植物であり、p35S-アポエクオリン(pMAQ2)をサイトゾル15に発現する。Aequorinは、アポタンパク質とルシフェリン分子、コエンテラジンからなる補綴基で構成されるCa2+結合タンパク質である。Ca2+と3つのCa2+結合EF-手部位を有するエクオリンへの結合により、コエンテラジンが酸化され、サイクチ化されてジオキセタノン中間体を得て、続いて二酸化炭素および単一励起したコエレンタミド16の放出を伴うタンパク質の立体構造変化が生じる。生成されたコエンテラミドは、光計17で検出できる青色光(λ max,470 nm)を発光する。max非常に高速なCa2+の標高は、このようにリアルタイムで測定することができ、迅速な前方の遺伝的スクリーンのために利用されます。このプロトコルは、カルシウム応答の特異性を使用して、Ca2+署名に関与する新しい主要プレーヤーを特定することを目的としています。このタスクを達成するために、トランスジェニック・エクポリンでEMS変異生成を使用し、変更されたCa2+シグナル伝達に関連するSNPを同定する。このプロトコルは、刺激付加時にCa2+の標高を示さないか、または減少させた変異体を識別する。これらの変異体は、次いで、Ca2+応答の原因となる遺伝子を同定するためにマッピングすることができる。この方法は、Ca2+の標高をもたらす植物の液体刺激の任意の種類に適用されます。Ca2+上昇は植物防御シグナル経路における最初の応答の1つであるため、上流応答成分の同定は、弾力性のある植物を開発するための遺伝子工学の候補を提供することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EMS変異誘発と単一血統系種子コレクション(1-3ヶ月)
- EMS変異発生に対する150mgの種子(約7500mg)のエクオリン(M0種子)の重量を量る。コントロールとして使用する種子の別の150mgの重量を量る。
- 種子を50 mLチューブに移し、0.2%EMS(v/v)(注意)の25 mL(治療用)または25mLのオートクレーブ水(コントロール用)を加えます。
注意:エチルメタンスルホン酸は、植物材料を変異させる化学薬品です。 - パラフィルムでチューブを密封し、アルミホイルで包みます。チューブエンドオーバーエンドを室温で18時間回転させます。
- 種子が落ち着くことを許可します。EMS溶液を慎重に取り除き、同量の1 M NaOHを含む廃棄物容器に廃棄します(NaOHはEMSを安全に廃棄するのに役立ちます)。使用済みプラスチック製品を1 M NaOH溶液に廃棄します。
注:24時間後、危険物の実験室の慣行に従って廃棄を処分する。 - 40mLのオートクレーブ水で完全に変異原性種子を8回洗浄してください。前述のようにNaOH廃棄物容器に含まれるEMSを廃棄します。
- 最後の洗浄のために、100 mMナトリウムチオ硫酸ナトリウムの40 mLを加え、EMSの痕跡を取り除くために3回洗い流す。
- 40 mLのオートクレーブ水に種子を浸し、約1時間浸漬して、種からEMSを拡散し、完全に乾燥するまで濾紙に入れます。
- 種子をマイクロ遠心チューブに移し、40mLのオートクレーブ水で4〜4日間の種子を層化します。これは、種子休眠を破るのに役立ち、均質な成長を保証します。
- 変異原性種子(M0)と対照種子の両方を土壌(土壌組成:農地:土壌、1:1)に移し、16時間光/8時間の暗い光周期、150 μmol∙m-2∙s-1および〜70%の相対湿度−1 の光強度を有する成長室に移します。−2
- 突然変異誘発が成功したかどうかを判断するには、発芽速度の低下と苗の成長、およびクロロフィルセター18(図1A)を探す。変異原性植物を対照植物と比較して、これらの生理学的および発達上の違いを特定する。
注:M1植物から種子を収穫するために異なる方法を使用することができます。このプロトコルでは、単一の血統ベースのシード収集方法を用いた。各M1プラントには、A1からA3500までの一意の番号が与えられます。 - 個別に番号付けされたプラントを個別のプラントラインとして維持する (図 1B)。
- 成熟すると、これらの個々の変異植物から種子を収穫し、個々のM1ラインとして保存する(図2)。単一の血統ベースの種子コレクションから、我々は3500 M1ラインがスクリーニングされた約5000 M1ラインを得た。
2. 変異体を選択するハイスループットスクリーニング(8ヶ月)
- 選択した刺激に対するCa2+応答に基づいて新規変異体を同定する。ここでは、例としてH2O2を用いた。
- 変異体を識別するために、M2世代をスクリーニングする。劣性変異体はEMS突然変異誘発14の際にM2生成において1/8周波数で分離するので、8-12M2-分離植物のスクリーニングは1つのM1ラインをカバーし、同種劣性突然変異体を同定する(12種苗を使用すると突然変異体を見つける確率が高くなる)。各独立したM1ラインから、H2O2に対するCa2+応答に対して212M2苗を試験します2(M1ラインあたり12M2苗)。2
- 高スループットの種子滅菌および水耕植物成長プロトコル19を使用する。24ウェル組織培養プレートの個々の井戸にM1ラインあたりほぼ12-15 M 2シードを入れ、ガスボンネットの4時間乾燥機に塩素ガス(次亜塩素酸12%の40mL、塩酸、3:1、v/v)を使用して殺菌します。手順の後、デシケータを開き、塩素ガスが蒸発するために一晩放置します。
- 滅菌後、プレートを外に持ち出し、液体1/2MS培地(寒天なしの半強度MS)を個々の井戸に加えます。パラフィルムでプレートを密封し、4°Cで2〜4日間種子を層状にし、70%の相対湿度で20〜22°Cで10時間光/14時間暗光周期で成長室に種子を移動させます。
- 苗木が8-12日になったら、各ラインから12 M2の苗を96ウェルのルミノメータープレートに個別に配置します。H2O2に対するCa2+応答を測定するには、ルミノメータープレートリーダーを使用してください。
- 苗の移入後、暗い/低照度の領域の個々の井戸に5-10 μMのコエレントラジン溶液(メタノールの5 mMの原料から自動洗浄水で希釈する)の150 μLを加え、21°Cの暗闇の中で8時間保存します。
注:コエレントラジンは、アポエクオリンに結合し、機能的なエクオリンに再構成する義足グループです。コエレントラジンは光に敏感であり、したがって、光から保護された暗い色のボトルに保存されています。 - 翌日、10mMH2O2を刺激として2用いて2変異画面を行い、その後のCa2+応答を測定する。
- 24個のウェルを同時に測定するには、1分間の背景を測定する自動運動プログラムを作成し、刺激付加(40 μL)と10分間の測定を行い、続いて1〜2分間の全エケオリン放電(2 M CaCl2 in 150 μL 20%エタノール)を作成します。
注:測定されたCa2+を定量化し、機能的なエクオリンのための追加制御として、総エクオリンの終末放電が必要です。最後の排出は1-2分の短い走行であり、重大な植物死を引き起こさない。あるいは、排出工程後に植物が死んだ場合は、特定のM1ラインを再スクリーニングし、排出することなく救助する。このような変異体は、排出工程を用いてM3およびM4世代で確認することができる。 - 測定ポイントあたり 300 ms の統合時間で 7 秒間隔の各行を測定する 24 ウェル形式のスキャン方式を使用します。変異体の比較と評価のために、各行の制御として野生型の苗を使用します。
注:M2の苗を含む単一の96の井戸の版は8つの個々のM1ライン(8 M1 *12=96 M2)をカバーし、2.5時間でスクリーニングすることができ、毎日32 M1ラインは、月あたり640 M1植物をスクリーニングされる。植物の準備が整った後の全体のスクリーニング手順は約8ヶ月かかります。 - H2O2によるCa2+応答の損失または低下に基づいて変異2体を同定する。抗生物質ベースの洗浄プロセスを通じて選択された突然変異体を救出する。25 mg/L セフォタキシ液で苗を2回洗い、1/2 MS寒天で25 mg/Lセフォタキシムを含む培地を救助するために移します。
- 10時間光/14時間暗い光周期でプレートを成長させ、変異植物を得る。セフォタキシム洗浄は、苗上の有害な微生物を除去するのに役立ちます。再構成後の苗は密閉されずに保たれるため、無菌状態に戻す際の汚染を最小限に抑えます。
- 変異植物を土壌に移し、ホモ接合M3集団を得る。
3. データ分析と変異体の同定(1~3ヶ月)
注: 上記の方法で提供される測定値は、相対光単位(RLU)で提供されます。
- [Ca2+]cyt濃度を計算する場合は、次の濃度式20を使用します。
pCa = 0.332588(-ログ(L/Lmax))+ 5.5593
ルミネセンス数 () および残りの合計カウント (最大) - 取得した pCa 値を μM の [Ca2+]cyt値に変換するには、106を掛けます。次に、Ca2+応答に対する推定H2O2変異体を同定するためのエクオリン(トランスジェニックCol-02エポリン)制御2+ に対してグラフィカルにプロットする。
- 救出されたH2O2アプリケーションに対する応答の損失または減少を2示すレスキュー苗。
- 成熟時に、救出された変異体から種子を収穫し、M3苗のH2O2への応答のために再スクリーニングする。12M3の3苗木すべてが母植物と同様のCa2+応答を示す場合、母集団はホモ接合M3突然変異集団であると考える。全12種の苗がそのような応答を示さない場合は、それらをM4世代に持って行き、ホモ接合集団を得るために再スクリーンする。
- ホモ接合植物ラインが得られたら、次世代シーケンシングを用いて変性表現型に至る遺伝子を同定する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EMS集団を、H2O2誘導Ca2+上昇2+についてスクリーニングした。先に述べたように、各M1ラインから12個のM2苗をスクリーニングした。図3では、このようなM1線が1本ずつプロットされ、各パネルに12個のM2苗を示す。野生型のエクオリンは、変異型応答を比較および評価するための制御として使用されます。劣性変異体は、1:7の比で分離する(変異体:非突然変異体)。M1ライン当たり12個の苗をスクリーニングする場合、1行あたり1または2個の突然変異体を同定することができる。12 M2の苗から2つの推定変異体を同定した(図3)。これらの変異体は、さらにM3およびM4に取られ、ホモ接合集団が生成される。ホモ接合変異体は、さらに因果遺伝子を同定するためにマッピングされる。
図1:EMS変異体シロイヌナズナズナシス。(A) EMS突然変異誘発の成功を求める目的で、変異原性植物集団におけるクロロフィルのセパチンを探した(矢印で示される)。統計的には、M1植物の0.1〜1%はクロロティックセクタを示さなければならない。(B)M1植物の個々の1ポッティングは、単一の血統ベースの種子コレクションを行うために行われた。Bこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:前方遺伝子スクリーン方法論の概略図7500のトランスジェニック・アラビドシス植物は、コル-0で細胞質性エークオリン(Aeq)を発現し、M0世代においてエチルメタンスルホン酸塩(EMS)で変異体化される。M1世代から約5000種1の苗が単一の血統法によって個別に伝播され、M2生成に伝播される。各M2ラインから12の植物が対象の表現型(約3000-3500M1ライン)についてスクリーニングされています。目的の表現型のための変異体は、救出され、M3世代に伝播され、ホモ接合性のためにスクリーニングされる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:H2O2処理O2に対する応答変化を伴う変異体の同定2。単一の分離M1ラインから変異体選択を描写する代表的な図が示されている。パネルは、10 mMH2O2で刺激を受けたスクリーニング結果(M1ライン当たり12種分分)を示2す。WT(Aequorin)コントロール(緑線)、全12M22苗の平均は平均応答(赤線)及びA1-X(黒線)は、1〜12から番号が付いた個々の苗である。各グラフの y 軸は [Ca2+]cyt (μM) で、x 軸は時間 (分) です。[Ca2+]cytレベルは相対光単位(RlUS)から算出した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EMS変異誘発は、集団の突然変異を生成するための強力なツールです。EMSを用いた古典的なフォワード遺伝子スクリーンは、2つの主な理由で新しい遺伝子を同定するための効果的なツールとなっています:第一に、遺伝子同一性に関する事前の仮定を必要とせず、第二に、彼らはバイアスを導入しません。EMS、T-DNA挿入、放射線などのスクリーニング集団を生成する方法はいくつかあります。すべての方法のうち、EMSベースの突然変異誘発は、他の方法よりもいくつかの利点を有する。第1に、現在のプロトコル21,22に記載されているEMSへの曝露により変異体集団を生成しやすくなる22。第2に、十分に多くの変異種子集団を生成することができ、これは1つ以上の刺激のために複数のスクリーンに使用することができる。第3に、ミスセンス変異により生じる必須遺伝子の弱い対立遺伝子を同定することができる。第4に、完全機能喪失、部分機能喪失、機能の変化、構成遺伝子機能を含むEMSスクリーンを用いて遺伝子機能効果の配列を同定することができる。それは他の突然変異誘発法23、24、25,24,25では実現不可能な二重変異体の同定に役立つ。このプロトコルで使用される単一の血統ベースのM1シードコレクションは、その後の世代で子孫が失われた場合、同じ突然変異体を再び同定するために母親集団に戻ることができるので有利である。これは、ホモ接合のときに不妊であり、突然変異植物のヘテロ接兄弟を介して回復することができる突然変異を回復する可能性を提供する。第二に、この戦略は、M1世代における種子の増量と比較した場合に単離されたすべての変異体の独立性を保証する。M2コレクションから分離された突然変異が、2同じ突然変異事象26ではなく同じ軌跡で異なる対立遺伝子であることを保証する。
EMS変異生成スクリーンによって同定される遺伝子は、集団のスクリーニングに使用される表現型に依存する。関心のある表現型を速くスクリーニングできるので、新しい経路を識別するのが容易になります。Ca2+は、最初にアクティブ化されるシグナル伝達カスケードの一つであるユビキタスセカンダリメッセンジャーです。これは、生物と非生物刺激の広い配列に対する植物の応答のためのメディターとして機能します.さらに、カルシウムレポーターのaequorinは、様々な細胞下コンパートメントおよびオルガネラ27、28、29,28,29に局在することができる。これは、カルシウム応答ダイナミクス30、31、32,31のこれらのコンパートメントに局在するタンパク質の役割を識別するための道を32開きます。
エクオリンにおけるEMS-変異生成に基づく前方遺伝子スクリーンと読み出しとしてCa2+を使用することは、その発見以来現代的なままである。この方法の利点は、落とし穴を上回っています。しかし、この技術の制限はほとんど慎重に評価する必要はありません。画面は労働と時間のかかる、広大な変異体の集団からの変異植物の識別を必要とします。したがって、リソースの可用性、作業員の要件、およびスペース制約に基づく詳細な計画は、実験計画に着手する前に行う必要があります。エクオリンベースのCa2+スクリーンでの2番目の大きな課題は、放電ステップなしで偽陽性の可能性です。したがって、非常に短い放電ステップがプロトコルに含まれています。ランダム突然変異はまた、複数の突然変異のために救出することができない無菌植物の生成につながる可能性があります。第三に、Ca2+のシグネチャは組織特異的で、スクリーニングにおける一貫性は4.
前方遺伝学におけるスクリーニング表現型としてのCa2+の使用がまれであったとして、多くの前方遺伝子スクリーンがCa2+の受容体、チャネル、ポンプおよびトランスポーターを同定したわけではない。刺激(例えば、H2O2)誘発2Ca2+上昇は、我々の方法論における前方遺伝的スクリーンのマーカーとして使用され、プロセスに関与する新しい遺伝的構成要素を同定する。EMS変異原化エクオリン集団を用いた同様の戦略は、EATP受容体33であるDORN1、カルシウムチャネルOSCA34、リポ多糖センシング35およびリボヌクレアーゼPARN136に関与するLORE受容体のような多くの受容体の発見につながっている。Wuらが発表した最近の研究では、新しい過酸化水素センサHPCA137を同定するために、H2O2の引き出し2に対するEMS変異体化エクオリン植物のスクリーニングの非常によく似た方法論を用いた。したがって、CA2+レポーターのバックグラウンドでEMS変異生成を用いたプロトコルは、刺激センシングに関与する新しい遺伝子発見のための有望な方法である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者の誰も宣言する利害の対立を持っていません。
Acknowledgments
植物ゲノム研究所 - 植物の成長のためのフィトトロン施設、ビデオ撮影のためのボンベイロケール、および電子資源へのアクセスを提供するためのバイオテクノロジー省eLibraryコンソーシアムに感謝します。この研究は、国立植物ゲノム研究所コアグラント、マックスプランクゲセルシャフト-インドパートナーグループプログラムを通じて、インドのバイオテクノロジー省によって支援されました。CSIRジュニア研究フェローシップ(D.MおよびS.M)およびバイオテクノロジー・ジュニア研究フェローシップ(R.P.へ)を含む。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
