Summary
En fremover genetisk skjerm basert på Ca2 + høyde som en opplesning fører til identifisering av genetiske komponenter involvert i kalsiumavhengige signalveier i planter.
Abstract
Fremover genetiske skjermer har vært viktige verktøy i objektiv identifisering av genetiske komponenter involvert i flere biologiske veier. Grunnlaget for skjermen er å generere en mutant populasjon som kan screenes med en fenotype av interesse. EMS (etylmetansulfonat) er et vanlig alkylerende middel for å indusere tilfeldig mutasjon i en klassisk fremover genetisk skjerm for å identifisere flere gener involvert i en gitt prosess. Cytosolic kalsium (Ca2 +) høyde er en viktig tidlig signalvei som aktiveres ved stresspersepsjon. Men identiteten til reseptorer, kanaler, pumper og transportører av Ca2 + er fortsatt unnvikende i mange studiesystemer. Aequorin er et cellulært kalsiumreporterprotein isolert fra Aequorea victoria og stabilt uttrykt i Arabidopsis. Ved å utnytte dette, designet vi en fremover genetisk skjerm der vi EMS-mutagenized aequorin transgenic. Frøene fra de muterte plantene ble samlet (M1) og screening for fenotypen av interesse ble utført i den segregerende (M2) befolkningen. Ved hjelp av en 96-brønns høygjennomstrømning Ca2 + måleprotokoll, kan flere nye mutanter identifiseres som har en varierende kalsiumrespons og måles i sanntid. Mutantene med fenotypen av interesse blir reddet og spredt til en homozygotert plantepopulasjon oppnås. Denne protokollen gir en metode for fremover genetiske skjermer i Ca2 + reporter bakgrunn og identifisere romanen Ca2 + regulerte mål.
Introduction
En endring i cytosolisk kalsium (Ca2+) konsentrasjon ved oppfatning av biotisk eller abiotisk stimulans er en godt studert tidlig signalhendelse som aktiverer mange signalveier1,,2,,3,4. En celle i sin basal hvile tilstand opprettholder en lavere Ca2 + konsentrasjon i cytosol og sequesters overflødig Ca2 + i ulike intracellulære organeller og ekstracellulær apoplast fører til en bratt Ca2 + gradient5,6. Ved signaloppfatning stiger Ca2+ nivåer i cytosolen på grunn av en tilstrømning av Ca2+ fra ekstracellulære og/eller intracellulære kilder og genererer en stimulispesifikk kalsiumsignatur7,,8,,9. Ca2 + høyder i cytosol aktiveres av mange stimuli, men spesifisitet opprettholdes av forskjellige butikker som frigjør Ca2 +, en unik Ca2 + signatur og passende sensorproteiner10,11.
Bruken av alkylerende middel, etyl-metansulfonat (EMS) for mutagenese er et kraftig verktøy i klassiske fremover genetiske skjermer for å identifisere flere uavhengige gener involvert i en prosess. EMS er en kjemisk mutagen som hovedsakelig induserer C til T og G til en overgang tilfeldig gjennom genomet og produserer en 1 bp endring i hver 125 kb av genomet. EMS mutagenesis vil indusere ‰1000 enkelt base par endringer, enten innsetting / slettinger (InDel) eller enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) per genom12. EMS-induserte mutasjoner er flere punktmutasjoner med en mutasjonsfrekvens fra 1/300 til 1/30000 per locus. Dette reduserer antall M1 planter som trengs for å finne en mutasjon i et gitt gen. En M1 frø populasjonsområde av 2000-3000 brukes vanligvis til å oppnå mutasjoner av interesse i Arabidopsis thaliana13,14.
Aequorin transgenics er Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) ecotype planter som uttrykker p35S-apoaequorin (pMAQ2) i cytosol15. Aequorin er et Ca2+ bindende protein bestående av apoprotein og en protesegruppe bestående av luciferinmolekyl, coelenterazine. Bindingen av Ca2 + til aequorin, som har tre Ca2 + bindende EF-hender nettsteder, resulterer i coelenterazine blir oksidert og syklisert for å gi dioksetanon mellom, etterfulgt av en konformasjonsendring av proteinet ledsaget av frigjøring av karbondioksid og singlet-spent coelenteramid16. Coelenteramide så produsert avgir et blått lys (λmax, 470 nm) som kan oppdages av luminometer17. De ekstremt raske Ca2 + høyder kan dermed måles i sanntid, og utnyttes for raske fremover genetiske skjermer. Denne protokollen tar sikte på å bruke spesifisiteten av kalsiumrespons for å identifisere nye nøkkelspillere som er involvert i Ca2 + signaturen. For å oppnå denne oppgaven bruker vi EMS mutagenesis i transgen aequorin og identifiserer SNPs forbundet med endret Ca2 + signalering. Protokollen identifiserer mutanter som viser ingen eller redusert Ca2 + høyder ved stimuli tillegg. Disse mutantene kan deretter kartlegges for å identifisere genene som er ansvarlige for Ca2+ responsen. Metoden gjelder for alle typer flytende stimuli i planter som resulterer i en Ca2 + høyde. Siden Ca2 + høyde er en av de første svarene i anlegget forsvar signalveien, identifisering av oppstrøms responskomponenter kan gi kandidater for genteknologi for å utvikle elastiske planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EMS mutagenese og enkelt stamtavle-basert frø samling (1-3 måneder)
- Vei 150 mg frø (~ 7500) av aequorin for EMS mutagenese (M0 frø). Vei ytterligere 150 mg frø som skal brukes som en kontroll.
- Overfør frøene til et 50 ml rør og tilsett 25 ml 0,2 % EMS (v/v) (FORSIKTIG) (for behandling) eller 25 ml autoklavert vann (for kontroll).
MERK: Etyl-metansulfonat er et kjemisk middel for mutagenizing plantemateriale. - Forsegle røret med parafilm og pakk det i aluminiumsfolie. Drei røret ende-over-end i 18 timer ved romtemperatur.
- La frøene bosette seg. Fjern EMS-oppløsningen forsiktig og kast i en avfallsbeholder som inneholder 1 M NaOH i like store volumer (NaOH bidrar til å nøytralisere/deaktivere EMS som gjør det trygt å kaste). Kast det brukte plastikket i en 1 M NaOH-løsning.
MERK: Etter 24 timer, kast kastene i henhold til laboratoriepraksis for farlig materiale. - Vask de mutageniserte frøene grundig med 40 ml autoklavert vann minst 8 ganger. Kast EMS som inneholder vann i en NaOH avfallsbeholder som nevnt ovenfor.
- For den endelige vasken, tilsett 40 ml 100 ml natriumtiosulfat og skyll 3 ganger for å fjerne spor av EMS.
- Bløtlegg frøene i 40 ml autoklavert vann i ~ 1 t for å spre EMS ut av frø og legg dem deretter på filterpapir til det er helt tørt.
- Overfør frøene til et mikrocentrifugerør og stratifiser frøene ved 4 °C i 40 ml autoklavet vann i 2-4 dager. Dette bidrar til å bryte frø dvalen og sikrer homogen vekst.
- Overfør både mutageniserte frø (M0) og kontrollfrøene på jord (jordsammensetning: agropet: soilrite, 1:1) og overfør dem til vekstrom med en 16 t lys / 8 t mørk fotoperiode, en lysintensitet på 150 μ∙mol m−2∙s−1 og ~ 70% relativ fuktighet.
- For å finne ut om mutagenese var vellykket, se etter redusert spiringshastighet og frøplantevekst, og klorofyll sektor18 (Figur 1A). Sammenlign de mutageniserte plantene med kontrollanleggene for å identifisere disse fysiologiske og utviklingsmessige forskjellene.
MERK: Ulike metoder kan brukes til høsting av frø fra M1 planter. I denne protokollen har vi brukt den enkle stamtavlebaserte frøinnsamlingsmetoden. Hver M1-plante får et unikt nummer fra A1 til A3500. - Vedlikehold individuelt nummererte planter som diskrete anleggslinjer (Figur 1B).
- Ved modning høster frø fra disse individuelle muterte plantene og oppbevares som individuelle M1-linjer (figur 2). Fra den enkle stamtavle-baserte frøsamlingen fikk vi rundt 5000 M1 linjer hvorav 3500 M1-linjer ble screenet.
2. Høygjennomstrømning screening for å velge mutanter (8 måneder)
- Identifiser nye mutanter basert på Ca2+ svar på en valgt stimulans. Her brukte vi H2O2 som eksempel.
- For å identifisere mutanter, screen M2-generasjonen. Siden resesive mutaseringer segregerer ved 1/8-frekvens i M2-generasjon ved EMS mutagenese14,øker screening av 8-12 M2-segregerende planter en M1-linje og identifiserer en homozygos resessiv mutant (ved hjelp av 12 frøplanter øker sannsynligheten for å finne en mutant). Fra hver uavhengige M1-linje tester du 12 M2-plantene for Ca2+-respons på H2O2 (12 M2 frøplanter per M1-linje).
- Bruk en høy gjennomstrømning frø sterilisering og hydroponic plantevekst protokoll19. Plasser nesten 12-15 M2 frø per M1 linje i individuelle brønner av en 24-brønns vevkulturplate og steriliser ved hjelp av klorgass (40 ml natriumhypokloritt og saltsyre, 3:1, v/ v) i en tørkemiddel for 4 timer i en røykhette. Etter prosedyren, åpne avsiccator og la over natten for klorgass å fordampe.
- Etter sterilisering, ta plater utenfor og tilsett flytende 1/2 MS media (halvstyrke MS uten agar) til individuelle brønner. Forsegle platene med parafilm og stratifiser frøene i 2-4 dager ved 4 °C og flytt deretter frøene til et vekstkammer med 10 t lys/ 14 h mørk fotoperiode ved 20-22 °C med 70 % relativ fuktighet.
- Når plantene er 8-12 dager gamle, plasser 12 M2 frøplante fra hver linje individuelt i en 96-brønns luminometerplate. For måling av Ca2+ respons på H2O2bruker du en luminometerplateleser.
- Etter frøplanteoverføring tilsett 150 μL 5-10 μM coelentrazin oppløsning (fortynnet i autoklavert vann fra en 5 mM lager i metanol) (FORSIKTIG) i individuelle brønner i et mørkt/svakt lys område og oppbevares i mørket ved 21 °C i 8 timer.
MERK: Coelentrazine er en protesegruppe som binder seg til apo-aequorin og rekonstituerer den til funksjonell aequorin. Coelentrazine er lysfølsom og lagres dermed i mørke flasker, beskyttet mot lys. - Neste dag, utfør mutant skjerm ved hjelp av 10 mM H2O2 som en stimulans og måle den påfølgende Ca2 + respons.
- For samtidig måling av 24 brønner, opprett et automatisert kinetisk program som måler bakgrunnen i 1 min, etterfulgt av stimuli addisjon (40 μL) og måling i 10 min, etterfulgt av total aequorin utslipp (2 M CaCl2 i 150 μL 20% etanol) for 1-2 min.
MERK: En sluttutladning for total aequorin er nødvendig for å kvantifisere den målte Ca2+ og som ekstra kontroll for funksjonell aequorin. Sluttutslippet er en kort kjøring på 1-2 min og forårsaker ikke betydelig plantedød. Alternativt, hvis plantene dør etter utløpstrinn, deretter re-screene den spesifikke M1 linje og redning uten utslipp. Slike mutanter kan bekreftes i M3 og M4 generasjoner ved hjelp av utløpstrinnet. - Bruk en skannemetode på 24 brønnformat som måler hver rad i 7 s intervall med 300 ms integrasjonstid per brønn per målepunkt. Bruk en vill type frøplante som kontroll i hver rad for sammenligning og evaluering av mutanten.
MERK: En enkelt 96-brønnplate som inneholder M 2-frøplanter dekker 8 individuelle M1-linjer (8 M1 *12=96 M2)og kan screenes i 2,5 timer og hver dag vil 32 M1 linjer bli screenet, 640 M1 planter per måned.2 Hele screeningprosedyren etter at plantene er klare, vil ta rundt 8 måneder. - Identifiser mutanter basert på tap av eller redusert Ca2+ respons med H2O2. Redd de valgte mutantene gjennom en antibiotikabasert vaskeprosess. Vask frøplanten med 25 mg/l cefotaxime oppløsning to ganger og overfør deretter til redningsmediet som inneholder 25 mg/l cefotaxime i 1/2 MS agar.
- Dyrke platene på en 10 t lys / 14 t mørk fotoperiode for å få en mutant plante. Cefotaxime vask bidrar til å fjerne skadelige mikroorganismer på planten. Siden plantene etter rekonstituering holdes uforseglet, minimerer du kontamineringen når du overfører tilbake til steril tilstand.
- Overfør mutantanlegget til jord for å skaffe homozygot M3-populasjonen.
3. Dataanalyse og mutant identifikasjon (1-3 måneder)
MERK: Målingene fra metoden ovenfor er i relative lysenheter (RLU).
- For beregning av [Ca2+]cytkonsentrasjon, bruk følgende konsentrasjonsligning20.
pCa = 0,332588(−logg (L/Lmaks.))+ 5,5593
Antall lystetthet () og totalt gjenstående antall (maks). - Konverter de oppnådde pCa-verdiene til [Ca2+]cytverdier i μM ved å multiplisere med 106. Deretter grafisk plotte mot en aequorin (transgene Col-0 aequorin) kontroll for å identifisere putative H2O2 mutanter til Ca2 + respons.
- Redningsplanter som viser tap av eller redusert respons på H2O2 søknad reddet.
- Ved modning høster frø fra den reddet mutanten og re-screen for respons på H2O2 i M3 frøplanter. Hvis alle 12 M3 frøplanter viser en Ca2 + respons som ligner på morplanten, vurdere befolkningen å være en homozygous M3 mutant befolkning. Hvis alle 12 frøplanter ikke viser et slikt svar, så ta dem til M4 generasjon og re-screen for å få homozygot befolkning.
- Når en homozygotplantelinje er oppnådd, må du identifisere genet som fører til endret fenotype ved hjelp av neste generasjons sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EMS-populasjonen ble screenet for H2O2 indusert Ca2+ høyde. Som omtalt tidligere, ble 12 individuelle M2 frøplanter screenet fra hver M1 linje. I figur 3plottes en slik M1-linje med hvert panel som viser 12 individuelle M 2-frøplanter.2 En vill type aequorin brukes som kontroll for å sammenligne og evaluere mutantresponsen. En resessiv mutant segregerer i forholdet 1:7 (mutant: non mutant). Når vi screener 12 individuelle frøplanter per M1-linje, kan vi identifisere 1 eller 2 mutanter per linje. Vi har identifisert 2 antatte mutanter fra 12 M2 frøplanter (figur 3). Disse mutantene blir videre tatt til M3 og M4 og en homozygotpopulasjon genereres. Homozygot mutanten er ytterligere kartlagt for å identifisere årsaksgenet.
Figur 1: EMS mutagenized Arabidopsis. (A) For å bestemme en vellykket EMS mutagenesis, så vi etter klorofyll sektorering i mutagenized plantepopulasjonen (indikert med pil). Statistisk sett må 0,1 til 1% av M1-anleggene vise klorotiske sektorer. (B) Individuell potting av M1 planter ble gjort for å utføre en enkelt stamtavle-basert frøsamling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: En skjematisk representasjon av den fremovergenetiske skjermmetodikken. 7500 transgene arabidopsis planter som uttrykker cytosolisk Aequorin (Aeq) i Col-0 er mutagenized med etymetansulfonat (EMS) i M0-generasjonen. Rundt 5000 frøplanter fra M1 generasjon spres individuelt ved enkelt stamtavle metode og forplantes til M2 generasjon. 12 planter fra hver M2 linje er screenet for fenotype av interesse (rundt 3000-3500 M1 linjer). Mutant for fenotypen av interesse er reddet og spredt til M3 generasjon og screenet for homozygosity. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Identifisering av mutanter med endret respons på H2O2-behandling. En representativ figur for å skildre mutantvalg fra en enkelt segregerende M1-linje vises. Panelene viser screeningresultatet (12 segregerende M2 frøplanter per individuell M1 linje) ved stimulering med 10 mM H2O2. WT (Aequorin) kontroll (grønn linje), gjennomsnitt av alle 12 M2 frøplanter er gjennomsnittlig respons (rød linje) og A1-X (svart linje) er individuelle frøplanter nummerert fra 1-12. For hver graf er y-aksen [Ca2+]cyt (μM) og x-aksen er tid (min). [Ca2+] cytnivåer ble beregnet ut fra relative lysenheter (RLUer). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EMS mutagenesis er et kraftig verktøy for å generere mutasjoner i befolkningen. De klassiske fremover genetiske skjermer ved hjelp av EMS har vært et effektivt verktøy for å identifisere nye gener av to hovedgrunner: for det første krever de ingen tidligere antagelser om genidentitet og for det andre introduserer de ingen bias. Det finnes flere metoder for å generere en screening populasjoner som EMS, T-DNA innsettinger, stråling etc. Ut av alle metodene har EMS-basert mutagenese få fordeler over de andre metodene. For det første er det lettere å generere en mutant populasjon ved eksponering for EMS som beskrevet i gjeldende protokoll21,22. For det andre kan et tilstrekkelig stort antall muterte frøpopulasjoner genereres, som kan brukes til flere skjermer for en eller flere stimuli. For det tredje kan en svak allele av et essensiell gen generert på grunn av en missense mutasjon identifiseres. For det fjerde kan en rekke genfunksjonseffekter identifiseres ved hjelp av EMS-skjermen, inkludert fullstendig funksjonstap, delvis funksjonstap, endret funksjon og en konstitutiv genfunksjon. Det kan hjelpe i identifisering av doble mutanter som ikke er mulig ved andre mutagenese metoder23,24,25. Den eneste stamtavle basert M1 frø samling som brukes i denne protokollen er også en fordel som det tillater en å gå tilbake til morpopulasjonen for å identifisere den samme mutant igjen, hvis avkom er tapt i de påfølgende fremtidige generasjoner. Det gir mulighet for å gjenopprette mutasjoner som er ufruktbare når homozygot og kan gjenopprettes via heterozygotsøsknene til mutantplantene. For det andre garanterer denne strategien uavhengigheten til alle mutanter isolert sammenlignet med bulking av frø i M1 generasjon. Det sikrer at mutasjoner isolert fra M2-samlingen er forskjellige alleler på samme locus i stedet for den samme mutasjonshendelsen26.
Genene som identifiseres gjennom EMS mutageneseskjermer er avhengige av fenotypen som brukes til screening av populasjonen. Jo raskere fenotypen av interesse kan screenes, jo lettere er å identifisere nye veier. Ca2 + er en allestedsnærværende sekundær budbringer som er blant de første signalene kaskader som skal aktiveres. Det fungerer som en mekler for planterespons mot et bredt spekter av biotiske og abiotiske stimuli. I tillegg kan kalsiumreporteren aequorin lokaliseres til ulike subcellulære rom og organeller27,28,,29. Dette åpner veier for å identifisere roller av protein lokalisert i disse rommene i kalsiumresponsdynamikk 30,31,32.
Fremover genetiske skjermer basert på EMS-mutagenesis i aequorin og bruke Ca2 + som avlesninger har vært moderne siden oppdagelsen. Fordelene med denne metoden har oppveid fallgruvene. Imidlertid må få begrensninger av teknikken fortsatt vurderes nøye. Skjermen er arbeid og tidkrevende og krever identifisering av muterte planter fra en enorm mutagenisert befolkning. Derfor må detaljert planlegging basert på ressurstilgjengelighet, arbeidpersonellkrav og plassbegrensninger gjøres før du tar fatt på den eksperimentelle planen. Den andre store utfordringen med aequorin-baserte Ca2 + skjermer er mulighet for falske positiver uten et utslipp trinn. Derfor er et svært kort utladningstrinn inkludert i protokollen. Tilfeldige mutasjoner kan også føre til generering av sterile planter som ikke kan reddes på grunn av flere mutasjoner. For det tredje er Ca2+ signatur svært vevsspesifikk og konsistens i screening må sikres4.
Ikke mange fremover genetiske skjermer har identifisert reseptorer, kanaler, pumper og transportører av Ca2 + som bruk av Ca2 + som screening fenotype i fremover genetikk var sjelden. Stimuli (f.eks. H2O2) indusert Ca2+ høyde brukes som markør for en fremover genetisk skjerm i vår metodikk, for å identifisere nye genetiske komponenter involvert i prosessen. En lignende strategi ved hjelp av EMS mutagenized aequorin populasjonen har ført til oppdagelsen av mange reseptorer som DORN1 som er eATPreseptor 33,kalsiumkanal OSCA34, LORE reseptor involvert i lipopolysakkarid sensing35 og ribonuclease PARN136. En nylig studie publisert av Wu et al. har brukt en svært lignende metodikk for screening EMS-mutagenized aequorin planter på H2O2 fremkalle for å identifisere den nye hydrogenperoksid sensor HPCA137. Derfor er protokollen ved hjelp av EMS mutagenese i Ca2 + reporter bakgrunn en lovende metode for ny genoppdagelse involvert i stimuli sensing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har noen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Vi takker National Institute of Plant Genome Research - Phytotron Facility for plantevekst, Bombay Locale for videoopptaket, og Institutt for bioteknologi- eLibrary Consortium for å gi tilgang til e-ressurser. Dette arbeidet ble støttet av Institutt for bioteknologi, India gjennom National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group program; og CSIR-Junior Research Fellowship (til D.M og S.M) og Institutt for bioteknologi-juniorstipendiatstipendiat (til R.P).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
