Summary
Rekombinant BDNF indeholdende en Avi-sekvens (BDNFAvi) fremstilles i HEK293-celler på en omkostningseffektiv måde og renses ved affinitetskromatografi. BDNFavi monobiotinyliseres derefter direkte med enzymet BirA i et rør. BDNFavi og mono-biotinyleret BDNFavi bevarer deres biologiske aktivitet sammenlignet med kommercielt tilgængelige BDNF.
Abstract
Rekombinant BDNF indeholdende en Avi-sekvens (BDNFAvi) fremstilles i HEK293-celler og renses derefter omkostningseffektivt ved affinitetskromatografi. En reproducerbar protokol blev udviklet til direkte mono-biotinylate BDNFAvi med enzymet BirA i et rør. I denne reaktion bevarer monobiotinyleret BDNFAvi sin biologiske aktivitet.
Neurotropiner er målafledte vækstfaktorer spiller en rolle i neuronal udvikling og vedligeholdelse. De kræver hurtige transportmekanismer langs endocytic vej til at tillade langdistance signalering mellem forskellige neuronal rum. Udviklingen af molekylære værktøjer til at studere handel med neurotropiner har gjort det muligt at præcis sporing af disse proteiner i cellen ved hjælp af in vivo optagelse. I denne protokol udviklede vi en optimeret og omkostningseffektiv procedure til produktion af monobiotinyleret BDNF. En rekombinant BDNF-variant, der indeholder en biotinylabel avi-sekvens (BDNFAvi), fremstilles i HEK293-celler i mikrogramområdet og renses derefter i en let skalerbar procedure ved hjælp af affinitetskromatografi. Den rensede BDNF kan derefter homogent mono-biotinyliseres ved en direkte in vitro-reaktion med enzymet BirA i et rør. Den biologiske aktivitet af den monobiotinylerede BDNF (mbtBDNF) kan konjugeres til streptavidin-konjugeret til forskellige fluorophores. BDNFAvi og mbtBDNF bevarer deres biologiske aktivitet, der er påvist ved påvisning af downstream fosforylerede mål ved hjælp af henholdsvis western blot og aktivering af transskriptionsfaktoren CREB. Ved hjælp af streptavidin-quantum prikker, vi var i stand til at visualisere mbtBDNF internalisering samtidig med aktivering af CREB, som blev opdaget med en fosfor-CREB specifikke antistof. Desuden var mbtBDNF konjugeret til streptavidin-kvanteprikker egnet til retrograd transportanalyse i kortikale neuroner dyrket i mikrofluidiske kamre. Således, i rør produceret mbtBDNF er et pålideligt værktøj til at studere fysiologiske signalering endosome dynamik og handel med neuroner.
Introduction
Neuroner er de funktionelle enheder i nervesystemet besidder en kompleks og specialiseret morfologi, der giver mulighed for synaptisk kommunikation, og dermed, generering af koordineret og kompleks adfærd som reaktion på forskellige stimuli. Neuronal fremskrivninger såsom dendritter og axoner er kritiske strukturelle funktioner, der er involveret i neuronal kommunikation, og neurotrophins er afgørende aktører i fastsættelsen af deres morfologi og funktion1. Neurotropiner er en familie af udskilles vækstfaktorer, der omfatter NGF, NT-3, NT-4, og hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF)2. I centralnervesystemet (CNS), BDNF deltager i forskellige biologiske processer, herunder neurotransmission, dendritiske arborization, modning af dendritiske pigge, langsigtet potensering, blandt andre3,4. Derfor spiller BDNF en afgørende rolle i reguleringen af neuronal funktion.
Forskellige celleprocesser regulerer BDNF-dynamik og -funktion. På neuronal overflade binder BDNF tropomyosin receptorkinase B (TrkB) og/eller p75 neurotrophin receptor (p75). BDNF-TrkB- og BDNF-p75-komplekserne er endocytosed og sorteret i forskellige endocytiske organeller5,6,7,8. Korrekt intracellulær handel med BDNF/TrkB-komplekset er nødvendig for korrekt BDNF-signalering i forskellige neuronale kredsløb9,10,11. Af denne grund, en dyb forståelse af BDNF menneskehandel dynamik og dens ændringer findes i patofysiologiske processer er afgørende for at forstå BDNF signalering i sundhed og sygdom. Udviklingen af nye og specifikke molekylære værktøjer til overvågning af denne proces vil bidrage til at fremme dette område og give mulighed for en bedre forståelse af de involverede reguleringsmekanismer.
Der er flere værktøjer til rådighed for studiet af BDNF handel med neuroner. En almindeligt anvendt metode omfatter transinfektion af rekombinant BDNF mærket med fluorescerende molekyler såsom grønt fluorescerende protein (GFP) eller den monomeriske fluorescerende rød-forskudt variant af GFP mCherry12,13. Men, en stor mangel ved BDNF overekspression er, at det eliminerer muligheden for at levere kendte koncentrationer af denne neurotrophin. Også, Det kan resultere i cellulære toksicitet, tilsløre fortolkningen af resultater14. En alternativ strategi er transfektion af en epitop-tagged TrkB, såsom Flag-TrkB. Denne metode gør det muligt at studere TrkB internalisering dynamik15,men det indebærer også transfection, hvilket kan resultere i ændret TrkB funktion og cellulære toksicitet. For at overvinde disse metodologiske forhindringer blev der udviklet16 , 17.17 Biotinyleret rekombinant BDNF kan kobles til forskellige streptavidin-bundne værktøjer, som omfatter fluorophores, perler, paramagnetiske nanopartikler blandt andet til påvisning. Med hensyn til live-celle billeddannelse, kvanteprikker (QD) er blevet hyppigt anvendt fluorophores, da de har ønskelige egenskaber for enkelt-partikel tracking, såsom øget lysstyrke og modstandsdygtighed over for fotobleaching sammenlignet med små molekyle fluorophores18.
Produktionen af monobiotinyleret BDNF (mbtBDNF) ved hjælp af BDNFAvi er opnået ved co-transfektion af plasmider, der driver udtrykket BDNFAvi og BirA, efterfulgt af rensning af rekombinant protein ved affinitetkromatografi med et udbytte på 1-2 μg BDNF pr. 20 ml HEK293-betinget dyrkningsmedie17. Her foreslår vi en ændring af denne protokol, der giver mulighed for BDNFAvi rensning fra 500 ml HEK293-betingede medier, som søger at maksimere proteingenvinding i en kromatografi-kolonnebaseret protokol for at lette manipulation. Det anvendte transfekturemiddel, polyethylenimidin (PEI), sikrer en omkostningseffektiv metode uden at gå på kompromis med transfektureudbyttet. Monobiotinyleringstrinnet er blevet tilpasset en in vitro-reaktion for at undgå de komplikationer, der er forbundet med co-transinfektioner, og for at sikre ensartet mærkning af BDNF. Den biologiske aktivitet af mbtBDNF blev påvist ved vestlige blot og fluorescens mikroskopi eksperimenter, herunder aktivering af pCREB og levende celle billeddannelse til at studere retrograd axonal transport af BDNF i mikrofluidiske kamre. Anvendelsen af denne protokol giver mulighed for optimeret, højtydende produktion af homogen monobiotinylerede og biologisk aktive BDNF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer fra CONICYT (Chiles nationale kommission for videnskabelig og teknologisk forskning). De protokoller, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev godkendt af biosikkerheds- og bioetisk- og dyrevelfærdskomitéerne under Pontificia Universidad Católica de Chile. Forsøg med hvirveldyr blev godkendt af Den Bioetiske Komité og Dyrevelfærdskomitéen under Pontificia Universidad Católica de Chile.
BEMÆRK: Følgende protokol er designet til at rense BDNFAvi fra et samlet volumen på 500 ml konditioneret medium produceret i HEK293 celler. Mængden af konditioneret medium, der produceres og forarbejdes til at rense BDNFAvi, kan opskaleres efter behov. Det kan dog være nødvendigt med yderligere optimering under disse omstændigheder. Sammensætningen af de dyrkningsmedier og puffere, der anvendes i hele protokollen, findes i supplerende materialer.
1. Produktion og rensning af BDNFAvi fra HEK293-betingede medier
- Transfektion af HEK293-celler
- Vokse HEK293 celler til 70% sammenløb i suppleret DMEM medium (10% kvæg føtal serum, 1x glutamat supplement, 1x antibiotika / antimykotisk) i 15 cm kultur retter på 37 ºC.
- Skift mediet til transfektionbufferen.
- Klargør PEI-DNA-blandingen til transfektion. Brug to forskellige 15 ml koniske rør til at fortynde DNA og PEI 25 K. henholdsvis. 20 μg plasmid-DNA fortyndes i et endeligt volumen på 500 μL i et rør. 60 μg lineær PEI 25K fortyndes i et endeligt volumen på 500 μL i det andet rør. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
- Forsigtigt pipette DNA-opløsningen i PEI røret, blanding én gang ved op-ned bevægelse. Inkuber ved stuetemperatur i 25 min.
- Dryp 1 ml af PEI-DNA blandingen i hver 15 cm skål. Cellerne inkuberes med PEI-DNA-blandingen i 3 timer ved 37 ºC.
- Skift mediet til ny inkubationsbuffer.
- Medieindsamling og -lagring
- Saml mediet fra alle retterne 48 timer efter transfektion af HEK293 celler. Der skal udarbejdes koncentrerede lagre af de opløsninger, der er beskrevet i afsnittet "supernatantmodifikationsbuffer" i supplerende fil 1, og de tilføjes til OVERNATREN HEK293 for at opnå de anførte endelige koncentrationer.
BEMÆRK: Celler kan kasseres eller gendannes til yderligere analyse. - Inkuber mediet i is i 15 min.
- Aliquot mediet i centrifuge rør.
- Mediet centrifugeres ved 10.000 x g i 45 min. i en 4 °C centrifuge. Dette trin gør det muligt at fjerne cellerester og døde celler suspenderet i medierne.
- Saml supernatants, tilføje BSA ved en endelig koncentration på 0,1%. og derefter opbevares ved -20 °C. Medierne kan aliquoted før frysning for hurtigere optøning under rensning trin.
BEMÆRK: Opbevaringstider for frosne konditionerede medier på op til 2 måneder har givet positive resultater, og længere opbevaringstider er ikke blevet evalueret.
- Saml mediet fra alle retterne 48 timer efter transfektion af HEK293 celler. Der skal udarbejdes koncentrerede lagre af de opløsninger, der er beskrevet i afsnittet "supernatantmodifikationsbuffer" i supplerende fil 1, og de tilføjes til OVERNATREN HEK293 for at opnå de anførte endelige koncentrationer.
- Mediekoncentration og rensning
- Tø mediet op i et termoreguleret bad på 37 °C.
- Aliquot medierne i centrifuge rør.
- Mediet centrifugeres i 1 time ved 3.500 x g i en 4 °C afkølet centrifuge. Dette trin gør det muligt at fjerne resterende celleaffald for at sikre tilstrækkelig strøm gennem kromatografikolonnen.
- Brug proteinkoncentratorerne med en 10 kDa cutoff for at reducere mediet fra 500 ml til 100 ml. Følg producentens anbefalede centrifugeringsparametre for optimal koncentration.
- Der tilsættes 500 μL Ni-NTA agaroseperler til de koncentrerede medier og inkuberes natten over ved 4 °C i en rocker.
- Kromatografiapparatet samles, og hæld mediet i det. Lad det hvile i 5 min og derefter åbne 2-vejs stophane at lade mediet flyde igennem.
- Perleafler med 5 ml vaskebuffer i 5 min. Sørg for at resuspendlerne i kolonnen. Hæld vaskebufferen af ved at åbne den 2-vejs stophane. Gentag 3 gange.
- Der tilsættes 1 ml elueringsbuffer til kolonnen. Sørg for at resuspend perlerne i kolonnen. Inkuberes i 15 minutter, og derefter indsamle eluat i en 1,5 ml mikrocentrifuge rør. Gentag dette trin 3 gange for fuldstændig eluering af BDNFAvi.
- Der indbestiles 5 μL af hvert eluat og forskellige koncentrationer af kommercielt tilgængelige BDNF (40-160 ng) i en 15% polyacrylamidegel. Detekter det rensede protein ved vestlig blotting ved hjælp af et anti-BDNF antistof.
- Koncentrationen af det rensede BDNFAvi i hvert eluat bestemmes ved hjælp af den koncentrationskurve, der er fremstillet med den kommercielt tilgængelige BDNF.
- Aliquot og opbevar den rensede BDNFAvi ved -80 °C.
2. In vitro mono-biotinylering af BDNFAvi ved hjælp af BirA-enzymet
-
In vitro mono-biotinyleringsreaktion
- Tilbered koncentrerede stamopløsninger af biotinylation buffer reagenser. Anvendelsen af koncentrerede lagre vil minimere fortyndingen af det rekombinant protein.
- Tag en aliquot på 800 ng af BDNFAvi og tilsæt biotinylation buffer reagenser og enzymet BirA i en 1:1 molar forhold til BDNF. For eksempel, for en 200 μL endelige reaktion volumen tilføje; 100 μL opløsning indeholdende 800 ng BDNFAvi, 20 μL Bicin 0,5 M pH 8,3 20 μL ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100 mM, 20 μL d-biotin 500 μM, 0,8-1 μg til 1 μL BirA-GST og komplet til 200 μL med ultralet vand.
BEMÆRK: Der er udført vellykkede biotinyleringsreaktioner med aliquoter på 400 μL indeholdende en koncentration på ca. 30 ng/ μL BDNFAvi, hvilket resulterer i en homogen biotinyleret BDNFAvi til en endelig koncentration på ~20 ng/ μL i den endelige reaktion. - Blandingen inkuberes ved 30 °C i en hybridovn i 1 time. Bland indholdet ved rørinversion hver 15.
- Tilføj den samme mængde ATP og BirA som i trin 2.1.2 og gentag trin 2.1.3.
- Opbevares ved -80 °C til fremtidige analyser eller opbevares på is til øjeblikkelig brug (f.eks. kvalitetskontrol af biotinylering).
- Analyse af biotinylering
- Blok 30 μL streptavidin magnetiske perler pr. BDNF-prøve i 1 ml blokerende buffer. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time i en mikrocentrifugerør rotator.
- Udkæd de magnetiske perler ved hjælp af en magnetisk separationsrack i 3 til 5 minutter, eller indtil bufferen fremstår helt ryddet af perlerne og kasserer blokeringsbufferen.
- Der tilsættes 50 μL frisk blokerende buffer og 80 ng monobiotinyleret BDNFAvi -prøve (mbtBDNF) til perlerne, og det skal sikres, at de opslæmmes fuldstændigt ved hjælp af pippeting.
- Inkuber ved 4 °C i 1 time i en mikrocentrifugerør rotator spinding ved ca. 20 RPM.
- Opsaml perlerne ved hjælp af den magnetiske separationsrist i 3 til 5 minutter, og opsaml supernatanten, idet der opbevares en 30 μL-aliquot til analyse.
- Perle perlerne én gang med 500 μL PBS, og derefter indsamle dem ved hjælp af den magnetiske adskillelse rack i 3 til 5 minutter. Supernatanten genfindes, og der opbevares en 30 μL-aliquot til analyse.
- Der tilsættes 10 μL 4x lastebuffer til perlerne.
- Prøverne opvarmes til 97 °C i 7 min for at eluere mbtBDNF.
- Detekter mbtBDNF ved hjælp af et anti-BDNF-specifikt antistof19.
3. Kontrol af mbtBDNF's biologiske aktivitet
- Påvisning af pTrkB og pERK ved western blot.
- Seed 2 millioner rotte kortikale neuroner i 60 mm kultur retter.
- Kultur neuronerne i 7 dage (DIV7). Derefter, ændre medium til ikke-suppleret neurobasal mediun, når du starter forsøget.
- En time efter medium ændring, tilsættes mbtBDNF til en endelig koncentration på 50 ng/ml. Inkuber i 30 min ved 37 ºC. Hold en negativ kontrolskål (ikke stimuleret med BDNF) og en positiv kontrolskål (behandlet med 50 ng/ml kommercielt tilgængelige BDNF).
- Opsaml mediet og vask forsigtigt hver skål med 1x PBS. Saml og kassér 1x PBS.
- Læg opvasken på isen, og der tilsættes 50-80 μL lysisbuffer til hver skål. Brug en celleskrober til at lyse cellerne.
BEMÆRK: Lysistrinnet skal udføres så hurtigt som muligt for at undgå proteinafsporing og nedbrydning. 1-2 minutter kraftig skrabning er nok til at visualisere proteiner af interesse ved vestlige blotting. - Opsaml lysis buffer og rør i en vortex mixer ved højeste hastighed for 5 s.
- Lysisbufferen centrifugeres ved 14.000 x g (4 °C) i 10 min. Opsaml supernatanten.
- Der kvantificeres proteinindholdet i supernatanten ved BCA-proteindvantificeringsprotokol20.
- Der tilsættes læssebuffer til en aliquot indeholdende 30-50 μg protein pr. tilstand, og den indsættes i en 12% polyacrylamidegel til vestlig blotting. Detekter pTrkB og pERK ved hjælp af specifikke fosforantistoffer til at verificere BDNFAvi's biologiske aktivitet.
- Verifikation af BDNF-QD biologisk aktivitet ved pCREB immunfluorescens.
- Seed 40.000 rottekortikale neuroner i 10 mm coverslips, tidligere autoklatret og behandlet med poly-L-lysin som beskrevet tidligere21.
- Kultur neuronerne i 7-8 dage i neuronal vedligeholdelse buffer (se supplerende materialer) på 37 ºC.
- For at starte forsøget skal du ændre mediet til usuppleret neurobasalt medium og indbøje ved 37 ºC i 1 time.
- Forbered mbtBDNF konjugeret til kvanteprikker (BDNF-QD) ved at tilføje til en mbtBDNF aliquot, den nødvendige mængde kvante dot streptavidin konjugat (streptavidin-QD) for at opnå en 1:1 BDNF-QD molar ratio. Derefter fortyndes til 20 μL med neurobasaltium. Wrap røret i aluminiumsfolie for at beskytte det mod lyset.
BEMÆRK: Forbered et andet rør med samme volumen kvanteprik streptavidin konjugat og fortyndes til 20 μL med neurobasaltium som en negativ kontrol. - MbtBDNF/ streptavidin-QD-blandingen inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i en rocker.
- BDNF-QD fortyndes til den ønskede endelige koncentration (200 pM og 2 nM) i neurobasalt medium.
- Efter 1 time inkubation med ikke-suppleret neurobasaltium stimuleres neuronerne med BDNF-QD eller streptavidin-QD (kontrol) til en endelig koncentration på 200 pM og 2 nM BDNF i 30 min ved 37 °C.
- Oversæberne vaskes 3 gange med 1x PBS (37 °C) og cellerne fastgøres i 15 minutter ved behandling af dækslet med 4% paraformaldehydopløsning indeholdende fosfatasehæmmere.
- Cellerne vaskes 3 gange med PBS, og derefter inkuberes med blokering/permeabiliseringsbuffer (BSA 5%, Triton X-100 0,5%, 1x fosfatasehæmmer) i 1 time.
- Inkuber med anti-pCREB antistof 1:500 (i 3% BSA, 0,1% Triton X-100) natten over ved 4 °C.
- Den følgende dag vaskes 3 gange med 1x PBS og inkuberes i 1 time med det sekundære antistof 1:500 (3% BSA, 0,1% Triton X-100).
- Vask 3 gange med 1x PBS. Der tilsættes Hoechst-opløsning til nuklear plet (5 μg/ml) i 7 min.
- Vask 3 gange med 1x PBS og monter.
- Visualisering af retrograd axonal transport af BDNF-QD i levende neuroner
- Tilbered mikrofluidiske kamre og frøneuroner som beskrevet tidligere16.
- Efter 7-8 dage i kultur, ændre medium til ikke-suppleret neurobasal medium.
- Forbered mbtBDNF konjugeret til kvanteprikker (BDNF-QD) ved at tilføje til en mbtBDNF aliquot, den nødvendige mængde kvante dot streptavidin konjugat (streptavidin-QD) for at opnå en 1:1 BDNF-QD molar ratio. Derefter fortyndes til 20 μL med neurobasaltium. Wrap røret i aluminiumsfolie for at beskytte det mod lyset.
BEMÆRK: Forbered et andet rør med samme volumen kvanteprik streptavidin konjugat og fortyndes til 20 μL med neurobasaltium som kontrol. - MbtBDNF/ streptavidin-QD-blandingen inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i en rocker.
- BDNF-QD fortyndes til den ønskede endelige koncentration (2 nM).
- Efter 1 time inkubation med ikke-suppleret neurobasaltium tilsættes BDNF-QD eller kontrolblandingen til de aksonale rum i mikrofluidickammeret. Inkuber i 210 min ved 37 °C for at sikre en netto retrograd transport af BDNF-QD.
- For levende celle billeddannelse visualiseres axonal retrogradtransport i det segment af mikrobrinter, der er proksimalt for cellekroppen, ved hjælp af et 100x mål ved hjælp af et mikroskop, der er egnet til dette formål (37 °C og 5% CO2). Hent billeder på 1 ramme/s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brugen af en kromatografisk kolonnebaseret protokol gør det muligt at behandle betydelige mængder af HEK293-konditionerede medier. I figur 1vises resultaterne af rensningen af BDNFAvi fra 500 ml konditionerede medier. På hinanden følgende elueringer af BDNFAvi fra Ni-NTA agarose perler giver faldende koncentrationer af BDNFAvi (Figur 1A). Efter fire på hinanden følgende eluer (hver varer 15 min), er størstedelen af BDNF fanget af perlerne inddrives. Koncentrationerne af eluaterne varierer fra 6 til 28 ng/μL, og det samlede udbytte udgjorde ca. 60 μg BDNFAvi (tabel 1). Den producerede BDNFAvi blev derefter effektivt biotinyleret af en in vitro-reaktion medieret af BirA-GST, som det fremgår af manglen på ikke-biotinylerede BDNFAvi i supernatanten (Figur 1B). Bemærk, at biotinyleringen i figur 1B svarer til en aliquot af den samlede BDNF, der produceres, men reaktionen kan skaleres op til større mængder.
Derefter blev mbtBDNF's biologiske aktivitet evalueret ved hjælp af 2 forskellige eksperimentelle tilgange. Først blev kortikale neuroner seedet i 60 mm plader (2 millioner neuroner, DIV7) stimuleret med 50 NG/ml mbtBDNF i 30 min, og derefter blev proteiner forberedt til blot western analyse. Den biologiske aktivitet i mbtBDNF blev kvantificeret ved at detektere pTrkB (Y515) og pERK (T202/Y204). Binding af BDNF til TrkB udløser aktivering af receptoren gennem en autophosphorylation reaktion i sit intracellulære domæne, og ERK er et kendt mål for BDNF signalering vej22. Båndene for begge fosforylaterede proteiner havde en lignende intensitet hos neuroner behandlet med kommercielT BDNF og mbtBDNF, og begge udviste et stærkere signal end kontroltilstand (Figur 2A). Derefter blev den biologiske aktivitet af mbtBDNF koblet til streptavidin-QD evalueret for at vise, at de kan bruges i levende billeddannelsesforsøg. Kortikale neuroner blev seedet i 10 mm dæksler (40.000 celler pr. dæksel, DIV7) og behandlet med en endelig koncentration på 200 pM eller 2 nM BDNF-QD i 30 min før fastgørelse og farvning for pCREB. CREB er en transskriptionsfaktor , som er mål for aktiveret ERK1/2 i kortikale neuroner22,23. Stimulerende neuroner med stigende koncentrationer af BDNF-QD resulterede i en dosisafhængig stigning i fosforylering af CREB og tilstedeværelse af QD-partikler omkring kernen (figur 2B), hvilket indikerer, at BDNF-QD-partiklerne blev endocytosed og udløste aktivering af signalveje forbundet med BDNF-medieret TrkB-aktivering. Der blev påvist en dobbelt stigning i pCREB-signalet ved stimulering af neuroner med en lav koncentration af BDNF-QD (200 pM), mens stimulering med 2 nM resulterede i en 3,5 gange stigning i pCREB-signalet (Figur 2C). Disse resultater viser, at den biotimylerede BDNFAvi er biologisk aktiv, og at det ikke mister sin aktivitet, når det kobles til streptavidin-QD, hvilket gør det velegnet til immunofluorescens og levende celle billeddannelse.
Endelig blev billeddannelsespotentialet i BDNF-QD evalueret i opdelte kulturer ved hjælp af mikrofluidiske kamre. Kortikale neuroner blev sået i mikrofluidiske kamre (15 mm dæksler, 50.000 neuroner pr. mikrofluidisk kammer, DIV7) for at adskille de axonale og somatodendritiske rum og blev stimuleret med 2 nM BDNF-QD for 3,5 h. Levende cellemikroskopi blev udført, og de resulterende kymografer blev brugt til at kvantificere hastigheden af BDNF-QD indeholdende organeller (figur 3A). Der blev påvist en gennemsnitlig glidehastighed på 0,91 μm/s (figur 3B), hvilket er i overensstemmelse med tidligere analyser af cytoplasmatisk dyneinmedieret transport7,16. Mikrofluidiske kamre behandlet med 2 nM streptavidin-QD viste ikke bevægelige QDs i mikrogroovne, som det fremgår af kymograph (Figur 3A). Celler dyrket under de samme betingelser blev stimuleret med 500 pM eller 2 nM BDNF-QD i 210 min, og derefter fastgjort og mærket med en nuklear farvning. Som vist i figur 3Cviser neuroner en dosisafhængig ophobning af BDNF-QD i alle de analyserede underrum, herunder de proksimale og distale dele af mikrogrotsovet og det somatodendritiske rum. I modsætning hertil viste kontrol neuroner næsten ingen QD signal i hele kammeret. Derfor kan BDNF-QD detekteres i levende og faste celler i mikrofluidiske kamre.
Figur 1: Produktion og monobiotinylering af BDNFAvi i HEK293-celler. HEK293-cellerne blev transficeret ved hjælp af PEI-reagenset og et BDNFAvi-kodningsplasmid, og de betingede medier blev indsamlet efter 48 h. BDNFAvi indeholder et 6x Histidin-mærke, der tillader rensning ved hjælp af nikkel-nitrilotriacetic sursyre (Ni-NTA) kromatografi. Kommercielt tilgængelige rekombinant humant BDNF har en forventet molekylvægt på ~13 kDa, mens BDNFAvi viser en molekylvægt på ~18 kDa. BDNFAvi bundet til harpiksen var fuldt elueret med fire på hinanden følgende elueringstrin. (A) Western blot ved hjælp af anti-BDNF antistoffer til at opdage i husforberedte rekombinant BDNF og kommercielle BDNF. Aliquots indeholdende kendte mængder af kommercielt tilgængelige humane BDNF og 5 μL af hvert eluat blev indlæst i en SDS-PAGE gel til påvisning af BDNFAvi ved hjælp af et antistof mod BDNF. Tabel 1 viser koncentrationerne af BDNFAvi i hvert eluat. Mængden og koncentrationen af BDNF i hvert eluat blev opnået ved denitometrisk analyse og interpolation fra koncentrationskurven for kommercielt tilgængelig bdnf. (B) Verifikation af BDNFAvi biotinylering. 80 nanogram biotinyleret BDNFAvi (mbtBDNF) blev inkuberet med 30 μL streptavidin koblet til magnetiske perler (20% gylle) i 1 time ved 4 °C. Derefter blev magnetiske perler isoleret ved hjælp af en magnetisk separator. Streptavidin perlerne blev opvarmet med læssebuffer for at eluere den biotinylerede BDNFAvi (perler bane). Supernatanten (SN lane) blev også behandlet med læssebuffer, opvarmet og lastet i gelen (SN lane). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Verifikation af mbtBDNF's biologiske aktivitet. (A) DIV7 kortikale neuroner blev serum sultet i 1 time, og derefter stimuleret med 50 ng/ml kommercielt tilgængelige BDNF eller mbtBDNF i 30 min. Proteiner blev udvundet og indlæst i en SDS-PAGE gel til analyse af TrkB og ERK1/2 fosforylering ved hjælp af fosforspecifikke antistoffer og sammenlignet med de samlede niveauer af proteinet ved hjælp af antistoffer mod totalt TrkB og ERK1/2. (B) DIV7 kortikale neuroner blev serum sultet i 1 time, og derefter stimuleret med en endelig koncentration på 200 pM eller 2 nM mbtBDNF koblet til streptavidin-QD (BDNF-QD) i 30 min. Derefter blev cellerne fikseret, og pCREB blev mærket til fluorescensmikroskopianalyse. cC) Kvantificering af kernepCREB-fluorescensintensiteten. Resultaterne svarer til 90 neuroner, der er samlet fra 3 uafhængige forsøg, vist som gennemsnitlige ± SEM. Den statistiske analyse svarer til en envejs-ANOVA med Tukey's multiple comparisons test (**** p < 0,0001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Visualisering af BDNF-QD i levende og faste celler. (A) DIV7 kortikale neuroner dyrket i mikrofluidiske kamre blev stimuleret i det axonale rum med en endelig koncentration på 2 nM BDNF-QD i 3,5 timer, og derefter blev den proksimale del af mikrogroovne afbildet ved hjælp af en mikroskopi af levende celler. Repræsentative kymografer til kontroltilstand (behandlet med streptavidin-QD) og ved behandling med BDNF-QD er vist. (B) Kvantificering af hastigheden af bevægelige BDNF-QD. Mobile punktur blev defineret som dem, der bevægede sig mere end 10 μm i 120 s af optagelsen. (C) DIV7 kortikale neuroner dyrket i mikrofluidiske kamre blev stimuleret i det aklonale rum med en endelig koncentration af BDNF-QD på 500 pM eller 2 nM i 3,5 timer og derefter fastgjort og mærket med Hoechst for at visualisere kernerne. Repræsentative billeder af det somatodendritiske rum og de distale og proksimale dele af mikrogroovne vises. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Eluat | BDNF (ng) i 5μl | [ng/μl] | BDNF i alt [μg] |
| Dagens e-række. | 142.2 | 28.4 | 28.4 |
| Dagens e-række. | 101.2 | 20.2 | 20.2 |
| Dagens e-nne | 65.6 | 13.1 | 13.1 |
| Dagens e-nne | 30.4 | 6.1 | 6.1 |
| 67.8 |
Tabel 1: Kvantificering af BDNFAvi-rensningsudbytte (relateret til fig. 1A). HEK293-celler blev transficeret med et plasmid, der drev BDNFAvi-ekspression, og proteinet blev renset af Ni-NTA-affinitetskromatografi. Proteinkoncentration og endeligt udbytte blev beregnet ved densitometrisk analyse og interpolation i den kendte koncentrationskurve for kommercielt tilgængelige rekombinant BDNF.
Supplerende fil 1: Kultur medier og buffer komponenter Klik her for at hente denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel beskrives en optimeret metode til produktion og rensning af mbtBDNF i en affinitetskromatografibaseret procedure baseret på Sungs og samarbejdspartneresarbejde 17. Optimeringerne omfatter brugen af et omkostningseffektivt transfekturereagens (PEI), samtidig med at effektiviteten af dyrere transfektionsmetoder såsom lipofectamin bevares. Denne optimering giver sig udslag i en betydelig omkostningsreduktion i protokollen, hvilket giver mulighed for skalerbarhed, samtidig med at der opretholdes en høj omkostningseffektivitet. Protokollen omfatter også brugervenlighed overvejelser, herunder indefrysning af konditionerede medier i op til 2 måneder. Disse optimeringer gør proceduren fleksibel til hvert laboratoriums behov, forbedrer omkostningseffektiviteten og giver homogen og biologisk aktiv rekombinant BDNF. Protokollen kan også tilpasses til mindre produktioner ved at erstatte brugen af kromatografiapparatet med gravitationel udfældning af perlerne i koniske rør. Dette er en levedygtig metode, men dens mindre tidseffektive og har resulteret i lavere udbytter i vores erfaring. Den biotin-mærkede BDNF kan derefter kobles til forskellige streptavidin-bundne sonder, herunder fluorophores og paramagnetiske nanopartikler, hvilket gør det til et værdifuldt redskab til at udføre forskellige typer af eksperimenter til analyse af BDNF post-endocytic menneskehandel. Derfor er en optimeret og enkel produktionsprotokol for dette protein meget nyttig for laboratorier, der arbejder på dette område.
Produktion af rekombinantproteiner med komplekse post-translationelle modifikationer, såsom BDNF24, i prokaryote systemer resulterer ofte i proteiner , der ikke er korrekt foldet og dermed har dårlig biologisk aktivitet25. Derfor er ekspression i pattedyrceller nødvendigt for at opnå et bioaktivt protein. Anvendelsen af PEI er tidligere blevet beskrevet som et levedygtigt alternativ til storstilet produktion af rekombinant proteiner i trans inficerede pattedyrceller25,26, og dens effektivitet i transfektionen af HEK293-cellerne i forbindelse med akademiske laboratorier er blevet fremhævet27. Derfor repræsenterer brugen af denne cellelinje en gyldig mulighed for at producere BDNFAvi på en skala, der kan administreres af et akademisk laboratorium. Den foreslåede protokol kunne optimeres yderligere ved at skabe en HEK293 cellelinje, der er gennemskinneligt transficeret med BDNFAvi, hvilket ville eliminere det forbigående transfection-trin og dermed spare tid og ressourcer. En anden potentiel kilde til optimering er brugen af celler i suspension i stedet for klæbende celler. HEK293 celler kan opretholdes i suspension, generere betydelige mængder af rekombinant protein i intervallet gram pr liter28.
En anden forbedring i protokollen er biotinylering af BDNFAvi-proteinet ved hjælp af en in vitro-strategi, der erstatter den tidligere in vivo-co-transinfektionsprotokol. in vivo Forbigående co-transinfektion kan have uventede resultater med hensyn til konstruktionernes udtryk, som det er påvist i flere cellelinjer og med flere transfekturereagerier29. Forskellige faktorer kan påvirke ekspressionen af transficerede proteiner i en co-transfection kontekst, herunder vektorer, celletyper og plasmid koncentration. Denne mangfoldighed af faktorer gør optimering og reproducerbarhed til en kompleks opgave. På den anden side giver en in vitro-metode mulighed for bedre kontrol med de forhold, hvorpå biotinyleringsreaktionen finder sted. Denne metode resulterer i reproducerbar og homogen mærkning af rekombinant BDNF.
Som det fremgår af forsøg med biologisk aktivitetsverifikation, kan den mbtBDNF, der er fremstillet ved hjælp af denne protokol, sammenlignes med kommercielt tilgængelige rekombinant BDNF med hensyn til aktivering af BDNF-TrkB-signalveje. Dataene viser også, at koblingen BDNF til streptavidin-QD ikke forstyrrer BDNF-TrkB-signalering. Derudover viste vi, at BDNF-QD kan detekteres ved epifluorescensmikroskopi i levende og faste celler. Derfor er mbtBDNF et værdifuldt værktøj til at studere retrograd axonal handel, og det giver betydelige fordele i forhold til alternative sonder, såsom BDNF-GFP16. Den protokol, der er beskrevet i denne artikel giver en pålidelig og konsekvent metode til produktion af mbtBDNF, som derefter kan bruges i post-endocytic dynamics undersøgelser i forskellige neuronal modeller udtrykke TrkB eller p75. BDNF signalering har potente virkninger på neuronal morfologi og funktion3,4,21, og er for nylig blevet foreslået som en potentiel terapeutisk redskab til at forbedre neuronal regenerering30,31, hvilket gør sin undersøgelse relevant inden for cellulære biologi og biomedicin. Undersøgelsen af virkningerne af BDNF signalering og menneskehandel vil yderligere fremme vores forståelse af neuronal cellebiologi og kan give mulighed for at udnytte sit regenerative potentiale i kliniske miljøer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne taknemmeligt anerkende finansiel støtte fra Fondecyt (1171137) (FCB), Basal Center of Excellence i Videnskab og Teknologi (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) og en britisk Demens Research Institute Foundation award (GS). Dette arbejde blev støttet af Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
- Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
