Summary
Recombinant BDNF met een Avi sequentie (BDNFAvi) wordt op een kosteneffectieve manier geproduceerd in HEK293 cellen en wordt gezuiverd door affiniteitschromatografie. BDNFavi wordt dan direct mono-biotinylated met het enzym BirA in een buis. BDNFavi en mono-biotinylated BDNFavi behouden hun biologische activiteit in vergelijking met commercieel verkrijgbaar BDNF.
Abstract
Recombinant BDNF met een Avi sequentie (BDNFAvi) wordt geproduceerd in HEK293 cellen en vervolgens kosteneffectief gezuiverd door affiniteit chromatografie. Een reproduceerbaar protocol werd ontwikkeld om direct mono-biotinylaat BDNFAvi met het enzym BirA in een buis. In deze reactie behoudt mono-biotinylated BDNFAvi zijn biologische activiteit.
Neurotrophins zijn doel-afgeleide groeifactoren die een rol spelen in neuronale ontwikkeling en onderhoud. Ze vereisen snelle transportmechanismen langs de endocytische route om lange afstand signalering tussen verschillende neuronale compartimenten mogelijk te maken. De ontwikkeling van moleculaire instrumenten om de handel in neurotrofinen te bestuderen heeft het mogelijk gemaakt om deze eiwitten nauwkeurig in de cel te volgen met behulp van in vivo-opname. In dit protocol ontwikkelden we een geoptimaliseerde en kosteneffectieve procedure voor de productie van mono-biotinylated BDNF. Een recombinant BDNF variant met een biotinelyle avi sequentie (BDNFAvi) wordt geproduceerd in HEK293 cellen in het microgram bereik en vervolgens gezuiverd in een gemakkelijk schaalbare procedure met behulp van affiniteit chromatografie. Het gezuiverde BDNF kan dan homogeen mono-biotinylated worden door een directe in vitro reactie met het enzym BirA in een buis. De biologische activiteit van de mono-biotinylated BDNF (mbtBDNF) kan worden geconjugeerd tot streptavidin-geconjugeerd aan verschillende fluoroforen. BDNFAvi en mbtBDNF behouden hun biologische activiteit die wordt aangetoond door de detectie van downstream fosforylated doelen met behulp van westelijke vlek en activering van de transcriptiefactor CREB, respectievelijk. Met behulp van streptavidin-quantum dots konden we mbtBDNF internalisatie visualiseren, gelijktijdig met activering van CREB, dat werd gedetecteerd met een fosfo-CREB specifiek antilichaam. Bovendien was mbtBDNF geconjugeerd tot streptavidin-quantum dots geschikt voor retrograde transportanalyse in corticale neuronen gekweekt in microfluïde kamers. Dus, in buis geproduceerde mbtBDNF is een betrouwbaar instrument om fysiologische signalering endosome dynamiek en de handel in neuronen te bestuderen.
Introduction
Neuronen zijn de functionele eenheden van het zenuwstelsel met een complexe en gespecialiseerde morfologie die synaptische communicatie mogelijk maakt, en dus de generatie van gecoördineerd en complex gedrag in reactie op diverse stimuli. Neuronale projecties zoals dendrieten en axonen zijn kritische structurele kenmerken die betrokken zijn bij neuronale communicatie, en neurotrofinen zijn cruciale spelers bij het bepalen van hun morfologie en functie1. Neurotrophins zijn een familie van gedetscheidste groeifactoren waaronder NGF, NT-3, NT-4 en brain-derived neurotrofische factor (BDNF)2. In het centrale zenuwstelsel (CNS) neemt BDNF deel aan diverse biologische processen, waaronder neurotransmissie, dendritische arborisatie, rijping van dendritische stekels, langdurige potentiëring, onder andere3,4. Daarom speelt BDNF een cruciale rol bij het reguleren van de neuronale functie.
Diverse cellulaire processen reguleren de dynamiek en functie van BDNF. Op het neuronale oppervlak bindt BDNF de tropomyosinereceptor kinase B (TrkB) en/of de p75-neurotroffinereceptor (p75). BDNF-TrkB- en BDNF-p75-complexen worden geïndocyeerd en gesorteerd in verschillende endocytische organellen5,6,7,8. Een correcte intracellulaire handel in het BDNF/TrkB-complex is vereist voor een goede BDNF-signalering in verschillende neuronale circuits9,10,11. Om deze reden is een diepgaand begrip van de bdnf-handelsdynamiek en de veranderingen ervan in pathofysiologische processen essentieel om BDNF-signalering in gezondheid en ziekte te begrijpen. De ontwikkeling van nieuwe en specifieke moleculaire instrumenten om dit proces te volgen zal helpen om dit gebied vooruit te helpen en een beter inzicht in de betrokken regelgevingsmechanismen mogelijk te maken.
Er zijn verschillende instrumenten beschikbaar voor de studie van BDNF handel in neuronen. Een veelgebruikte methode omvat de transfectie van recombinant BDNF gelabeld met fluorescerende moleculen zoals groene fluorescerende eiwitten (GFP) of de monomerische fluorescerende roodverschuiving variant van GFP mCherry12,13. Echter, een belangrijke tekortkoming van BDNF overexpressie is dat het elimineert de mogelijkheid van het leveren van bekende concentraties van deze neurotrofine. Ook kan het resulteren in cellulaire toxiciteit, verduistering van de interpretatie van de resultaten14. Een alternatieve strategie is de transfectie van een epitoop-tagged TrkB, zoals Flag-TrkB. Deze methodologie maakt het mogelijk de studie van TrkB internalisatie dynamiek15, maar het gaat ook om transfectie, die kan resulteren in veranderde TrkB functie en cellulaire toxiciteit. Om deze methodologische hindernissen te overwinnen, werden recombinant varianten van NGF en BDNF met een Avi-sequentie (BDNFAvi), die mono-biotinylated kunnen worden door het biotine-ligase enzym BirA, ontwikkeld16,17. Biotinylated recombinant BDNF kan worden gekoppeld aan verschillende streptavidin-gebonden tools, waaronder fluoroforen, kralen, paramagnetische nanodeeltjes onder andere voor detectie. In termen van live-cel beeldvorming, quantum dots (QD) zijn vaak gebruikt fluoroforen, omdat ze wenselijke kenmerken voor single-particle tracking, zoals verhoogde helderheid en weerstand tegen fotobleaching in vergelijking met kleine molecuulfluoroforen18.
De productie van mono-biotinylated BDNF (mbtBDNF) met behulp van BDNFAvi is bereikt door co-transfectie van plasmiden die de expressie van BDNFAvi en BirA aansturen, gevolgd door de zuivering van het recombinant eiwit door affiniteit chromatografie met een opbrengst van 1-2 μg BDNF per 20 mL HEK293-geconditioneerde kweekmedia17. Hier stellen we een wijziging van dit protocol voor dat BDNFAvi-zuivering mogelijk maakt van 500 mL hek293-geconditioneerde media, die ernaar streeft om het herstel van eiwitten te maximaliseren in een chromatografie-kolom gebaseerd protocol voor het gemak van manipulatie. Het gebruikte transfectiemiddel polyethyleenimine (PEI) zorgt voor een kosteneffectieve methode zonder in te leveren op de opbrengst van de transfectie. De mono-biotinylation stap is aangepast aan een in vitro reactie om de complicaties in verband met co-transfecties te voorkomen en om homogene etikettering van BDNF te garanderen. De biologische activiteit van het mbtBDNF werd aangetoond door westerse vlekken- en fluorescentiemicroscopie-experimenten, waaronder activering van pCREB en live celbeeldvorming om retrograde axonale transport van BDNF in microfluidic kamers te bestuderen. Het gebruik van dit protocol maakt een geoptimaliseerde productie met een hoog rendement mogelijk van homogene mono-biotinylated en biologisch actieve BDNF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen van CONICYT (Chileense Nationale Commissie voor Wetenschappelijk en Technologisch Onderzoek). De protocollen die in deze studie werden gebruikt, zijn goedgekeurd door de Bioveiligheid en Bio-ethische en Dierenwelzijnscommissies van de Pontificia Universidad Católica de Chile. Experimenten met gewervelde dieren werden goedgekeurd door het Bioethical and Animal Welfare Committee van de Pontificia Universidad Católica de Chile.
OPMERKING: Het volgende protocol is ontworpen om BDNFAvi te zuiveren van een totaal volume van 500 mL geconditioneerd medium geproduceerd in HEK293 cellen. De hoeveelheid geconditioneerd medium dat wordt geproduceerd en verwerkt om BDNFAvi te zuiveren, kan naar behoefte worden opgeschaald of gesaldeerd. Onder deze omstandigheden kan verdere optimalisatie echter noodzakelijk zijn. De samenstelling van de cultuurmedia en buffers die in het protocol worden gebruikt, is te vinden in aanvullende materialen.
1. Productie en zuivering van BDNFAvi uit HEK293-geconditioneerde media
- Transfectie van HEK293 cellen
- Kweek HEK293 cellen tot 70% samenvloeiing in aangevuld DMEM medium (10% runderftal serum, 1x glutamaat supplement, 1x antibioticum/antimycoticum) in 15 cm kweekgerechten bij 37 ºC.
- Wijzig de buffer voor gemiddelde naar transfectie.
- Bereid het PEI-DNA mengsel voor op transfectie. Gebruik twee verschillende 15 mL conische buizen om DNA en PEI 25 K te verdunnen, respectievelijk. Verdun 20 μg plasmide DNA in een eindvolume van 500 μL in één buis. Verdun 60 μg lineaire PEI 25K in een eindvolume van 500 μL in de andere buis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voorzichtig pipette de DNA-oplossing in de PEI buis, mengen eenmaal door up-down beweging. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten.
- Druppel 1 mL van het PEI-DNA mengsel door elke schaal van 15 cm. Incubeer de cellen met het PEI-DNA mengsel gedurende 3 uur bij 37 ºC.
- Wijzig het medium in een nieuwe incubatiebuffer.
- Mediaverzameling en -opslag
- Verzamel het medium uit alle gerechten 48 uur na de transfectie van HEK293 cellen. Bereid geconcentreerde voorraden van de oplossingen beschreven in de "supernatant modificatie buffer" sectie van supplementaire bestand 1 en voeg ze toe aan de HEK293 supernatant om de genoemde definitieve concentraties te bereiken.
OPMERKING: Cellen kunnen worden weggegooid of hersteld voor verdere analyse. - Broed het medium in ijs gedurende 15 minuten.
- Aliquot het medium in centrifuge buizen.
- Centrifugeren het medium op 10.000 x g gedurende 45 minuten in een 4 °C centrifuge. Deze stap maakt de eliminatie van celpuin en dode cellen opgehangen in de media.
- Verzamel de supernatants, voeg BSA toe met een uiteindelijke concentratie van 0,1%. en sla dan op bij -20 °C. De media kunnen worden aliquoted voor het bevriezen voor sneller ontdooien tijdens de zuiveringsstap.
OPMERKING: Opslagtijden van bevroren geconditioneerde media van maximaal 2 maanden hebben positieve resultaten opgeleverd, langere opslagtijden zijn niet geëvalueerd.
- Verzamel het medium uit alle gerechten 48 uur na de transfectie van HEK293 cellen. Bereid geconcentreerde voorraden van de oplossingen beschreven in de "supernatant modificatie buffer" sectie van supplementaire bestand 1 en voeg ze toe aan de HEK293 supernatant om de genoemde definitieve concentraties te bereiken.
- Mediaconcentratie en -zuivering
- Ontdooi de media in een thermogereguleerd bad van 37 °C.
- Aliquot de media in centrifuge buizen.
- Centrifugeren het medium gedurende 1 uur bij 3.500 x g in een 4 °C gekoelde centrifuge. Deze stap maakt het mogelijk de eliminatie van resterende celpuin om een adequate doorstroming door de chromatografiekolom te garanderen.
- Gebruik de eiwitconcentrators met een 10 kDa cutoff om de media te verminderen van 500 mL tot 100 mL. Volg de aanbevolen centrifugatieparameters van de fabrikant voor een optimale concentratie.
- Voeg 500 μL Ni-NTA agarose kralen toe aan de geconcentreerde media en broeder 's nachts bij 4 °C in een tuimelschakelaar.
- Monteer het chromatografieapparaat en giet de media erin. Laat het 5 minuten rusten en open vervolgens de 2-weg stopcock om het medium door te laten stromen.
- Was de kralen met 5 mL wasbuffer gedurende 5 minuten. Zorg ervoor dat u de kralen in de kolom opnieuw opsuspen. Giet de wasbuffer af door de 2-weg stopcock te openen. Herhaal dit 3 keer.
- Voeg 1 mL elutiebuffer toe aan de kolom. Zorg ervoor dat u de kralen in de kolom opnieuw opschort. Incubeer gedurende 15 minuten, en verzamel het eluaat in een 1,5 mL microcentrifuge buis. Herhaal deze stap 3 keer voor volledige elutie van BDNFAvi.
- Laad 5 μL van elk eluaat en verschillende concentraties van commercieel verkrijgbare BDNF (40-160 ng) in een 15% polyacrylamide gel. Detecteer het gezuiverde eiwit door westerse blotting met behulp van een anti-BDNF-antilichaam.
- Bepaal de concentratie van de gezuiverde BDNFAvi in elk eluaat met behulp van de concentratiecurve bereid met de commercieel verkrijgbaar BDNF.
- Aliquot en bewaar de gezuiverde BDNFAvi op -80 °C.
2. In vitro mono-biotinylation van BDNFAvi met behulp van het BirA-enzym
-
In vitro mono-biotinylation reactie
- Bereid geconcentreerde voorraadoplossingen van de biotinylation buffer reagentia voor. Het gebruik van geconcentreerde voorraden minimaliseert de verdunning van het recombinant eiwit.
- Neem een aliquot van 800 ng van BDNFAvi en voeg de biotinylation buffer reagentia en het enzym BirA in een 1:1 molaire relatie tot BDNF. Bijvoorbeeld, voor een 200 μL laatste reactie volume toe te voegen; 100 μL oplossing met 800 ng BDNFAvi, 20 μL Bicine 0,5 M pH 8.3; 20 μL ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100 mM, 20 μL d-biotine 500 μM, 0,8-1 μg tot 1 μL BirA-GST, en compleet tot 200 μL met ultrazuiver water.
OPMERKING: Succesvolle biotinylation reacties zijn uitgevoerd met aliquots van 400 μL met een concentratie van ongeveer 30 ng / μL BDNFAvi, wat resulteert in een homogeen biotinylated BDNFAvi tot een uiteindelijke concentratie van ~20 ng/ μL in de uiteindelijke reactie. - Broed het mengsel op 30 °C in een hybridisatieoven gedurende 1 uur. Meng het gehalte door buisinversie om de 15 minuten.
- Voeg hetzelfde volume ATP en BirA toe als in stap 2.1.2 en herhaal stap 2.1.3.
- Bewaar bij -80 °C voor toekomstige analyses of houd op ijs voor onmiddellijk gebruik (bijvoorbeeld biotinylation kwaliteitscontrole).
- Biotinylation analyse
- Blok 30 μL streptavidin magnetische kralen per BDNF monster in 1 mL van het blokkeren buffer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in een microcentrifugebuis rotator.
- Precipitate de magnetische kralen met behulp van een magnetische scheiding rack voor 3 tot 5 minuten of totdat de buffer lijkt volledig gewist van de kralen en gooi de blokkerende buffer.
- Voeg 50 μL verse blokkeerbuffer en 80 ng mono-biotinylated BDNFAvi (mbtBDNF) monster toe aan de kralen, om ze volledig te laten herhalen door pippeting.
- Incubeer bij 4 °C gedurende 1 uur in een draaizuilende van een microcentrifugebuis die draait bij ongeveer 20 RPM.
- Verzamel de kralen met behulp van het magnetische scheidingsrek gedurende 3 tot 5 minuten en verzamel de supernatant, waarbij een aliquot van 30 μL voor analyse blijft.
- Was de kralen één keer met 500 μL PBS en verzamel ze vervolgens 3 tot 5 minuten met het magnetische scheidingsrek. Herstel de supernatant en houd een aliquot van 30 μL voor analyse.
- Voeg 10 μL 4x laadbuffer toe aan de kralen.
- Verwarm de monsters 7 minuten tot 97 °C om de mbtBDNF te ontlasten.
- Detecteren mbtBDNF met behulp van een anti-BDNF specifiek antilichaam19.
3. Verificatie van de biologische activiteit van mbtBDNF
- Detectie van pTrkB en pERK door westelijke vlek.
- Zaad 2 miljoen rat corticale neuronen in 60 mm cultuur gerechten.
- Kweek de neuronen gedurende 7 dagen (DIV7). Verander vervolgens het medium in niet-aanvullende neurobasale medicatie bij het starten van het experiment.
- Een uur na de middelgrote verandering, voeg mbtBDNF aan een laatste concentratie van 50 ng /mL. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ºC. Houd een negatieve controle schotel (niet-gestimuleerd met BDNF) en een positieve controle schotel (behandeld met 50 ng / mL van commercieel beschikbare BDNF).
- Verzamel het medium en was elk gerecht voorzichtig met 1x PBS. Verzamel en gooi de 1x PBS weg.
- Leg de borden op ijs en voeg 50-80 μL lyse buffer toe aan elk gerecht. Gebruik een celschraper om de cellen te lyse.
OPMERKING: De lysestap moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om eiwitdephosfolyleratie en afbraak te voorkomen. 1-2 minuten van krachtige schrapen zijn genoeg om de eiwitten van belang te visualiseren door westerse blotting. - Verzamel de lysis buffer en roer in een vortex mixer op de hoogste snelheid voor 5 s.
- Centrifuge de lysebuffer op 14.000 x g (4 °C) gedurende 10 min. Verzamel de supernatant.
- Kwantificeer het eiwitgehalte van het supernatant door BCA-eiwitkwantificeringsprotocol20.
- Voeg laadbuffer toe aan een aliquot met 30-50 μg eiwit per conditie en laad deze in een 12% polyacrylamide gel voor westerse blotting. Detecteer pTrkB en pERK met behulp van specifieke fosfo-antilichamen om de biologische activiteit van BDNFAvi te verifiëren.
- Verificatie van bdnf-qd biologische activiteit door pCREB immunofluorescentie.
- Zaad 40.000 rat corticale neuronen in 10 mm coverslips, eerder autoclaved en behandeld met poly-L-lysine zoals eerder beschreven21.
- Kweek de neuronen 7-8 dagen in neuronale onderhoudsbuffer (zie aanvullende materialen) bij 37 ºC.
- Om het experiment te starten, wijzigt u het medium in ongesupplemented neurobasaal medium en incubbate bij 37 ºC gedurende 1 uur.
- Bereid mbtBDNF conjugated aan quantum dots (BDNF-QD) door toe te voegen aan een mbtBDNF aliquot, het noodzakelijke volume van quantum dot streptavidin conjugaat (streptavidin-QD) om een 1:1 BDNF-QD molaire verhouding te bereiken. Verdun vervolgens tot 20 μL met neurobasaal medium. Wikkel de buis in aluminiumfolie om het te beschermen tegen het licht.
OPMERKING: Bereid een andere buis met hetzelfde volume van quantum dot streptavidin conjugaat en verdun het tot 20 μL met neurobasaal medium als een negatieve controle. - Incubeer het mbtBDNF/ streptavidin-QD mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een rocker.
- Verdun de BDNF-QD tot de gewenste uiteindelijke concentratie (200 pM en 2 nM) in neurobasaal medium.
- Na 1 uur incubatie met niet-aangevuld neurobasaal medium, stimuleer de neuronen met BDNF-QD of streptavidin-QD (controle) tot een laatste concentratie van 200 pM en 2 nM BDNF gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Was de coverslips 3 keer met 1x PBS (37 °C) en bevestig de cellen gedurende 15 minuten door de coverslip te behandelen met 4% paraformaldehydehydeoplossing die fosfataseremmers bevat.
- Was de cellen 3 keer met PBS en broed vervolgens in met de blokkerings-/permeabilisatiebuffer (BSA 5%, Triton X-100 0,5%, 1x fosfataseremmer) gedurende 1 uur.
- Incubeer met anti-pCREB antilichaam 1:500 (in 3% BSA, 0,1% Triton X-100) 's nachts bij 4 °C.
- De volgende dag was je 3 keer met 1x PBS en broed gedurende 1 uur met het secundaire antilichaam 1:500 (3% BSA, 0,1% Triton X-100).
- Was 3 keer met 1x PBS. Voeg Hoechst nucleaire vlekoplossing (5 μg/mL) gedurende 7 minuten toe.
- Was 3 keer met 1x PBS en mount.
- Visualisatie van retrograde axonaal transport van BDNF-QD in levende neuronen
- Bereid microfluïde kamers en zaadneuronen zoals eerder beschreven16.
- Na 7-8 dagen in cultuur, verander het medium naar niet-aangevuld neurobasaal medium.
- Bereid mbtBDNF conjugated aan quantum dots (BDNF-QD) door toe te voegen aan een mbtBDNF aliquot, het noodzakelijke volume van quantum dot streptavidin conjugaat (streptavidin-QD) om een 1:1 BDNF-QD molaire verhouding te bereiken. Verdun vervolgens tot 20 μL met neurobasaal medium. Wikkel de buis in aluminiumfolie om het te beschermen tegen het licht.
OPMERKING: Bereid een andere buis met hetzelfde volume van quantum dot streptavidin conjugaat en verdun het tot 20 μL met neurobasaal medium als een controle. - Incubeer het mbtBDNF/ streptavidin-QD mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een rocker.
- Verdun de BDNF-QD tot de gewenste uiteindelijke concentratie (2 nM).
- Na 1 uur incubatie met niet-aangevuld neurobasaal medium voeg de BDNF-QD of het controlemengsel toe aan de axonale compartimenten van de microfluïde kamer. Incubeer gedurende 210 min bij 37 °C om een netto retrograde transport van BDNF-QD te garanderen.
- Voor live-cel beeldvorming, visualiseer axonale retrograde transport in het segment van de microgrooves dat proximaal is naar de cel lichaam compartiment met behulp van een 100x doelstelling met behulp van een microscoop geschikt voor dit doel (37 °C en 5% CO2). Afbeeldingen verkrijgen bij 1 frame/s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gebruik van een chromatografisch kolomgebaseerd protocol maakt de verwerking van aanzienlijke hoeveelheden HEK293 geconditioneerde media mogelijk. In figuur 1worden de resultaten van de zuivering van BDNFAvi uit 500 mL geconditioneerde media weergegeven. Opeenvolgende elutions van BDNFAvi van de Ni-NTA agarose kralen leveren afnemende concentraties van BDNFAvi (Figuur 1A). Na vier opeenvolgende elutions (elk van 15 minuten), wordt het grootste deel van het BDNF gevangen door de kralen teruggewonnen. De concentraties van de eluaten variëren van 6 tot 28 ng/μL en de totale opbrengst bedroeg ongeveer 60 μg BDNFAvi (tabel 1). De geproduceerde BDNFAvi werd vervolgens efficiënt biotinylated door een in vitro reactie bemiddeld door BirA-GST, zoals blijkt uit het ontbreken van niet-biotinylated BDNFAvi in de supernatant (Figuur 1B). Houd er rekening mee dat de biotinylation in figuur 1B overeenkomt met een aliquot van het totale geproduceerde BDNF, maar de reactie kan worden opgeschaald voor grotere volumes.
Vervolgens werd de biologische activiteit van mbtBDNF geëvalueerd aan de hand van 2 verschillende experimentele benaderingen. Ten eerste werden corticale neuronen gezaaid in 60 mm platen (2 miljoen neuronen, DIV7) gestimuleerd met 50 ng/mL mbtBDNF gedurende 30 minuten, waarna eiwitten werden bereid voor westerse vlekanalyse. De biologische activiteit van het mbtBDNF werd gekwantificeerd door het detecteren van pTrkB (Y515) en pERK (T202/Y204). Binding van BDNF aan TrkB activeert de activering van de receptor via een autofosfolingsreactie in zijn intracellulaire domein, en ERK is een bekend doelwit van de BDNF signaleringsroute22. De banden voor beide fosforyleerde eiwitten hadden een vergelijkbare intensiteit in neuronen behandeld met commerciële BDNF en mbtBDNF, en beide toonden een sterker signaal dan controle conditie (Figuur 2A). Vervolgens werd de biologische activiteit van mbtBDNF gekoppeld aan streptavidin-QD geëvalueerd om aan te tonen dat ze kunnen worden gebruikt in experimenten met live beeldvorming. Corticale neuronen werden gezaaid in 10 mm covers (40.000 cellen per cover, DIV7) en behandeld met een uiteindelijke concentratie van 200 pM of 2 nM BDNF-QD gedurende 30 minuten alvorens pCREB te bevestigen en te bevlekken. CREB is een transcriptiefactor die het doelwit is van geactiveerde ERK1/2 in corticale neuronen22,23. Stimulerende neuronen met toenemende concentraties BDNF-QD resulteerden in een dosisafhankelijke toename van de fosforylatie van CREB en de aanwezigheid van QD-deeltjes rond de kern (Figuur 2B), wat aangeeft dat de BDNF-QD-deeltjes werden geïndocytoseerd en de activering van signaleringstrajecten in verband met BDNF-gemedieerde TrkB-activering geactiveerd. Een tweevoudige toename van pCREB-signaal werd gedetecteerd bij het stimuleren van neuronen met een lage concentratie van BDNF-QD (200 pM), terwijl stimuleren met 2 nM resulteerde in een 3,5-voudige toename van het pCREB-signaal(figuur 2C). Deze resultaten tonen aan dat de gebiotinyleerde BDNFAvi biologisch actief is, en dat het zijn activiteit niet verliest wanneer het wordt gekoppeld aan streptavidin-QD, waardoor het geschikt is voor immunofluorescentie en live celbeeldvorming.
Ten slotte werd het beeldvormingspotentieel van BDNF-QD geëvalueerd in gecompartimenteerde culturen met behulp van microfluïde kamers. Corticale neuronen werden gezaaid in microfluïde kamers (15 mm covers, 50.000 neuronen per microfluïde kamer, DIV7) om de axonale en somatodendritische compartimenten te scheiden en werden gestimuleerd met 2 nM BDNF-QD voor 3,5 h. Live celmicroscopie werd uitgevoerd, en de resulterende kymografen werden gebruikt om de snelheid van BDNF-QD met organelles te kwantificeren (Figuur 3A). Er werd een gemiddelde voortschrijdende snelheid van 0,91 μm/s gedetecteerd (figuur 3B), wat in overeenstemming is met eerdere analyses van cytoplasmisch dyneïneïnegerig transport7,16. Microfluidic kamers behandeld met 2 nM streptavidin-QD toonde geen bewegende QDs in de microgrooves, zoals blijkt uit de kymograaf (Figuur 3A). Cellen die onder dezelfde omstandigheden werden gekweekt, werden gedurende 210 minuten gestimuleerd met 500 pM of 2 nM BDNF-QD, en vervolgens gefixeerd en geëtiketteerd met een nucleaire kleuring. Zoals blijkt uit figuur 3C,tonen neuronen een dosisafhankelijke accumulatie van BDNF-QD in alle geanalyseerde subcompartimenten, inclusief de proximale en distale delen van de microgroove en het somatodendritische compartiment. In tegenstelling, controle neuronen toonde bijna geen QD-signaal in de kamer. Daarom kan de BDNF-QD worden gedetecteerd in levende en vaste cellen in microfluïde kamers.
Figuur 1: Productie en monobiotinyleratie van BDNFAvi in HEK293 cellen. HEK293 cellen werden doorgetransfecteerd met behulp van de PEI reagens en een BDNFAvi codering plasmid en de geconditioneerde media werd verzameld na 48 h. BDNFAvi bevat een 6x Histidine tag waardoor zuivering met behulp van nikkel-nitrilotriacetic zuur (Ni-NTA) chromatografie. Commercieel beschikbare recombinant menselijke BDNF heeft een verwacht moleculair gewicht van ~ 13 kDa, terwijl BDNFAvi een moleculair gewicht van ~ 18 kDa toont. BDNFAvi gebonden aan de hars werd volledig eluted met vier opeenvolgende elution stappen. (A) Westerse vlek met behulp van anti-BDNF-antilichamen om in eigen huis voorbereide recombinant BDNF en commercieel BDNF op te sporen. Aliquoten die bekende hoeveelheden commercieel beschikbare menselijke BDNF en 5 μL van elk eluaat bevatten, werden in een SDS-PAGE gel geladen voor de detectie van BDNFAvi met behulp van een antilichaam tegen BDNF. Tabel 1 geeft de concentraties van BDNFAvi in elk eluaat aan. De hoeveelheid en de concentratie van BDNF in elk eluaat werd verkregen door densitometrische analyse en interpolatie uit de concentratiecurve van commercieel verkrijgbaar BDNF. (B) Verificatie van de biotinyleratie van BDNFAvi. Tachtig nanograms biotinylated BDNFAvi (mbtBDNF) werden geïncubeerd met 30 μL streptavidin gekoppeld aan magnetische kralen (20% drijfmest) gedurende 1 uur bij 4 °C. Vervolgens werden magnetische kralen geïsoleerd met behulp van een magnetische afscheider. De streptavidin kralen werden verwarmd met laadbuffer om de biotinylated BDNFAvi (kralen lane) te ontwijken. De supernatant (SN lane) werd ook behandeld met laadbuffer, verwarmd en geladen in de gel (SN lane). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Verificatie van de biologische activiteit van mbtBDNF. (A) DIV7-corticale neuronen zijn gedurende 1 uur uitgehongerd, en vervolgens gestimuleerd met 50 ng/mL commercieel verkrijgbare BDNF of mbtBDNF gedurende 30 min. Eiwitten werden geëxtraheerd en geladen in een SDS-PAGE gel voor analyse van TrkB en ERK1/2 fosforylatie met behulp van fosfo-specifieke antilichamen en vergeleken met de totale niveaus van het eiwit met antilichamen tegen totale TrkB en ERK1/2. (B) DIV7 corticale neuronen werden serum uitgehongerd voor 1 uur, en vervolgens gestimuleerd met een laatste concentratie van 200 pM of 2 nM mbtBDNF gekoppeld aan streptavidin-QD (BDNF-QD) gedurende 30 min. Vervolgens werden cellen gefixeerd en werd pCREB geëtiketteerd voor fluorescentiemicroscopieanalyse. cC) Kwantificering van de fluorescentieintensiteit van de kernpCREB. De resultaten komen overeen met 90 neuronen samengevoegd uit 3 onafhankelijke experimenten, weergegeven als gemiddelde ± SEM. De statistische analyse komt overeen met een eenrichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey (****p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Visualisatie van BDNF-QD in levende en vaste cellen. (A) DIV7 corticale neuronen gekweekt in microfluïde kamers werden gestimuleerd in het axonale compartiment met een laatste concentratie van 2 nM BDNF-QD gedurende 3,5 uur, waarna het proximale gedeelte van de microgrooves werd afgebeeld met behulp van een live celmicroscopie. Representatieve kymografen voor controleconditie (behandeld met streptavidin-QD) en bij behandeling met BDNF-QD worden getoond. (B) Kwantificering van de snelheid van het verplaatsen van BDNF-QD. Mobiele puncta werden gedefinieerd als puncta's die meer dan 10 μm bewogen in de 120 s van de opname. (C) DIV7-corticale neuronen die in microfluïde kamers worden gekweekt, werden in het axonale compartiment gestimuleerd met een laatste concentratie van BDNF-QD van 500 pM of 2 nM gedurende 3,5 uur, en vervolgens vastgezet en geëtiketteerd met Hoechst om de kernen te visualiseren. Representatieve beelden van het somatodendritische compartiment en de distale en proximale delen van de microgrooves worden getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Eluaat | BDNF (ng) in 5μl | [ng/μl] | Totaal BDNF [μg] |
| E1 E1 | 142.2 | 28.4 | 28.4 |
| E2 | 101.2 | 20.2 | 20.2 |
| E3 E3 | 65.6 | 13.1 | 13.1 |
| E4 E4 | 30.4 | 6.1 | 6.1 |
| 67.8 |
Tabel 1: Kwantificering van de zuiveringsopbrengst van BDNFAvi (gerelateerd aan fig. 1A). HEK293 cellen werden getransfecteerd met een plasmi rijdende BDNFAvi expressie, en het eiwit werd gezuiverd door Ni-NTA affiniteit chromatografie. De eiwitconcentratie en de uiteindelijke opbrengst werden berekend door densitometrische analyse en interpolatie in de bekende concentratiecurve van commercieel verkrijgbaar recombinant human BDNF.
Supplemental File 1: Cultuur media en buffer componenten Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel wordt een geoptimaliseerde methodologie beschreven voor de productie en zuivering van mbtBDNF in een op affiniteit chromatografie gebaseerde procedure, gebaseerd op het werk van Sung en medewerkers17. De optimalisaties omvatten het gebruik van een kosteneffectieve transfectie reagens (PEI) met behoud van de efficiëntie van duurdere transfectie methoden zoals lipofectamine. Deze optimalisatie vertaalt zich in een aanzienlijke kostenbesparing in het protocol, waardoor schaalbaarheid mogelijk is met behoud van hoge kosteneffectiviteit. Het protocol bevat ook gebruiksgemak overwegingen, met inbegrip van het bevriezen van geconditioneerde media voor maximaal 2 maanden. Deze optimalisaties maken de procedure aanpasbaar aan de behoeften van elk laboratorium, verbeteren de kosteneffectiviteit en leveren homogene en biologisch actieve recombinant BDNF op. Het protocol kan ook worden aangepast aan kleinere producties door het gebruik van het chromatografieapparaat te vervangen door gravitatieneerslag van de kralen in conische buizen. Dit vormt een haalbare methodologie, maar het is minder tijd-efficiënt en heeft geresulteerd in lagere opbrengsten in onze ervaring. De biotine-gelabelde BDNF kan vervolgens worden gekoppeld aan verschillende streptavidin-gebonden sondes, met inbegrip van fluoroforen en paramagnetische nanodeeltjes, waardoor het een waardevol instrument om verschillende soorten experimenten uit te voeren voor de analyse van BDNF post-endocytische handel. Daarom is een geoptimaliseerd en eenvoudig productieprotocol voor dit eiwit zeer nuttig voor laboratoria die op dit gebied werken.
De productie van recombinante eiwitten met complexe post-translationele modificaties, zoals BDNF24, in prokaryotische systemen resulteert vaak in eiwitten die niet correct zijn gevouwen en dus een slechte biologische activiteit hebben25. Daarom is expressie in zoogdiercellen noodzakelijk om een bioactief eiwit te verkrijgen. Het gebruik van PEI werd eerder beschreven als een levensvatbaar alternatief voor grootschalige productie van recombinanteiwitten in getransfecteerde zoogdiercellen25,26, en de efficiëntie ervan in de transfectie van de HEK293-cellen in de context van academische laboratoria is gemarkeerd27. Daarom is het gebruik van deze cellijn een geldige optie om BDNFAvi te produceren op een schaal die kan worden beheerd door een academisch laboratorium. Het voorgestelde protocol zou verder kunnen worden geoptimaliseerd door de generatie van een HEK293-cellijn die stabiel is doorgeschoop met BDNFAvi, waardoor de tijdelijke transfectiestap zou worden geëlimineerd, waardoor tijd en middelen worden bespaard. Een andere potentiële bron van optimalisatie is het gebruik van cellen in suspensie in plaats van aanhangende cellen. HEK293 cellen kunnen worden gehandhaafd in suspensie, het genereren van aanzienlijke hoeveelheden recombinant eiwit in het bereik van grammen per liter28.
Een andere verbetering van het protocol is de biotinylation van het BDNFAvi-eiwit met behulp van een in vitro-strategie, ter vervanging van het vorige in vivo co-transfectieprotocol. Tijdelijke co-transfectie kan onverwachte resultaten hebben in termen van de expressie van de constructen, zoals is aangetoond in meerdere cellijnen en met verschillende transfection reagentia29. Verschillende factoren kunnen de expressie van transfected eiwitten beïnvloeden in een co-transfectiecontext, waaronder vectoren, celtypen en plasmideconcentratie. Deze veelheid aan factoren maakt optimalisatie en reproduceerbaarheid tot een complexe taak. Anderzijds zorgt een in vitro-methodologie voor een betere controle over de omstandigheden waarin de biotinylation-reactie plaatsvindt. Deze methodologie resulteert in reproduceerbare en homogene etikettering van recombinant BDNF.
Zoals blijkt uit de experimenten met de verificatie van biologische activiteiten, is het mbtBDNF dat met dit protocol wordt geproduceerd vergelijkbaar met commercieel beschikbare recombinant human BDNF in termen van BDNF-TrkB signaleringsroute activering. De gegevens tonen ook aan dat het koppelen van BDNF aan streptavidin-QD niet interfereert met BDNF-TrkB signalering. Daarnaast hebben we aangetoond dat BDNF-QD kan worden gedetecteerd door epifluorescentiemicroscopie in levende en vaste cellen. Daarom is mbtBDNF een waardevol instrument voor het bestuderen van retrograde axonale handel en het biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van alternatieve sondes, zoals BDNF-GFP16. Het protocol beschreven in dit artikel biedt een betrouwbare en consistente methodologie voor de productie van mbtBDNF, die vervolgens kan worden gebruikt in post-endocytische dynamica studies in verschillende neuronale modellen uitdrukken TrkB of p75. BDNF signalering heeft krachtige effecten op neuronale morfologie en functie3,4,21, en is onlangs voorgesteld als een potentieel therapeutisch instrument om neuronale regeneratie30,31te verbeteren , waardoor de studie relevant is op het gebied van cellulaire biologie en biogeneeskunde. De studie van de effecten van BDNF signalering en mensenhandel zal ons begrip van neuronale celbiologie verder bevorderen en kan het mogelijk maken om het regeneratieve potentieel ervan in klinische omgevingen te benutten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen dankbaar financiële steun van Fondecyt (1171137) (FCB), het Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), de Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) en een Uk Dementia Research Institute Foundation award (GS). Dit werk werd ondersteund door de Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
- Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
