Summary
רקומביננטי BDNF המכיל רצף Avi (Bdnפאבאני) מופק בתאים HEK293 באופן חסכוני ומטוהר על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. לאחר מכן BDNFavi באופן ישיר מונו-biotinylated עם בירה אנזים בשפופרת. Bdn, ו מונו-biotinylbdni שמירה על הפעילות הביולוגית שלהם בהשוואה BDNF זמין מסחרית.
Abstract
רקומביננטי BDNF המכיל רצף Avi (Bdnפאבאני) מופק בתאי HEK293 ולאחר מכן מטוהרים ביעילות על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. פרוטוקול התפתחות פותחה כדי ישירות מונו-biotinylate אוחר Bdn, עם בירה אנזים בצינור. בתגובה זו, שומרת על הפעילות הביולוגית של מונו-ביוטיליס.
Neurotrophins הם מטרה נגזר גורמי הצמיחה לשחק תפקיד בפיתוח עצבי ותחזוקה. הם דורשים מנגנוני הובלה מהירה לאורך השביל endocytic כדי לאפשר איתות למרחקים ארוכים בין תאים עצביים שונים. התפתחות של כלים מולקולריים כדי ללמוד את הסחר של neurotrophins אפשרה מעקב מדויק של חלבונים אלה בתא באמצעות הקלטה vivo . בפרוטוקול זה פיתחנו הליך מיטבי וחסכוני לייצור BDNF מונו-biotinylated. משתנה bdnf רקומביננטי המכיל רצף avi biotinylable (bdnפאבאני) מופק בתאי HEK293 בטווח יקרוגרם ולאחר מכן מטוהרים בהליך מדרגי בקלות באמצעות כרומטוגרפיה זיקה. BDNF מטוהרים לאחר מכן יכול להיות מונו הומוגנזיס ביולוגי על ידי תגובה ישירה באמצעות מבחנה עם בירה אנזים בצינור. הפעילות הביולוגית של BDNF מונו-biotinated (mbtBDNF) יכול להיות מצומדת כדי streptavidin-מעלה מעלה לתוך fluorophores שונים. BDNFAvi ו בmbtbdnf לשמור על הפעילות הביולוגית שלהם הפגינו באמצעות זיהוי של מטרות זרחתי במורד הזרם באמצעות הכתם המערבי והפעלה של מקדם שעתוק CREB, בהתאמה. באמצעות streptavidin-הנקודות הקוואנטום, היינו מסוגלים לדמיין את הקשר באמצעות הפנמה במקביל עם ההפעלה של CREB, אשר זוהה עם נוגדן מסוים פוספהו-CREB. בנוסף, mbtBDNF מעלה מצועם streptavidin-הנקודות הקוונטיות היה מתאים לניתוח הובלה נסיגה בנוירונים בקליפת הבית הגדול בתאי מיקרופלואידיג. כך, בצינור המיוצר mbtBDNF הוא כלי אמין כדי לחקור את הדינמיקה של איתות פיזיולוגי אנדוכמה וסחר בנוירונים.
Introduction
נוירונים הם יחידות תפקודית של מערכת העצבים בעל מורפולוגיה מורכבת ומיוחדת המאפשרת תקשורת סינפטית, ולכן, הדור של התנהגות מתואמת ומורכבת בתגובה לגירויים שונים. התחזיות הנוירואליות כגון דנדריטים ואקאונים הן תכונות מבניות קריטיות המעורבות בתקשורת עצבית, ונוירוטרופלנים הם שחקנים קריטיים בקביעת המבנה והתפקוד שלהם1. Neurotrophins הם משפחה של גורמי צמיחה מופרש הכוללים NGF, NT-3, NT-4, ואת המוח נגזר neurotrophic factor (BDNF)2. במערכת העצבים המרכזית (cn), bdnf משתתפת בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל neurotransmission, הארבוריזציה הדנדריטי, התבגרות של השדרה הדנדריטי, פוטנציאל לטווח ארוך, בין השאר3,4. לכן, BDNF משחק תפקיד קריטי בוויסות תפקוד עצבי.
תהליכים סלולאריים שונים מווסת דינמיקה BDNF ותפקוד. על פני השטח העצבי, BDNF מאגד את הקולטן הטרופויוסין קינאז B (TrkB) ו/או קולטן נוירוטרופין p75 (p75). Bdnf-trkb ו-bdnf-p75 מתחמי הם מסודרים וממוינותבתוךמערכות endocytic שונים 5,6,7,8. תקן סחר תאיים של מתחם bdnf/trkb נדרש עבור איתות bdnf נאות במעגלים עצביים שונים9,10,11. מסיבה זו, הבנה עמוקה של הדינמיקה הסחר BDNF ושינויים שנמצאו בתהליכים pathפסלוגיים הוא חיוני כדי להבין את האיתות BDNF בריאות ומחלות. התפתחות הרומן והכלים המולקולריים הספציפיים לניטור תהליך זה יסייעו לנהוג בשדה זה קדימה ולאפשר תפיסה טובה יותר של מנגנוני הרגולציה המעורבים.
ישנם מספר כלים זמינים למחקר של סחר BDNF בנוירונים. מתודולוגיה בשימוש נפוץ כוללת את הרקומביננטי bdnf מתויג עם מולקולות פלורסנט כגון חלבון פלורסנט ירוק (gfp) או הווריאציה monomeric אדום העביר המשתנה של gfp mcherry12,13. עם זאת, קיצור מרכזי של ביטוי overdnf הוא שזה מבטל את האפשרות של אספקת ריכוזים ידועים של נוירוטרופין זה. כמו כן, זה עלול לגרום רעילות הסלולר, מטשטש את הפרשנות של תוצאות14. אסטרטגיה חלופית היא העברה של מעבר החצייה של TrkB מתויג, כגון דגל-TrkB. מתודולוגיה זו מאפשרת ללמוד את הדינמיקה של TrkB הפנמה15, אבל זה כולל גם העברה, אשר עשוי לגרום לתפקוד שונה trkb ורעילות הסלולר. כדי להתגבר על מכשולים מתודולוגיים אלה, רקומביננטי משתנים של ngf ו bdnf המכיל רצף Avi (bdnפאבאני), אשר יכול להיות מונו-biotinated על ידי ביוטין-ligase אנזימים בירה, פותחו16,17. Biotinylated רקומביננטי BDNF יכול להיות מצמידים כלים שונים מאוגד streptavidin, אשר כוללים fluorophores, חרוזים, חלקיקים פאראמגנטים בין היתר לאיתור. מבחינת הדמיה של תא חי, נקודות הקוונטים (QD) הפכו לעתים קרובות fluorophores, כפי שהם מאפיינים רצוי עבור מעקב יחיד חלקיק, כגון בהירות מוגברת ועמידות הלבנת כאשר לעומת מולקולה קטנה fluorophores18.
הייצור של מונו-biotinylated BDNF (mbtBDNF) באמצעות Bdnפאבאני הושגה על ידי העברת שיתוף של פלמידים הנהיגה ביטוי של Bdnפאבאני ובירה, ואחריו טיהור של חלבון רקומביננטי על ידי כרומטוגרפיה של אהדה עם תשואה של 1-2 μg של BDNF ל 20 מ ' של מדיה תרבותית ממוזגת17. כאן, אנו מציעים שינוי של פרוטוקול זה המאפשר את טיהור BDNFAvi מ 500 mL של מדיה ממוזג, אשר מבקש למקסם את ההתאוששות מחלבון בפרוטוקול מבוסס טור כרומטוגרפיה על קלות מניפולציה. הסוכן המשמש לזיהום, פוליאתילן, מבטיח שיטה חסכונית מבלי להקריב את התשואה החוצה. הצעד מונו-ביולציה הותאם לתגובת חוץ גופית כדי למנוע את הסיבוכים הקשורים בשיתוף פעולה ולהבטיח תוויות הומוגנית של BDNF. הפעילות הביולוגית של mbtbdnf הוכח על ידי כתמי המערבי וניסויים מיקרוסקופ פלואורסצנטית, כולל הפעלת pcreb ולחיות הדמיה תא ללמוד הובלה סיבי הנסיגה של bdnf בתאי microfluidic. השימוש בפרוטוקול זה מאפשר מיטוב, ייצור תשואה גבוהה של מונו הומוגנית-biotinylated ו פעילים ביולוגית BDNF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המאושרות של CONICYT (הנציבות הלאומית של צ'ילה למחקר מדעי וטכנולוגי). הפרוטוקולים ששימשו במחקר זה אושרו על ידי ועדות הביוסקיוריטי והביואתיקה ובעלי החיים של האוניברסיטה האפיפיורית קתליקה דה צ'ילה. הניסויים הכרוכים בבעלי חוליות אושרו על ידי ועדת הרווחה של ביואתי ובעלי החיים של האוניברסיטה האפיפיורית קתליקה דה צ'ילה.
הערה: הפרוטוקול הבא נועד לטהר את BDNFAvi מתוך נפח כולל של 500 mL של בינוני ממוזג המיוצר בתאי HEK293. כמות המדיום הממוזג המיוצר ומעובד כדי לטהר את BDNFAvi יכול להיות למעלה או להוריד את קנה המידה לפי הצורך. עם זאת, אופטימיזציה נוספת עשויה להיות נחוצה בנסיבות אלה. ניתן למצוא את הרכב המדיה התרבותית והמאגרים הנמצאים בשימוש בכל הפרוטוקול בחומרים משלימים.
1. ייצור וטיהור של BDNFAvi מתוך מדיה ממוזגת HEK293
- העברה של תאי HEK293
- לגדול HEK293 תאים 70% המפגש בתוספת DMEM בינונית (10% בסרום העובר, 1 x מגלוטמט מוסף, 1x אנטיביוטי/antimycotic) ב 15 ס מ מנות התרבות ב 37 º C.
- שנה את המדיה הבינונית לחוצץ.
- הכן את תערובת הדי. אנ. איי. לזיהום העור השתמש בשני שונים 15 מ ל צינורות חרוטי כדי לדלל דנ א ו פיי 40 K, בהתאמה. לדלל 20 μg של DNA פלמיד בנפח הסופי של 500 μL בשפופרת אחת. לדלל 60 μg של ליניארי פיי 25K בנפח הסופי של 500 μL בצינור השני. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
- מערבב בזהירות את פתרון הדי-אן-איי. בצינור פיי, ערבוב פעם אחת בתנועה דגירה בטמפרטורת החדר עבור 25 דקות.
- טפטוף 1 מ ל של התערובת הפיי-די-אן-איי במהלך כל 15 ס מ המנה. מודיית את התאים עם התערובת פיי-די-אן במשך 3 שעות ב 37 º C.
- לשנות את המדיום לחיץ הדגירה טרי.
- איסוף ואחסון מדיה
- לאסוף את המדיום מכל הצלחות 48 h לאחר הגלגול של תאים HEK293. הכינו מלאי מרוכז של הפתרונות המתוארים בסעיף "מאגר השינויים supernatant" של קובץ משלים 1 והוסיפו אותם ל-HEK293-הסופראנט כדי להשיג את הריכוזים הסופיים המפורטים.
הערה: ניתן להיפטר מתאים או לשחזר אותם לצורך ניתוח נוסף. - מודאת המדיום בקרח עבור 15 דקות.
- מחלקים את המדיום לתוך צינורות צנטריפוגה.
- צנטריפוגה את המדיום ב 10,000 x g עבור 45 דקות בצנטריפוגה 4 ° c. שלב זה מאפשר חיסול של פסולת תא ותאים מתים המושהים במדיה.
- לאסוף את הסופרנטנים, להוסיף BSA בריכוז הסופי של 0.1%. ולאחר מכן לאחסן ב-20 ° c. התקשורת יכולה להיות מצוטט לפני הקפאה על הפשרה מהר יותר במהלך שלב הטיהור.
הערה: זמני אחסון של מדיה ממוזגת הקפואה של עד 2 חודשים הניבו תוצאות חיוביות, שעות אחסון ארוכות יותר לא הוערכו.
- לאסוף את המדיום מכל הצלחות 48 h לאחר הגלגול של תאים HEK293. הכינו מלאי מרוכז של הפתרונות המתוארים בסעיף "מאגר השינויים supernatant" של קובץ משלים 1 והוסיפו אותם ל-HEK293-הסופראנט כדי להשיג את הריכוזים הסופיים המפורטים.
- ריכוז וטיהור מדיה
- הפשרת אמצעי התקשורת באמבט של 37 ° c.
- . מחלקים את המדיה לצינורות הצנטריפוגה
- צנטריפוגה את המדיום עבור 1 h ב 3,500 x g ב 4 מעלות צלזיוס צנטריפוגה מקורר. שלב זה מאפשר חיסול של פסולת התא הנותרים כדי להבטיח זרימה נאותה דרך העמודה כרומטוגרפיה.
- השתמש בריכוז חלבון עם הפסקת kDa 10 כדי להפחית את התקשורת מ 500 mL ל 100 mL. בצע את הפרמטרים הצנטריפוגה המומלצים של היצרן לצורך ריכוז אופטימלי.
- הוסף 500 μL של Ni-נ. ת. ד. חרוזים למדיה מרוכזת ו מודדת לילה ב 4 ° c ב נדנדה.
- הכנס את מכשיר הכרומטוגרפיה ושפוך את המדיה לתוכו. תן לו לנוח 5 דקות ולאחר מכן לפתוח את 2-הדרך רזלים תרנגול לתת את המדיום לזרום.
- לשטוף את החרוזים עם 5 מ ל של מאגר לשטוף עבור 5 דקות. הקפד להשהות מחדש את החרוזים בעמודה. לנקז את מאגר לשטוף ידי פתיחת הפקק 2-כיוון. . אני חוזר 3 פעמים
- הוסף 1 mL של מאגר הימנעות לעמודה. הקפד להשעות מחדש את החרוזים בעמודה. דגירה של 15 דקות, ולאחר מכן לאסוף את החומקת בשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. חזור על שלב זה 3 פעמים עבור הימנעות מוחלטת של BDNFAvi.
- טען 5 μL של כל משחרו ריכוזים שונים של BDNF זמין מסחרית (40-160 ng) ב 15% פוליאקרילאמיד ג'ל. לזהות את החלבון הטהור על ידי הכתמים המערביים באמצעות נוגדן אנטי BDNF.
- לקבוע את הריכוז של BDNFAvi מטוהרים בכל להתחמק באמצעות עקומת ריכוז מוכן עם BDNF זמין מסחרית.
- הורדה ואחסון של BDNFAvi מטוהרים ב-80 ° c.
2. בתוך מונו-ביוקטילציה של BDNFAvi באמצעות אנזים בירה
-
תגובת מונו-ביונילציה מחוץ למבחנה
- הכנת פתרונות מלאי מרוכזים של ריאגנטים מאגר biotinylation. השימוש במניות מרוכז יצמצם את הדילול של החלבון הרקומביננטי.
- לקחת סדרת מחלקים 800 ng של bdnfavi ולהוסיף את מאגר ביולציה ריאגנטים ואת בירה האנזים ביחס הטוחנת 1:1 bdnf. לדוגמה, עבור הוספת נפח תגובה סופי של 200 μL; 100 μL של פתרון המכיל 800 ng של BDNFAvi, 20 μL Bicine 0.5 M pH 8.3, 20 μL ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100 mM, 20 μL d-biotin 500 μM, 0.8-1 μg עד 1 μL של בירה-GT, והשלם כדי 200 μL עם מים באולטרסאונד.
הערה: התגובות biotinylation מוצלחת בוצעו עם aliquots של 400 μL המכיל ריכוז של כ 30 ng/μL BDNFAvi, וכתוצאה מכך bdnfavi באופן הומוגנטי ביולוגי לריכוז הסופי של ~ 20 ng/μL בתגובה הסופית. - מודקון את התערובת ב 30 ° c בתנור הכלאה עבור 1 h. לערבב את התוכן על ידי היפוך צינור כל 15 דקות.
- הוסף את אותו כמות של ATP ובירה כמו בשלב 2.1.2 וחזור על 2.1.3 שלב.
- חנות ב-80 ° צ' לניתוחים עתידיים או לשמור על קרח לשימוש מיידי (לדוגמה, בקרת איכות biotinylation).
- ניתוח ביוטילציה
- בלוק 30 μL של חרוזים מגנטיים streptavidin לדגימת BDNF ב 1 mL של חסימת מאגר. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 h בתוך מסובבי הצינורית מיקרוצנטריפוגה.
- מזרז את החרוזים המגנטיים באמצעות מתלה הפרדה מגנטי במשך 3 עד 5 דקות או עד שהמאגר מופיע נקי לחלוטין מהחרוזים ומתעלם מהמאגר החוסם.
- הוסף 50 μL של מאגר חסימות טרי ו 80 ng של מונו-biotinylated BDNFAvi (mbtBDNF) לדגום את החרוזים, והקפד להשעות אותם לגמרי על ידי ביצוע.
- מודטה ב 4 ° c עבור 1 h בתוך מסובבי הצינורית מיקרוצנטריפוגה מסתובב כ 20 סל ד.
- לאסוף את החרוזים באמצעות מתלה ההפרדה המגנטי עבור 3 כדי 5 דקות, ולאסוף את supernatant, שמירה על 30 μl סדרת מחלקים לניתוח.
- לשטוף את החרוזים פעם אחת עם 500 μL של PBS, ולאחר מכן לאסוף אותם באמצעות מתלה ההפרדה המגנטי עבור 3 כדי 5 דקות. שחזר את הסופרנטאנט ושמור 30 μL לניתוח.
- הוסף 10 μL של מאגר טעינת 4x לחרוזים.
- מחממים את הדגימות עד 97 ° c במשך 7 דקות כדי לעבור את מתחת לשעון.
- זיהוי מmbtbdnf באמצעות נוגדן אנטי-BDNF מסוים19.
3. אימות הפעילות הביולוגית של בmbtbdnf
- זיהוי של pTrkB והטבה באבן חשופה מערבית.
- זרעי 2,000,000 מנות לתרבות הקליפת העצב בשנת 60 מ"מ.
- תרבות הנוירונים במשך 7 ימים (DIV7). לאחר מכן, לשנות את המדיום מדיה נוירובסיס שאינם בתוספת בעת הפעלת הניסוי.
- שעה אחת לאחר שינוי בינוני, להוסיף mbtBDNF לריכוז סופי של 50 ng/mL. מודקון למשך 30 דקות ב 37 º C. שמור על צלחת שליטה שלילית (לא מגורה עם BDNF) ו צלחת בקרה חיובית (מטופלים עם 50 ng/mL של BDNF זמין מסחרית).
- לאסוף את המדיום ולשטוף בעדינות כל צלחת עם 1x PBS. לאסוף ולמחוק את ה-1x PBS.
- הניחו את הכלים על הקרח והוסיפו 50-80 μL של מאגר הליזה לכל מנה. השתמש במגרד התא כדי להפעיל את התאים.
הערה: יש לבצע את שלב הליזה במהירות האפשרית כדי למנוע התדרדרות והשפלה של חלבונים. 1-2 דקות של גירוד נמרץ מספיק כדי לדמיין את החלבונים של עניין על ידי בלוק המערבי. - לאסוף את מאגר הליזה ומערבבים במיקסר מערבולת במהירות הגבוהה ביותר עבור 5 s.
- צנטריפוגה את מאגר הליזה ב14,000 x g (4 ° c) עבור 10 דקות.. תאסוף את הסופרנטאנט
- מכמת את תכולת החלבון של סופרנטנט על ידי פרוטוקול בדיקת חלבון BCA20.
- הוסף מאגר טעינת כדי סדרת מחלקים המכיל 30-50 μg של חלבון לכל מצב ולטעון אותו ב 12% אלקטרופורזה ג'ל עבור בלוק מערבי. זיהוי pTrkB והטבה באמצעות פוספפו-נוגדנים ספציפיים כדי לאמת את הפעילות הביולוגית של BDNFAvi.
- אימות של פעילות ביולוגית של BDNF-QD על-ידי pCREB אימונוoforסנס.
- זרע 40,000 הנוירונים בקליפת העצב בתוך 10 מ"מ שמיכות, בעבר אוטוקלבד וטיפל עם פולי-L-ליזין כפי שמתואר בעבר21.
- תרבות הנוירונים ב7-8 ימים במאגר תחזוקה עצבי (ראה חומרים משלימים) ב 37 º C.
- כדי להתחיל את הניסוי, לשנות את המדיום לבטל בינוני נוירובסיס neurobasal ב 37 º C עבור 1 h.
- הכינו mbtBDNF מבצוחה לנקודות הקוונטים (BDNF-QD) על-ידי הוספה ל-mbtBDNF, הנפח הדרוש של נקודה קוונטית streptavidin המשלים (streptavidin-QD) כדי להשיג 1:1 BDNF-QD היחס הטוחנת. אז, לדלל 20 μL עם מדיום נוירובסיס. עוטפים את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני האור.
הערה: הכינו צינור אחר עם אותו כמות של נקודה קוונטית streptavidin המשלים ולדלל אותו 20 μL עם מדיום נוירוסיס כפקד שלילי. - מודחה את תערובת mbtBDNF/streptavidin-QD במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ברוקר.
- לדלל את BDNF-QD לריכוז הסופי הרצוי (200 pM ו 2 ננומטר) במדיום neurobasal סיס.
- לאחר 1 h של הדגירה עם בינונית נוירובסיס שאינם בתוספת, לעורר את הנוירונים עם BDNF-QD או streptavidin-QD (שליטה) לריכוז הסופי של 200 pM ו 2 ננומטר של BDNF עבור 30 דקות ב 37 ° c.
- לשטוף את שמיכות 3 פעמים עם 1x PBS (37 ° c) ולתקן את התאים עבור 15 דקות על ידי טיפול coverslips עם 4% הפתרון פאראפורמלדהיד המכיל מעכבי פוספספטאז.
- לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS, ולאחר מכן דגירה עם חסימה/חדירות מאגר (BSA 5%, טריטון X-100 0.5%, 1x פוספאטאז מעכבי) עבור 1 h.
- דגירה עם נוגדן anti-pCREB 1:500 (ב 3% BSA, 0.1% טריטון X-100) לילה ב 4 ° c.
- למחרת, לשטוף 3 פעמים עם ה-PBS 1x, ו הדגירה עבור 1 h עם הנוגדן המשני 1:500 (3% BSA, 0.1% טריטון X-100).
- לשטוף 3 פעמים עם 1 x PBS. הוסף הואכסט פתרון כתמים גרעינית (5 μg/mL) עבור 7 דקות.
- לשטוף 3 פעמים עם 1 x PBS ו הר.
- ויזואליזציה של התחבורה הרטרוגרלית של BDNF-QD ב נוירונים חיים
- הכינו תאי מיקרו-פלואידים ונוירונים בזרעים כמתואר בעבר16.
- לאחר 7-8 ימים בתרבות, לשנות את המדיום למדיום נוירובסיס שאינו בתוספת.
- הכינו mbtBDNF מבצוחה לנקודות הקוונטים (BDNF-QD) על-ידי הוספה ל-mbtBDNF, הנפח הדרוש של נקודה קוונטית streptavidin המשלים (streptavidin-QD) כדי להשיג 1:1 BDNF-QD היחס הטוחנת. אז, לדלל 20 μL עם מדיום נוירובסיס. עוטפים את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני האור.
הערה: הכינו צינור אחר עם אותו כמות של נקודה קוונטית streptavidin המשלים ולדלל אותו 20 μL עם מדיום נוירוסיס כפקד. - מודחה את תערובת mbtBDNF/streptavidin-QD במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ברוקר.
- לדלל את BDNF-QD לריכוז הסופי הרצוי (2 ננומטר).
- לאחר 1 h של דגירה עם בינוני נוירובסיס שאינו בתוספת להוסיף את bdnf-qd או את התערובת בקרת לתאי סיבי של החדר microfluidic. מודקון עבור 210 דקות ב 37 ° צ' כדי להבטיח הובלה נטו נסיגה של BDNF-QD.
- עבור הדמיה של תא חי, באופן חזותי העברת התחבורה בקטע של המיקרוחריצים הנמצאים בראש תא הגוף התא באמצעות מטרה 100x באמצעות מיקרוסקופ המתאים למטרה זו (37 ° צ' צלזיוס ו-5% CO2). לרכוש תמונות ב 1 מסגרת/s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השימוש בפרוטוקול מבוסס עמודות כרומטוגרפי מאפשר עיבוד של כמויות משמעותיות של מדיה ממוזגת HEK293. באיור 1, התוצאות של טיהור של BDNFAvi מ 500 mL של מדיה ממוזג מוצגים. הפרשות רצופות של BDNFAvi מ-Ni-נ. ת. ע. מחרוזת תשואה הפחתת ריכוזים של BDNFAvi (איור 1A). לאחר ארבע הפרשות רצופות (כל מתמשך 15 דקות), רוב BDNF שנתפסו החרוזים הוא התאושש. הריכוזים של הטווח להתחמק מ 6 כדי 28 ng/μL, ואת התפוקה הכוללת הסתכם כ 60 μg של BDNFAvi (טבלה 1). הופק BDNFAvi ביעילות לאחר מכן ביולוגית באופן ביולוגי על ידי תגובה מלאכותית בתיווך על ידי בירה-gt, כפי שהוכח על ידי חוסר biotinylated bdn, בתוך הסופרנטנט (איור 1b). הינכם מתבקשים לשים לב כי הביונילציה המוצגת באיור 1B מקבילה לסכום הכולל של BDNF המיוצר, אך ניתן לשנות את התגובה עבור כמויות גדולות יותר.
לאחר מכן, הפעילות הביולוגית של mbtBDNF הוערכו באמצעות 2 גישות נסיוניות שונות. ראשון, נוירונים בקליפת המין ה60 לוחות מילימטר (2,000,000 נוירונים, DIV7) היו מגורה עם 50 ng/mL של mbtBDNF עבור 30 דקות, ולאחר מכן חלבונים הוכנו לניתוח כתמי המערבי. הפעילות הביולוגית של ה-mbtBDNF הייתה כמותית על-ידי זיהוי pTrkB (Y515) והטבה (T202/Y204). איגוד של BDNF ל-TrkB מפעיל את הפעלת הקולטן באמצעות תגובה מראש במהלך הפעילות בתחום התאיים שלה, ו-טיפשה היא יעד ידוע של BDNF מסלול איתות22. הלהקות הן לחלבונים זרחתים בעלי עוצמה דומה בנוירונים שטופלו באמצעות BDNF מסחרי ו-mbtBDNF, ושניהם הראו אות חזק יותר מאשר בקרת מצב (איור 2A). לאחר מכן, הפעילות הביולוגית של mbtBDNF מצמידים streptavidin-QD הוערך כדי להדגים כי הם יכולים לשמש ניסויים הדמיה חיה. נוירונים (40,000 תאים לכל כיסוי, DIV7) ומטופלים עם ריכוז סופי של 200 pM או 2 ננומטר BDNF-QD עבור 30 דקות לפני תיקון וכתמים עבור pCREB. Creb הוא מקדם שעתוק אשר ממוקד על ידי מופעל ERK1/2 ב נוירונים נירמול22,23. מגרה נוירונים עם ריכוזים הגוברת של BDNF-QD הביא לעלייה תלויי מינון של זרחון של CREB ונוכחות של חלקיקים QD סביב הגרעין (איור 2B), המציין כי חלקיקים bdnf-qd היו endocytosed והפעיל את ההפעלה של מסלולים איתות הקשורים bdnf-תיווך trkb הפעלה. עלייה כפולה באות pCREB זוהה כאשר מגרה נוירונים עם ריכוז נמוך של BDNF-QD (200 pM), בעוד מגרה עם 2 ננומטר הביא עלייה 3.5 לקפל את האות pCREB (איור 2C). התוצאות הללו מדגימות כי BDNFAvi ביולוגי פעיל ביולוגית, וכי הוא אינו מאבד את פעילותה כאשר מצמידים ל-streptavidin-QD, מה שהופך אותו מתאים immunofluorescence והדמיה של תאים חיים.
לבסוף, הפוטנציאל להדמיה של BDNF-QD הוערך בתרבויות מידור באמצעות מיקרופלואידיג צ'יימברס. בתאי המיקרופלואידים (15 מ"מ כיסויים, 50,000 נוירונים לתאי מיקרופלואידיג, DIV7) כדי להפריד את התאים סיבי ו הסודנדריטי היו מגורה עם 2 ננומטר bdnf-qd עבור 3.5 h. מיקרוסקופ תא חי התבצע, ואת kymographs המתקבלים שימשו לכמת את המהירות של bdnf-qd המכילים אורגלים (איור 3a). מהירות נעה ממוצעת של 0.91 μm/s זוהתה (איור 3b), אשר בשורה עם ניתוחים קודמים של cytoplasmic dynein בתיווך התחבורה7,16. חדרי מיקרופלואידיג מטופלים עם 2 ננומטר streptavidin-QD לא הראו הזזת Qd ב מיקרוחריצים, כפי שמוצג על ידי kymograph (איור 3A). תאים שגדלו באותם תנאים היו מגורה עם 500 pM או 2 ננומטר BDNF-QD עבור 210 דקות, ולאחר מכן קבוע מתויג עם כתמים גרעיניים. כפי שמוצג באיור 3C, נוירונים מראים הצטברות מינון תלוי של BDNF-qd בכל משני התאים מנותח, כולל האבותיים הבית התחתון של מיקרוגרוב ואת התא הסודנדריטי. לעומת זאת, שליטה בנוירונים הראה כמעט שום אות QD ברחבי החדר. לכן, BDNF-QD ניתן להבחין בתאים חיים קבועים בתאי microfluidic.
איור 1: ייצור ומונו-ביוקטילציה של BDNFAvi בתאי HEK293. תאים HEK293 היו מזוהמים באמצעות מגיב פיי, ו בקידוד BDNFAvi והמדיה הממוזגת נאסף לאחר 48 h. BDNFAvi מכיל תג 6x Histidine המאפשר טיהור באמצעות ניקל-nitrilotriacetic חומצה (Ni-נ. ת. ע) כרומטוגרפיה. מסחרית זמין רקומביננטי BDNF האדם יש משקל מולקולרי צפוי של ~ 13 kDa, ואילו Bdnפאבאני מציג משקל מולקולרי של ~ 18 kDa. BDNFAvi ברוך השרף היה מחורץ לחלוטין עם ארבעה צעדים רצופים. (א) כתם מערביבאמצעות נוגדנים אנטי-bdnf לזהות בבית מוכן רקומביננטי bdnf ו bdnf מסחרי. אליבאטס המכיל כמויות ידועות של BDNF האדם זמין מסחרית ו 5 μL של כל משחרו העמיסו לתוך SDS-עמוד ג'ל לאיתור של Bdnפאבאני באמצעות נוגדן נגד BDNF. טבלה 1 מציינת את הריכוזים של BDNFAvi מציג בכל הללויה. הכמות והריכוז של BDNF בכל משחררי הושג על ידי ניתוח densi, אינטרפולציה מעקומת הריכוז של BDNF זמין מסחרית. (ב) אימות של ביוטילציה של בהנירחון. 80 ננוגרמות של biotinylated BDNFAvi (mbtBDNF) היו מודבטים עם 30 μL של streptavidin מצמידים לחרוזים מגנטיים (20% לצפות) עבור 1 hr ב 4 ° c. אז, חרוזים מגנטיים היו מבודדים באמצעות מפריד מגנטי. החרוזים הstreptavidin היו מחוממים בעזרת מאגר העמסה כדי לעשות זאת. על-ידי ה-סופרנטאנט (SN lane) טופלו גם במאגר העמסה, מחומם וטעון ב ג'ל (SN lane). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אימות הפעילות הביולוגית של מmbtbdnf. (א) DIV7 נוירונים בקליפת העצב היו נסיוב רעב עבור 1 h, ולאחר מכן מגורה עם 50 Ng/ML של BDNF זמין מסחרית או mbtBDNF עבור 30 דקות. חלבונים חולצו ונטענו ב SDS-עמוד ג'ל לניתוח של trkb ו ERK1/2 זרחון באמצעות נוגדנים ספציפיים לעומת הרמות הכולל של החלבון באמצעות נוגדנים נגד trkb הכולל ו ERK1/2. (ב) DIV7 נוירונים היו נסיוב רעב 1 h, ולאחר מכן מגורה עם ריכוז סופי של 200 pM או 2 ננומטר של mbtBDNF מצמידים streptavidin-qd (BDNF-qd) עבור 30 דקות. לאחר מכן, תאים תוקנו ו-pCREB היה מתויג עבור ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטית. (ג) קוונפיקציה של עוצמת קרינה גרעינית pCREB. התוצאות תואמות 90 נוירונים במאגר יחד 3 ניסויים עצמאיים, מוצג כממוצע ± SEM. הניתוח הסטטיסטי תואם ל-ANOVA חד כיוון עם מבחן ההשוואות המרובות של Tukey (* * * * p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ויזואליזציה של BDNF-QD בתאים חיים קבועים. (A) DIV7 הנוירונים הקורטיתיים גדל בתאי מיקרופלואידים היו מגורה בתוך תא סיבי עם ריכוז סופי של 2 ננומטר bdnf-qd עבור 3.5 שעות, ולאחר מכן החלק הטוב ביותר של המיקרוחריצים היה התמונה באמצעות הגדרת מיקרוסקופ תא חי. Kymographs מייצגים עבור מצב בקרה (מטופלים עם streptavidin-QD) ו על הטיפול עם BDNF-QD מוצגים. (ב) קוונפיקציה של המהירות של הזזת BDNF-qd. דקדטה נייד הוגדרו כאלה שהועברו יותר 10 יקרומטר ב 120 s של הקלטה. (ג) DIV7 נוירונים מגודלים בתאי מיקרופלואידים היו ממריצים בתא סיבי עם ריכוז סופי של bdnf-qd של 500 pM או 2 ננומטר עבור 3.5 שעות, ולאחר מכן קבוע ומתויג עם hoechst כדי להמחיש את הגרעינים. מוצגים תמונות מייצגות של התא הסודנדריטי והחלקים האדירים והאבובי של המיקרוחריצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| הללויה | BDNF (ng) ב 5μl | [ng/μl] | סה כ BDNF [μg] |
| E1 | 142.2 | 28.4 | 28.4 |
| E2 | 101.2 | 20.2 | 20.2 |
| E3 | 65.6 | 13.1 | 13.1 |
| E4 | 30.4 | 6.1 | 6.1 |
| 67.8 |
טבלה 1: קוונפיקציה של BDNFAvi טיהור תשואה (הקשורים לאיור 1A). תאים HEK293 היו מזוהמים עם ביטוי פלפמיד נהיגה BDNFAvi, ואת החלבון היה מטוהר על ידי Ni-נ. ת. כרומטוגרפיה של זיקה. ריכוז החלבון והתשואה הסופית חושבו על ידי ניתוח densi, ואינטרפולציה בעקומת הריכוז הידוע של רקומביננטי האדם הזמין מסחרית BDNF.
משלים קובץ 1: מדיית תרבות ורכיבי מאגר אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, מתודולוגיה ממוטבת לייצור וטיהור של mbtBDNF בהליך מבוסס כרומטוגרפיה הזיקה מתוארת, בהתבסס על עבודתם של סונג ומשתפי פעולה17. המיטובים כוללים את השימוש במיגיב התרגום החסכוני (פיי) תוך שמירה על יעילות של שיטות מעבר יקרות יותר כגון lipofectamine. מיטוב זה מיתרגם הפחתת עלות משמעותית בפרוטוקול, המאפשר מדרגיות תוך שמירה על עלות גבוהה-יעילות. הפרוטוקול כולל גם שיקולים של שימוש בקלות, כולל הקפאת המדיה הממוזגת למשך עד חודשיים. מיטוב אלה להפוך את ההליך להתאמה לצרכים של כל מעבדה, לשפר את העלות והאפקטיביות, ותשואה הומוגנית ביולוגית רקומביננטי BDNF פעיל. ניתן גם להתאים את הפרוטוקול להפקות בקנה מידה קטן יותר על ידי החלפת השימוש במנגנון הכרומטוגרפיה עם משקעים כבידתי של החרוזים בצינורות חרורים. זו מהווה מתודולוגיה ברת קיימא, אך היא פחות חסכונית והביאה לתשואות נמוכות יותר בניסיוננו. BDNF התווית biotin יכול להיות מצמידים שונים streptavidin-מאוגדים בדיקות, כולל fluorophores ו מגנטית חלקיקים, מה שהופך אותו כלי יקר לבצע סוגים שונים של ניסויים לניתוח של סחר post-endocytic. לכן, פרוטוקול ייצור מיטבי ופשוט עבור חלבון זה שימושי מאוד למעבדות הפועלות בתחום זה.
הפקה של חלבונים רקומביננטי עם שינויים מורכבים לאחר ההעברה, כגון BDNF24, במערכות prokaryotic לעתים קרובות גורמת לחלבונים כי הם לא מקופלים כראוי וכך יש פעילות ביולוגית ירודה25. לכן, ביטוי בתאי היונקים הכרחי כדי לקבל חלבון אקטיביים. השימוש בפיי כבר תואר בעבר כחלופה ממשית לייצור בקנה מידה גדול של חלבונים רקומביננטי בתאי היונקים הגדולים25,26, ויעילותה ב העברת התאים הHEK293 בהקשר של מעבדות אקדמיות הודגש27. לכן, השימוש בקו תא זה מייצג אפשרות חוקית להפקת BDNFAvi בקנה מידה שניתן לניהול על-ידי מעבדה אקדמית. הפרוטוקול המוצע יכול להיות מותאם עוד יותר על ידי הדור של קו תא HEK293 באופן מאוד מנוכר עם BDNFAvi, אשר יבטל את שלב החצייה חולף, ובכך לחסוך זמן ומשאבים. עוד מקור פוטנציאלי של אופטימיזציה הוא השימוש בתאים ההשעיה במקום תאים חסיד. HEK293 תאים ניתן לשמור בהשעיה, הפקת כמויות משמעותיות של חלבון רקומביננטי בטווח של גרם לליטר28.
שיפור נוסף בפרוטוקול הוא הביולציה של חלבון BDNFAvi באמצעות אסטרטגיית חוץ-גופית , ומחליפה את הvivo הקודמת בפרוטוקול משותף. הזיהום הזמני יכול לקבל תוצאות בלתי צפויות מבחינת הביטוי של המבנים, כפי שכבר הפגינו קווי תאים מרובים עם מספר ריאגנטים לזיהום29. גורמים שונים יכולים להשפיע על הביטוי של חלבונים מוגברים בהקשר משותף, כולל וקטורים, סוגי תאים וריכוז פלמיד. זה ריבוי של גורמים עושה אופטימיזציה ו הפיכת משימה מורכבת. מצד שני, מתודולוגיה להפריה חוץ גופית מאפשרת שליטה טובה יותר על התנאים בהם התגובה הביוטילציה מתרחשת. מתודולוגיה זו מקבלת תיוג הומוגנית והומוגניות של רקומביננטי BDNF.
כפי שניתן להדגים על ידי הניסויים אימות פעילות ביולוגית, mbtBDNF המיוצר באמצעות פרוטוקול זה דומה למסחרי זמין רקומביננטי BDNF האדם במונחים של BDNF-TrkB איתות הפעלת מסלול. הנתונים גם מראים כי הצימוד BDNF ל-streptavidin-QD אינו מפריע לאיתות BDNF-TrkB. בנוסף, הראנו כי BDNF-QD ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופ אפיקרינה בתאים חיים קבועים. לכן, mbtBDNF מייצג כלי רב ערך לחקר סחר באקאליות נסיגה והוא מציג יתרונות משמעותיים על פני בדיקה חלופית, כגון BDNF-GFP16. הפרוטוקול המתואר במאמר זה מספק מתודולוגיה אמינה ועקבית לייצור של mbtBDNF, אשר ניתן להשתמש בו במחקרים פוסט-endocytic הדינמיקה במודלים עצביים שונים המבטא TrkB או p75. לאיתות bdnf יש השפעות חזקות על מורפולוגיה עצבית ופונקציה3,4,21, והוא הוצע לאחרונה ככלי טיפולי פוטנציאלי כדי לשפר את התחדשות העצבי30,31, מה שהופך את המחקר שלה רלוונטי בתחומים של ביולוגיה תאית ו ביודיקטן. המחקר של ההשפעות של האיתות BDNF וסחר יהיה לקדם את הבנתנו את הביולוגיה של התא העצבי ועשוי לאפשר רתימת הפוטנציאל הרגנרציה שלה הגדרות קליניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים בהכרת תודה התמיכה הפיננסית של Fondecyt (1171137) (FCB), מרכז בסיס של מצוינות במדע וטכנולוגיה (AFB 170005) (FCB), מילניום-גרעין (P07/011-F) (FCB), פרס החוקר הבכיר לאמון (107116/Z/15/Z) (GS) ו בבריטניה מחקר דמנציה פרס קרן (GS). העבודה הזאת נתמכת על ידי Unidad דה מיקרוצאדה Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
- Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
