Summary
Avi dizisi (BDNFAvi) içeren rekombinant BDNF, HEK293 hücrelerinde uygun maliyetli bir şekilde üretilir ve afinite kromatografisi ile saflaştırılır. BDNFavi daha sonra doğrudan mono-biyotinylated enzim BirA ile bir tüp içinde. BDNFavi ve mono-biyotinylated BDNFavi ticari olarak kullanılabilir BDNF ile karşılaştırıldığında kendi biyolojik aktivitelerini korumak.
Abstract
Avi dizisi (BDNFAvi) içeren rekombinant BDNF HEK293 hücrelerinde üretilir ve daha sonra afinite kromatografisi ile uygun maliyetli bir şekilde saflaştırılır. Bir tüpte BirA enzimi ile Doğrudan mono-biyotinylate BDNFAvi için tekrarlanabilir bir protokol geliştirilmiştir. Bu reaksiyonda, mono-biyotinylated BDNFAvi biyolojik aktivitesini korur.
Nörotrofinler nöronal gelişim ve bakımda rol oynayan hedef kaynaklı büyüme faktörleridir. Onlar farklı nöronal bölmeleri arasında uzun mesafe sinyal izin vermek için endositik yol boyunca hızlı taşıma mekanizmaları gerektirir. Nörotrofin lerin ticaretini incelemek için moleküler araçların geliştirilmesi, in vivo kayıt kullanarak hücredeki bu proteinlerin kesin olarak izlenmesini sağlamıştır. Bu protokolde, mono-biyotinylated BDNF üretimi için optimize edilmiş ve uygun maliyetli bir prosedür geliştirdik. Biyotentojen avi dizisi (BDNFAvi) içeren bir rekombinant BDNF varyantı mikrogram aralığındaki HEK293 hücrelerinde üretilir ve daha sonra afinite kromatografisi kullanılarak kolayca ölçeklenebilir bir işlemle saflaştırılır. Saflaştırılmış BDNF daha sonra homojen bir tüp içinde enzim BirA ile doğrudan in vitro reaksiyon ile mono-biyotinylated olabilir. Mono-biyotinylated BDNF biyolojik aktivitesi (mbtBDNF) farklı floroforlara streptavidin-konjuge konjuge olabilir. BDNFAvi ve mbtBDNF, sırasıyla batı blotunu kullanarak aşağı fosforile hedeflerin tespiti ve transkripsiyon faktörü CREB'nin aktivasyonu yoluyla gösterdikleri biyolojik aktivitelerini korumaktadırlar. Streptavidin-kuantum noktalarını kullanarak, fosfo-CREB spesifik antikor ile tespit edilen CREB aktivasyonu ile birlikte mbtBDNF içselleştirmeyi görselleştirebildik. Buna ek olarak, kontrtavidin-kuantum noktalarına konjuge mbtBDNF mikroakışkan odalarda yetişen kortikal nöronlarda retrograd taşıma analizi için uygundu. Bu nedenle, tüp üretilen mbtBDNF fizyolojik sinyal endozom dinamikleri ve nöronlarda ticareti incelemek için güvenilir bir araçtır.
Introduction
Nöronlar sinaptik iletişim sağlayan karmaşık ve özel morfolojisahip sinir sisteminin fonksiyonel birimleri, ve böylece, çeşitli uyaranlara yanıt olarak koordine ve karmaşık davranış nesil. Dendritler ve aksonlar gibi nöronal projeksiyonlar nöronal iletişimde yer alan kritik yapısal özelliklerdir ve nörotrofinler morfolojilerini ve fonksiyonlarını belirlemede önemli oyunculardır1. Nörotrofinler NGF, NT-3, NT-4 ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)2dahil salgılanan büyüme faktörleri bir ailedir. Merkezi sinir sisteminde (CNS), BDNF nörotransmisyon, dendritik arborization, dendritik dikenlerin olgunlaşması, uzun vadeli potentiation, diğerleri arasında 3 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlere katılır3,4. Bu nedenle, BDNF nöronal fonksiyonudüzenleyen kritik bir rol oynar.
Farklı hücresel süreçler BDNF dinamiklerini ve işlevini düzenler. Nöronal yüzeyde, BDNF tropomiyozin reseptörü kiazaz B (TrkB) ve / veya p75 nörotrofin reseptörü (p75) bağlanır. BDNF-TrkB ve BDNF-p75 kompleksleri endositonve farklı endositik organeller5,6,6,7,8sıralanır. Farklı nöronal devrelerde uygun BDNF sinyalizasyonu için BDNF/TrkB kompleksinin doğru hücre içi ticareti9,10,11'dir. Bu nedenle, BDNF kaçakçılık dinamiklerinin ve patofizyolojik süreçlerde bulunan değişikliklerin derinlemesine anlaşılması, sağlık ve hastalıkta BDNF sinyalinin anlaşılması esastır. Bu süreci izlemek için yeni ve özel moleküler araçların geliştirilmesi bu alanın ilerlemesine yardımcı olacak ve ilgili düzenleyici mekanizmaların daha iyi kavranmasını sağlayacaktır.
Nöronlarda BDNF ticareti çalışmaları için çeşitli araçlar mevcuttur. Yaygın olarak kullanılan bir metodoloji, yeşil floresan protein (GFP) veya GFP mCherry12monomerikfloresan kırmızı-shifted varyantı gibi floresan molekülleri ile etiketlenmiş rekombinant BDNF transfeksiyon içerir ,13. Ancak, BDNF aşırı ekspresyon önemli bir eksiklik bu nörotrofin bilinen konsantrasyonları teslim olasılığını ortadan kaldırır olmasıdır. Ayrıca, hücresel toksisite neden olabilir, sonuçların yorumlanması gizleme14. Alternatif bir strateji flag-TrkB gibi epitop etiketli TrkB, transfeksiyon olduğunu. Bu metodoloji TrkB içselleştirme dinamiklerinin incelenmesine izin verir15, ama aynı zamanda transfeksiyon içerir, hangi değişmiş TrkB fonksiyonu ve hücresel toksisite neden olabilir. Bu metodolojik engelleri aşmak için, biotin-ligaz enzimi BirA tarafından mono-biyotinylated olabilir bir Avi dizisi (BDNFAvi) içeren NGF ve BDNF rekombinant varyantları geliştirilmiştir16,17. Biyotinylated rekombinant BDNF farklı streptavidin bağlı araçlar, hangi floroforlar dahil birleştiğinde olabilir, boncuklar, algılama için diğerleri arasında paramanyetik nano tanecikleri. Canlı hücre görüntüleme açısından, kuantum nokta (QD) sık kullanılan floroforlar haline gelmiştir, onlar tek parçacık izleme için arzu özellikleri var gibi, küçük molekül floroforlar ile karşılaştırıldığında artan parlaklık ve fotobeyazrlama direnci gibi18.
Mono-biyotinylated BDNF üretimi (mbtBDNF) BDNFAvi kullanarak plazmidlerin co-transfection BDNFAvi ve BirA ifade sürüş elde edilmiştir, affinet kromatografi si ile rekombinant protein saflaştırma takip 20 mL başına BDNF 20 mL HEK293-koşullu kültür medya17. Burada, manipülasyon kolaylığı için kromatografi sütununa dayalı bir protokolde protein iyileşmesini en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan 500 mL HEK293 şartlı ortamdan BDNFAvi arınmasını sağlayan bu protokolün bir modifikasyonunu öneriyoruz. Kullanılan transfeksiyon maddesi olan polietilenin (PEI), transfeksiyon veriminden ödün vermeden uygun maliyetli bir yöntem sağlar. Mono-biyotinylasyon adımı, ko-transfeksiyonlarla ilişkili komplikasyonları önlemek ve BDNF'nin homojen etiketlemesini sağlamak için in vitro reaksiyona uyarlanmıştır. MbtBDNF'nin biyolojik aktivitesi batı leke ve floresan mikroskopi deneyleri ile gösterilmiştir, pCREB aktivasyonu ve canlı hücre görüntülemesi de dahil olmak üzere mikroakışkan odalarda BDNF'nin retrograd aksonal naklini incelemek için. Bu protokolün kullanımı homojen mono-biyotinylated ve biyolojik olarak aktif BDNF optimize, yüksek verimli üretim sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler CONICYT (Şili Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Komisyonu) onaylı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan protokoller Papalık Üniversitesi Biyogüvenlik ve Biyoetik ve Hayvan Refahı Komiteleri tarafından onaylanmıştır. Omurgalılarla ilgili deneyler Papalık Universidad Católica de Chile Biyoetik ve Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylandı.
NOT: Aşağıdaki protokol, BDNFAvi'yi HEK293 hücrelerinde üretilen toplam 500 mL klimalı ortam hacminden arındırmak için tasarlanmıştır. BDNFAvi'yi arındırmak için üretilen ve işlenen şartlı ortam miktarı gerektiği gibi yukarı veya küçültülmüş olabilir. Ancak, bu koşullar altında daha fazla optimizasyon gerekebilir. Protokol boyunca kullanılan kültür ortamı ve arabelleklerin bileşimi ek malzemelerde bulunabilir.
1. HeK293 şartlı ortamdan BDNFAvi üretimi ve saflaştırılması
- HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu
- 37 ºC'de 15 cm kültür yemeklerinde HEK293 hücrelerini %70 oranında büyütün (%10 sığır fetal serumu, 1x glutamat takviyesi, 1x antibiyotik/antimikotik).
- Ortamı transfection arabelleği olarak değiştirin.
- Transfeksiyon için PEI-DNA karışımını hazırlayın. DNA ve PEI 25 K'yi seyreltmek için iki farklı 15 mL konik tüp kullanın. Bir tüpte 500°L'lik son hacimde 20 μg plazmid DNA seyreltin. Diğer tüpte 500 μL'lik son hacimde 60 μg lineer PEI 25K seyreltin. 5 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- DNA çözeltisini PEI tüpüne dikkatlice pipetleyerek yukarı-aşağı hareketederek bir kez karıştırın. 25 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- Her 15 cm çanak boyunca PEI-DNA karışımının 1 mL'sini damlatın. 37 ºC'de 3 saat pei-DNA karışımı ile hücreleri kuluçkaya yatırın.
- Ortamı taze kuluçka tamponuna çevirin.
- Medya toplama ve depolama
- HEK293 hücrelerinin transfeksiyonundan sonra tüm tabaklardan 48 saat ortatoplayın. Ek Dosya 1'in "supernatant modifikasyon tamponu" bölümünde açıklanan çözümlerin konsantre stoklarını hazırlayın ve listelenen son konsantrasyonları elde etmek için HEK293 supernatant'a ekleyin.
NOT: Hücreler daha fazla analiz için atılabilir veya kurtarılabilir. - 15 dakika buz içinde orta kuluçka.
- Aliquot santrifüj tüpler içine orta.
- 4 °C'lik bir santrifüjde 45 dakika boyunca 10.000 x g'de ortayı santrifüj edin. Bu adım, medyada asılı hücre enkaz ve ölü hücrelerin ortadan kaldırılmasına olanak sağlar.
- Supernatants toplamak,% 0.1 son konsantrasyonda BSA ekleyin. ve daha sonra -20 °C'de saklayabilirsiniz. Medya arınma adımı sırasında daha hızlı erime için donma önce aliquoted olabilir.
NOT: 2 aya kadar dondurulmuş klimalı ortamların depolama süreleri olumlu sonuçlar vermiş, daha uzun depolama süreleri değerlendirilmemiştir.
- HEK293 hücrelerinin transfeksiyonundan sonra tüm tabaklardan 48 saat ortatoplayın. Ek Dosya 1'in "supernatant modifikasyon tamponu" bölümünde açıklanan çözümlerin konsantre stoklarını hazırlayın ve listelenen son konsantrasyonları elde etmek için HEK293 supernatant'a ekleyin.
- Ortam konsantrasyonu ve arınma
- 37 °C'lik bir termodere banyoda ortamı eritin.
- Aliquot medya santrifüj tüpler içine.
- 4 °C'lik soğutulmuş santrifüjde 3.500 x g'de 1 saat ortayı santrifüj edin. Bu adım, kromatografi sütunu ile yeterli akışı sağlamak için kalan hücre enkaz ortadan kaldırılmasısağlar.
- Ortamı 500 mL'den 100 mL'ye düşürmek için protein konsantratörlerini 10 kDa kesme ile kullanın. Optimum konsantrasyon için üreticinin önerilen santrifüj parametrelerini uygulayın.
- Konsantre ortama 500 μL Ni-NTA agarose boncuk ekleyin ve bir rocker 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- Kromatografi cihazlarını birleştirin ve içine ortam dökün. 5 dakika dinlendirin ve sonra orta akmasını sağlamak için 2 yönlü stopcock açın.
- Boncukları 5 dk boyunca 5 mL yıkama tamponu ile yıkayın. 2 yönlü stopcock açarak yıkama tampon drenaj. 3 kez tekrarlayın.
- Sütuna 1 mL elüsasyon arabelleği ekleyin. Sütundaki boncukları askıya aldığından emin olun. 15 dakika kuluçka, ve sonra bir eluate toplamak 1.5 mL mikrosantrifüj tüp. BDNFAvi tam elution için bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- %15 poliakrilamid jelde her bir eluat ve farklı konsantrasyonlarda ticari olarak kullanılabilen BDNF'yi (40-160 ng) yükleyin. Bir anti-BDNF antikor kullanarak batı lekeleme tarafından saflaştırılmış protein tespit edin.
- Ticari olarak kullanılabilir BDNF ile hazırlanan konsantrasyon eğrisini kullanarak her eluate saflaştırılmış BDNFAvi konsantrasyonu belirleyin.
- Aliquot ve -80 °C saflaştırılmış BDNFAvi saklayın.
2. BirA enzimi kullanılarak BDNFAvi in vitro mono-biyotinylation
-
In vitro mono-biyotinylation reaksiyonu
- Biyotinylasyon tampon reaktiflerinin konsantre stok çözeltilerini hazırlayın. Konsantre stokların kullanımı rekombinant proteinseyreltilmesini en aza indirecektir.
- BDNFAvi 800 ng bir aliquot alın ve BDNF ile 1:1 molar ilişki içinde biyotinylation tampon reaktifler ve enzim BirA ekleyin. Örneğin, 200 μL son reaksiyon hacmi eklemek için; 100 μL bdNFAvi, 20 μL Bicine 0.5 M pH 8.3, 20 μL ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100 mM, 20 μL d-biotin 500 μM, 0.8-1 μg ila 1 μL BirA-GST ile 200 μL su içeren çözelti ultra saf su ile tamamlanmıştır.
NOT: Başarılı biyotinylasyon reaksiyonları 400 μL'lik aliquots ile yaklaşık 30 ng / μL BDNFAvi konsantrasyonu içeren, homojen bir biyotinylated BDNFAvi son reaksiyonda ~ 20 ng / μL nihai konsantrasyon ile sonuçlanan yapılmıştır. - Karışımı 30 °C'de bir melezleme fırınında 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Adım 2.1.2'deki gibi ATP ve BirA'nın aynı hacmini ekleyin ve adım 2.1.3'ü tekrarlayın.
- Gelecekteki analizler için -80 °C'de saklayın veya hemen kullanım için buzda tutun (örn. biyotinylation kalite kontrolü).
- Biyotinylation analizi
- Blok 30 μL streptavidin manyetik boncuklar BDNF örnek başına 1 mL engelleme tampon. Bir mikrosantrifüj tüp rotator 1 saat oda sıcaklığında kuluçka.
- Manyetik boncukları manyetik ayırma rafını kullanarak 3 ila 5 dakika veya arabellek boncuklardan tamamen temizlenmiş görünene kadar çökün ve engelleme tamponunu atın.
- Boncuklara 50 μL taze engelleme tamponu ve 80 ng mono-biyotinylated BDNFAvi (mbtBDNF) numunesi ekleyerek borular ile tamamen askıya alın.
- Yaklaşık 20 RPM'de dönen mikrosantrifüj tüp rotator'da 4 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
- 3 ila 5 dakika için manyetik ayırma rafkullanarak boncuk toplamak ve analiz için 30 μL aliquot tutarak, supernatant toplamak.
- Boncukları 500 μL PBS ile bir kez yıkayın ve manyetik ayırma rafını kullanarak 3-5 dakika toplayın. Supernatant'ı kurtarın ve analiz için 30 μL aliquot tutun.
- Boncuklara 10 μL yükleme tamponu ekleyin.
- MbtBDNF'yi ertelemek için numuneleri 7 dk için 97 °C'ye ısıtın.
- MbtBDNF'yi anti-BDNF spesifik antikor kullanarak tespit edin19.
3. mbtBDNF biyolojik aktivitenin doğrulanması
- PTrkB ve pERK'nin batı lekeile saptanması.
- Tohum 2 milyon sıçan kortikal nöronlar 60 mm kültür yemekleri.
- Kültür 7 gün (DIV7) için nöronlar. Daha sonra, deneye başlarken ortayı takviyesiz nörobazal mediun'a çevirin.
- Orta değişimden bir saat sonra mbtBDNF'yi 50 ng/mL'lik son konsantrasyona ekleyin. 37 ºC'de 30 dk kuluçka. Negatif kontrol çanak (BDNF ile uyarılmış olmayan) ve pozitif kontrol çanak (ticari olarak kullanılabilir BDNF 50 ng / mL ile tedavi) tutun.
- Orta toplamak ve yavaşça 1x PBS ile her çanak yıkayın. 1x PBS'yi toplayın ve atın.
- Yemekleri buzüzerine yerleştirin ve her çanağa 50-80 μL lysis tamponu ekleyin. Hücreleri lyse için bir hücre kazıyıcı kullanın.
NOT: Protein defosforilasyonunu ve bozulmasını önlemek için lysis adımı mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. 1-2 dakika dinç kazıma batı lekeleme ile ilgi proteinleri görselleştirmek için yeterlidir. - Lysis tampon toplayın ve 5 s için en yüksek hızda bir girdap karıştırıcı karıştırın.
- 10 dk. için 14.000 x g (4 °C) lysis tampon santrifüj.
- BCA protein niceleme protokolü20ile süpernatant protein içeriğini ölçmek .
- Her koşulda 30-50 μg protein içeren bir aliquot yükleme tampon ekleyin ve batı lekeleme için% 12 poliakrilamid jel yükleyin. BDNFAvi biyolojik aktivitesini doğrulamak için spesifik fosfo-antikorlar kullanarak pTrkB ve pERK'yi saplayın.
- PCREB immünoresans ile BDNF-QD biyolojik aktivitesinin doğrulanması.
- Tohum 40.000 sıçan kortikal nöronlar 10 mm kapakları, daha önce otoklav ve poli-L-lizin ile tedavi daha önce açıklandığı gibi21.
- Kültür nöronal bakım tampon 7-8 gün boyunca nöronlar (ek malzemelere bakın) 37 ºC.
- Deneye başlamak için, orta yı tamamlanmamış nörobazal ortama çevirin ve 37 ºC'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- MbtBDNF'ye (BDNF-QD) bir mbtBDNF aliquot ekleyerek, kuantum nokta streptavidin konjuge (streptavidin-QD) gerekli hacmini ekleyerek 1:1 BDNF-QD molar oranına ulaşmak için mbtBDNF'yi hazırlayın. Daha sonra, nörobazal orta ile 20 μL seyreltin. Boruyu ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın.
NOT: Kuantum nokta streptavidin aynı hacimde başka bir tüp hazırlamak conjugate ve negatif kontrol olarak nörobazal orta ile 20 μL seyreltin. - MbtBDNF/ streptavidin-QD karışımını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir rocker'da kuluçkaya yatırın.
- BDNF-QD'yi nörobazal ortamda istenilen son konsantrasyona (200 pM ve 2 nM) seyreltin.
- Takviyesi olmayan nörobazal ortam ile kuluçka 1 saat sonra, BDNF-QD veya streptavidin-QD (kontrol) ile nöronları uyarmak 200 pM ve 2 nM BDNF son konsantrasyonu için 37 °C 30 dakika.
- Kapakları 1x PBS (37 °C) ile 3 kez yıkayın ve coverslip'i fosfataz inhibitörleri içeren %4 paraformaldehit çözeltisi ile tedavi ederek hücreleri 15 dakika boyunca düzeltin.
- Hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın ve daha sonra bloke/permeabilizasyon tamponu (BSA %5, Triton X-100 %0.5, 1x fosfataz inhibitörü) ile 1 saat kuluçkaya yatırın.
- 4 °C'de anti-pCREB antikor 1:500 (%3 BSA, %0,1 Triton X-100) ile tüplü tüp.
- Ertesi gün, 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve ikincil antikor 1:500 (%3 BSA, % 0.1 Triton X-100) ile 1 saat kuluçka.
- 1x PBS ile 3 kez yıkayın. 7 dakika boyunca Hoechst nükleer leke çözeltisi (5 μg/mL) ekleyin.
- 1x PBS ve montaj ile 3 kez yıkayın.
- Canlı nöronlarda BDNF-QD retrograd aksonal taşımanın görselleştirilmesi
- Daha önce açıklandığı gibi mikroakışkan odaları ve tohum nöronlar hazırlayın16.
- Kültürde 7-8 gün sonra, takviyesi olmayan nörobazal orta orta orta değiştirin.
- MbtBDNF'ye (BDNF-QD) bir mbtBDNF aliquot ekleyerek, kuantum nokta streptavidin konjuge (streptavidin-QD) gerekli hacmini ekleyerek 1:1 BDNF-QD molar oranına ulaşmak için mbtBDNF'yi hazırlayın. Daha sonra, nörobazal orta ile 20 μL seyreltin. Boruyu ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın.
NOT: Kuantum nokta streptavidin aynı hacimde başka bir tüp hazırlamak conjugate ve bir kontrol olarak nörobazal orta ile 20 μL seyreltin. - MbtBDNF/ streptavidin-QD karışımını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir rocker'da kuluçkaya yatırın.
- BDNF-QD'yi istenilen son konsantrasyona (2 nM) seyreltin.
- Takviyesi olmayan nörobazal ortam ile kuluçka 1 saat sonra Mikroakışkan odaaksonal bölmeleri BDNF-QD veya kontrol karışımı ekleyin. BDNF-QD'nin net retrograd taşınmasını sağlamak için 37 °C'de 210 dk kuluçka.
- Canlı hücre görüntülemesi için, hücre vücut bölmesi için proksimal olan mikroolukların segmentinde aksonal retrograd taşımayı bu amaca uygun bir mikroskop kullanarak 100x nesnel kullanarak görselleştirin (37 °C ve %5 CO2). 1 kare/s az görüntü elde edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kromatografik sütun tabanlı bir protokolün kullanılması, önemli hacimlerde HEK293 koşullu ortamın işlenmesine olanak tanır. Şekil1'de, 500 mL koşullu ortamdan BDNFAvi arınma sonuçları gösterilmiştir. Ni-NTA agarose boncuklardan BDNFAvi ardışık elutions BDNFAvi konsantrasyonları azalan verim (Şekil 1A). Art arda dört elutions sonra (her kalıcı 15 dk), Boncuklar tarafından yakalanan BDNF çoğunluğu kurtarılır. Eluatların konsantrasyonları 6 ila 28 ng/μL arasında değişmekte ve toplam verim yaklaşık 60 μg BDNFAvi(Tablo 1)olarak değişmektedir. Üretilen BDNFAvi sonra verimli bir in vitro reaksiyon BirA-GST aracılı tarafından biyotinylated oldu, supernatant olmayan biyotinylated BDNFAvi eksikliği ile gösterildiği gibi(Şekil 1B). Şekil 1B'de sunulan biyotinylasyonun üretilen toplam BDNF'nin bir aliquot'una karşılık geldiğini, ancak reaksiyonun daha büyük hacimler için büyütülebileceğini lütfen unutmayın.
Daha sonra mbtBDNF'nin biyolojik aktivitesi 2 farklı deneysel yaklaşım kullanılarak değerlendirildi. İlk olarak, 60 mm plakalı (2 milyon nöron, DIV7) tohumlu kortikal nöronlar 30 dk için 50 ng/mL mbtBDNF ile uyarıldı ve daha sonra proteinler batı leke analizi için hazırlandı. mbtBDNF'nin biyolojik aktivitesi pTrkB (Y515) ve pERK (T202/Y204) saptanarak ölçüldü. BDNF'nin TrkB'ye bağlanması, hücre içi etki alanında otofosforilasyon reaksiyonu yoluyla reseptörün aktivasyonunu tetikler ve ERK, BDNF sinyal yolu22'ninbilinen bir hedefidir. Her iki fosforilasyonlu proteinin bantları ticari BDNF ve mbtBDNF ile tedavi edilen nöronlarda benzer bir yoğunluğa sahipti ve her ikisi de kontrol durumundan daha güçlü bir sinyal gösterdi(Şekil 2A). Daha sonra, streptavidin-QD ile birleşen mbtBDNF'nin biyolojik aktivitesi canlı görüntüleme deneylerinde kullanılabileceğini göstermek için değerlendirildi. Kortikal nöronlar 10 mm kapakta (kapak başına 40.000 hücre, DIV7) tohumlandı ve pCREB için sabitleme ve boyama dan önce 30 dk için 200 pM veya 2 nM BDNF-QD son konsantrasyonu ile tedavi edildi. CREB kortikal nöronlarda aktive ERK tarafından hedeflenen bir transkripsiyon faktörüdür22,23. BDNF-QD konsantrasyonları artan nöronlar CREB fosforilasyon ve çekirdek çevreleyen QD parçacıkların varlığı doza bağlı artış sonuçlandı(Şekil 2B),BDNF-QD parçacıkları endocytosed olduğunu gösteren ve BDNF aracılı TrkB aktivasyonu ile ilişkili sinyal yollarının aktivasyonu tetikledi. Düşük konsantrasyonda BDNF-QD (200 pM) olan nöronları uyarırken pCREB sinyalinde iki kat artış saptanırken, 2 nM ile uyarıcı uyarıcı pCREB sinyalinde 3,5 kat artışa yol açtı (Şekil 2C). Bu sonuçlar biyotinylated BDNFAvi biyolojik olarak aktif olduğunu göstermektedir, ve streptavidin-QD ile birleştiğinde aktivitesini kaybetmez, immünororesans ve canlı hücre görüntüleme için uygun hale.
Son olarak, BDNF-QD'nin görüntüleme potansiyeli mikroakışkan odacıklar kullanılarak kompartıman kültürlerde değerlendirildi. Kortikal nöronlar mikroakışkan odalarda tohumlandı (15 mm kapaklar, Aksonal ve somatodendritik bölmeleri ayırmak için mikroakışkan oda başına 50.000 nöron, DIV7) ve 3.5 saat canlı hücre mikroskopisi için 2 nM BDNF-QD ile uyarıldı ve ortaya çıkan kymograflar BDNF-QD içeren organellerin hızını ölçmek için kullanıldı(Şekil 3A). Sitoplazmik dinamin aracılı taşımanın önceki analizleri doğrultusunda 0,91 m/s(Şekil 3B)ortalama hareket hızı saptandı7,16. 2 nM streptavidin-QD ile tedavi edilen mikroakışkan bölmelerde, mimografın gösterdiği gibi mikrooluklarda hareketli QD'ler görülmedi (Şekil 3A). Aynı koşullar altında yetiştirilen hücreler 210 dk için 500 pM veya 2 nM BDNF-QD ile uyarıldı ve daha sonra sabit ve bir nükleer boyama ile etiketlendi. Şekil 3C'degösterildiği gibi nöronlar, mikrooluğun proksimal ve distal kısımları ve somatodendritik bölme de dahil olmak üzere tüm analiz edilen alt bölmelerde doza bağlı bdnf-QD birikimini gösterirler. Buna karşılık, kontrol nöronlar oda boyunca hemen hemen hiç QD sinyali gösterdi. Bu nedenle, BDNF-QD mikroakışkan odalarında canlı ve sabit hücrelerde tespit edilebilir.
Şekil 1: HEK293 hücrelerinde BDNFAvi üretimi ve mono-biyotinylasyonu. HEK293 hücreleri PEI reaktifi kullanılarak transfeced ve bir BDNFAvi kodlama plazmid ve koşullu ortam sonra toplandı 48 h. BDNFAvi nikel-nitrilotriacecetic asit kullanılarak saflaştırma sağlayan 6x Histidine etiketi içeren (Ni-NTA) kromatografi. Ticari olarak kullanılabilir rekombinant insan BDNF ~ 13 kDa beklenen bir molekül ağırlığına sahip, BDNFAvi ~ 18 kDa moleküler ağırlığı görüntüler ise. Reçine bağlı BDNFAvi dört ardışık elution adımı ile tamamen eluted oldu. (A) Batı leke evde hazırlanan rekombinant BDNF ve ticari BDNF tespit etmek için anti-BDNF antikorları kullanarak. Bilinen miktarda ticari olarak kullanılabilen insan BDNF ve her bir eluate 5 μL içeren Aliquots BDNF karşı bir antikor kullanarak BDNFAvi tespiti için bir SDS-PAGE jel içine yüklendi. Tablo 1 her eluate mevcut BDNFAvi konsantrasyonlarını gösterir. Her eluatta BDNF miktarı ve konsantrasyonu, ticari olarak mevcut Olan BDNF'nin konsantrasyon eğrisinden densitometrik analiz ve enterpolasyon ile elde edildi. (B) BDNFAvi biyotinylasyonunun doğrulanması. Biyotinylated BDNFAvi seksen nanogram (mbtBDNF) 4 ° C'de 1 saat için manyetik boncuklar (%20 bulamaç) birleştiğinde streptavidin 30 μL ile inkübe edildi. Daha sonra manyetik boncuklar manyetik ayırıcı kullanılarak izole edildi. Streptavidin boncuklar biyotinylated BDNFAvi (boncuk şeritli) eute yükleme tampon ile ısıtıldı. Supernatant (SN şeritli) da yükleme tampon, ısıtmalı ve jel (SN şeritli) yüklü ile tedavi edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MBTBDNF biyolojik aktivitesinin doğrulanması. (A) DIV7 kortikal nöronlar serum 1 saat için açlıktan edildi, ve daha sonra 30 dk. Proteinler, trkb ve ERK1/2 fosfor spesifik antikorlar kullanılarak analiz edilmesi için bir SDS-PAGE jeli ile 50 ng/mL veya mbtBDNF ile uyarılmış ve toplam TrkB ve ERK1/2'ye karşı antikor kullanan proteinin toplam düzeyleriile karşılaştırıldığında. (B) DIV7 kortikal nöronlar serum 1 saat aç edildi ve daha sonra 30 dakika boyunca streptavidin-QD (BDNF-QD) ile birleştiğinde 200 pM veya mbtBDNF 2 nM son konsantrasyonu ile uyarılır. Daha sonra hücreler sabitlendi ve floresan mikroskopi analizi için pCREB etiketlendi. (C) Nükleer pCREB floresan yoğunluğunun ölçülmesi. Sonuçlar, ortalama ± SEM olarak gösterilen 3 bağımsız deneyden bir araya gelen 90 nörona karşılık gelmektedir. İstatistiksel analiz, Tukey'in çoklu karşılaştırma testi (****p < 0.0001) ile tek yönlü Bir ANOVA'ya karşılık gelmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Canlı ve sabit hücrelerde BDNF-QD görselleştirilmesi. (A) Mikroakışkan odalarda yetişen DIV7 kortikal nöronlar aksonal bölmede 3,5 saat için 2 nM BDNF-QD son konsantrasyonu ile uyarıldı ve daha sonra mikroolukların proksimal kısmı canlı hücre mikroskopisi ayarı kullanılarak görüntülendi. Kontrol durumu için (streptavidin-QD ile tedavi edilir) ve BDNF-QD ile tedavi sonrası temsili kymograflar gösterilmiştir. (B) BDNF-QD hareket hızının ölçülmesi. Mobil puncta, 120'li kayıtta 10 μm'den fazla hareket eden peniler olarak tanımlanmıştır. (C) Mikroakışkan odalarda yetişen DIV7 kortikal nöronlar aksonal bölmede 500 pM veya 2 nM bdnf-QD son konsantrasyonu ile uyarılmış ve daha sonra sabit ve hoechst ile çekirdekleri görselleştirmek için etiketlenmiş. Somatodendritik bölmenin temsili görüntüleri ve mikroolukların distal ve proksimal kısımları gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Eluate | 5μl'de BDNF (ng) | [ng/μl] | Toplam BDNF [μg] |
| E1 | 142.2 | 28.4 | 28.4 |
| E2 | 101.2 | 20.2 | 20.2 |
| E3 | 65.6 | 13.1 | 13.1 |
| E4 | 30.4 | 6.1 | 6.1 |
| 67.8 |
Tablo 1: BDNFAvi arıtma veriminin niceliği (Şekil 1A ile ilgili). HEK293 hücreleri Plazmid sürüş BDNFAvi ekspresyonu ile transfeced edildi, ve protein Ni-NTA afinite kromatografisi ile saflaştırılmış. Protein konsantrasyonu ve nihai verim, ticari olarak mevcut rekombinant insan BDNF'nin bilinen konsantrasyon eğrisinde densitometrik analiz ve enterpolasyon ile hesaplandı.
Ek Dosya 1: Kültür ortamı ve tampon bileşenleri Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, sung veişbirlikçilerininçalışmalarına dayalı olarak mbtBDNF'nin bir yakınlık kromatografisi tabanlı prosedüründe üretimi ve arınması için optimize edilmiş bir metodoloji tanımlanmıştır. Optimizasyonlar, lipofektamin gibi daha pahalı transfeksiyon yöntemlerinin verimliliğini korurken uygun maliyetli bir transfeksiyon reaktifi (PEI) kullanımını içerir. Bu optimizasyon, yüksek maliyet etkinliğini korurken ölçeklenebilirlik sağlayan protokolde önemli bir maliyet azaltma anlamına gelir. Protokolde, şartlı ortamın 2 aya kadar dondurulması da dahil olmak üzere kullanım kolaylığı hususları da yer alıyor. Bu optimizasyonlar prosedürü her laboratuvarın ihtiyaçlarına uyarlanabilir hale getirmek, maliyet etkinliğini artırmak ve homojen ve biyolojik olarak aktif rekombinant BDNF verim. Protokol aynı zamanda konik tüplerde boncukların yerçekimsel yağış ile kromatografi cihazlarının kullanımı yerine küçük ölçekli üretimlere adapte edilebilir. Bu uygulanabilir bir metodoloji teşkil, ancak daha az zaman verimli ve deneyimlerinde daha düşük verim sonuçlandı. Biotin etiketli BDNF daha sonra floroforlar ve paramanyetik nano tanecikleri de dahil olmak üzere farklı streptavidin bağlı problar ile birleştiğinde, BDNF post-endositik ticaretinin analizi için çeşitli deneyler yapmak için değerli bir araç tır. Bu nedenle, bu protein için optimize edilmiş ve basit bir üretim protokolü bu alanda çalışan laboratuvarlar için son derece yararlıdır.
BDNF24gibi karmaşık post-çevirisel modifikasyonlar ile rekombinant proteinlerin üretimi, prokaryotik sistemlerde genellikle doğru katlanmış olmayan ve bu nedenle kötü biyolojik aktivite25olan proteinler ile sonuçlanır . Bu nedenle, memeli hücrelerinde ifade bir biyoaktif protein elde etmek için gereklidir. PEI kullanımı daha önce transfected memeli hücrelerinde rekombinant proteinlerin büyük ölçekli üretimi için uygun bir alternatif olarak tarif edilmiştir25,26, ve akademik laboratuvarlar bağlamında HEK293 hücrelerinin transfeksiyon verimliliği27vurgulanmıştır . Bu nedenle, bu hücre hattının kullanımı akademik bir laboratuvar tarafından yönetilebilir bir ölçekte BDNFAvi üretmek için geçerli bir seçenek temsil eder. Önerilen protokol, geçici transfeksiyon adımını ortadan kaldıracak ve zamandan ve kaynaklardan tasarruf sağlayacak olan BDNFAvi ile birlikte aşamalı bir HEK293 hücre hattının üretilmesiyle daha da optimize edilebilir. Optimizasyon başka bir potansiyel kaynak yapışık hücreler yerine süspansiyon hücrelerin kullanımıdır. HEK293 hücreleri süspansiyon içinde muhafaza edilebilir, litre başına gram aralığında rekombinant protein önemli miktarda üreten28.
Protokoldeki bir diğer gelişme de, bir önceki in vivo co-transfection protokolünün yerine, in vitro strateji kullanılarak BDNFAvi proteininin biyotinylasyonudur. Transient co-transfection, birden fazla hücre hattında ve çeşitli transfeksiyon reaktiflerinde gösterildiği gibi, yapıların ekspresyonu açısından beklenmeyen sonuçlar doğurabilir29. Vektörler, hücre tipleri ve plazmid konsantrasyonu gibi transfeksiyon lu proteinlerin eş-transfeksiyon bağlamında ekspresyonunu çeşitli faktörler etkileyebilir. Faktörlerin bu çokluğu optimizasyon ve tekrarlanabilirlik karmaşık bir görev yapar. Öte yandan, bir in vitro metodolojisi biyotinylation reaksiyon gerçekleşir koşullar üzerinde daha iyi kontrol sağlar. Bu metodoloji rekombinant BDNF'nin tekrarlanabilir ve homojen etiketlemesi ile sonuçlanır.
Biyolojik aktivite doğrulama deneylerinden de anlaşılarak, bu protokol kullanılarak üretilen mbtBDNF, BDNF-TrkB sinyal yolu aktivasyonu açısından ticari olarak kullanılabilen rekombinant insan BDNF ile karşılaştırılabilir. Veriler ayrıca BDNF'nin streptavidin-QD'ye bağlamasının BDNF-TrkB sinyaline engel olmadığını da göstermektedir. Buna ek olarak, BDNF-QD canlı ve sabit hücrelerde epifloresan mikroskopi ile tespit edilebilir gösterdi. Bu nedenle mbtBDNF retrograd aksonal ticareti incelemek için değerli bir aracı temsil eder ve BDNF-GFP16gibi alternatif problara göre önemli avantajlar sunar. Bu makalede açıklanan protokol mbtBDNF üretimi için güvenilir ve tutarlı bir metodoloji sağlar, daha sonra TrkB veya p75 ifade farklı nöronal modellerde post-endositik dinamikleri çalışmalarda kullanılabilir. BDNF sinyal nöronal morfolojisi ve fonksiyonu üzerinde güçlü etkileri vardır3,4,21, ve son zamanlarda potansiyel bir tedavi aracı olarak nöronal rejenerasyon geliştirmek için önerilmiştir30,31, hücresel biyoloji ve biyotıp alanlarında ilgili çalışma yapma. BDNF sinyalizasyon ve ticaretinin etkilerinin incelenmesi nöronal hücre biyolojisi anlayışımızı daha da ilerletecek ve klinik ortamlarda rejeneratif potansiyelinin kontrol altına alabilmesine olanak sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar fondecyt (1171137) (FCB), Bazal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) ve İngiltere Araştırma Enstitüsü (GS) tarafından mali destek kabul eder. Bu çalışma Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
- Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
