Summary
Avi配列を含む組換えBDNF(BDNFAvi)は、コスト効率の高い方法でHEK293細胞で産生され、アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。BDNFaviは、その後、チューブ内の酵素BirAで直接モノビオチン化されます。BDNFaviおよびモノビオチン化BDNFaviは、市販のBDNFと比較して生物学的活性を保持します。
Abstract
アビ配列を含む組換えBDNF(BDNFAvi)はHEK293細胞で産生され、次いでアフィニティークロマトグラフィーによりコスト効率よく精製される。再現性のあるプロトコルは、酵素BirAをチューブに含むBDNFAviを直接モノビチン化するために開発されました。この反応において、モノビオチン化BDNFAviは、その生物学的活性を保持する。
ニューロトロフィンは、神経細胞の発達と維持に役割を果たすターゲット由来の成長因子です。それらは異なった神経区画間の長距離シグナリングを可能にするために、エンドサイトーの経路に沿って急速な輸送メカニズムを要求する。ニューロトロフィンの密売を研究するための分子ツールの開発により、生体内記録を用いた細胞内のこれらのタンパク質の正確な追跡が可能になりました。このプロトコルでは、モノビチン化BDNFの生産に対する最適化された費用対効果の高い手順を開発しました。ビオチン化可能なアビ配列(BDNFAvi)を含む組換えBDNF変異体を、HEK293細胞内でマイクログラム範囲で産生し、次いでアフィニティークロマトグラフィーを用いて容易にスケーラブルな手順で精製する。精製されたBDNFは、チューブ中の酵素BirAとの直接インビトロ反応によって均質にモノビオチン化することができる。モノビチン化BDNF(mbtBDNF)の生物活性は、異なるフルオロフォアにストレプトアビジン共役に結合することができる。BDNFAviおよびmbtBDNFは、ウェスタンブロットを用いた下流リン酸化標的の検出および転写因子CREBの活性化を通じて実証された生物活性を保持する。ストレプトアビジン量子ドットを用いて、リン酸化特異的抗体で検出されたCREBの活性化と共にmbtBDNFのインターナリゼーションを可視化することができました。さらに、ストレプトアビジン量子ドットに結合したmbtBDNFは、マイクロ流体室で成長した皮質ニューロンにおける逆行輸送解析に適していた。このように、チューブで生成されたmbtBDNFは、生理的シグナル伝達の内在ダイナミクスおよびニューロンの人身売買を研究するための信頼できるツールである。
Introduction
ニューロンは、シナプスコミュニケーションを可能にする複雑で特殊な形態を有する神経系の機能的単位であり、したがって、多様な刺激に応答して協調的で複雑な行動の生成である。樹状突起や軸索などの神経突起は、神経伝達に関与する重要な構造的特徴であり、ニューロトロフィンは形態と機能1を決定する上で重要な役割を果たします。ニューロトロフィンは、NGF、NT-3、NT-4、および脳由来神経栄養因子(BDNF)2を含む分泌成長因子のファミリーである。2中枢神経系(CNS)において、BDNFは神経伝達、樹状樹状の樹状化、樹状脊椎の成熟、長期増強、3,44を含む多様な生物学的プロセスに関与する。したがって、BDNFは神経機能の調節において重要な役割を果たす。
多様な細胞プロセスは、BDNFのダイナミクスと機能を調節します。神経細胞表面では、BDNFはトロポミオシン受容体キナーゼB(TrkB)および/またはp75ニューロトロフィン受容体(p75)に結合する。BDNF-TrkBおよびBDNF-p75複合体は、エンドサイトース化され、異なるエンドサイトオルガネラ55、6、7、86,7,8に分類される。BDNF/TrkB複合体の正しい細胞内の人身売買は、異なる神経回路9、10、1110における適切9なBDNFシグナル伝達のために必要と11される。このため、BDNFの人身売買ダイナミクスと病態生理学的プロセスにおけるその変化を深く理解することは、健康と疾患におけるBDNFシグナル伝達を理解するために不可欠である。このプロセスを監視する新しい特定の分子ツールの開発は、この分野を前進させ、関係する規制メカニズムをよりよく把握するのに役立ちます。
ニューロンの BDNF 人身売買の研究に利用できるいくつかのツールがあります。.一般的に使用される方法論は、GFP mCherry12,13の緑色蛍光タンパク質(GFP)または単量体蛍光赤シフト変異型などの蛍光分子でタグ付けされた組換えBDNFのトランスフェクションを13含む。しかし、BDNF過剰発現の主な欠点は、このニューロトロフィンの既知の濃度を提供する可能性を排除することです。また、細胞毒性をもたらし、結果14の解釈を隠す。別の戦略は、Flag-TrkBのようなエピトープタグ付きTrkBのトランスフェクションです。この方法論はTrkBの内在性ダイナミクス15の研究を可能にするが、それはまた、TrkB機能および細胞毒性の変化をもたらす可能性があるトランスフェクションを伴う。これらの方法論的ハードルを克服するために、ビオチンリガーゼ酵素BirAによって単一ビオチン化することができるアビ配列(BDNFAvi)を含むNGFおよびBDNFの組換え変異体が16,17,17に開発された。ビオチン化組換えBDNFは、フルオロフォア、ビーズ、常磁性ナノ粒子などを検出するための異なるストレプトアビジン結合ツールに結合することができる。ライブセルイメージングの面では、量子ドット(QD)は、小分子フルオロフォア18と比較した場合の光漂白に対する輝度および耐性の増加などの単粒子追跡に望ましい特性を有するため、頻繁に使用されるようになっている。
BDNFAviを用いたモノビオチン化BDNF(mbtBDNF)の生産は、BDNFAviとBirAの発現を駆動するプラスミドの共トランスフェクションによって達成され、続いて、10mLあたりBDNFの収率1〜2μgのBDNFの収率を有するアフィニティークロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製が行われた。ここでは、500 mLのHEK293コンディションメディアからのBDNFAvi精製を可能にするこのプロトコルの改変を提案し、操作を容易にするためのクロマトグラフィーカラムベースのプロトコルでタンパク質回収を最大化することを目指す。使用されたトランスフェクション剤、ポリエチレンイミン(PEI)は、トランスフェクション収率を犠牲にすることなく費用対効果の高い方法を保証する。モノビオチン化ステップは、共トランスフェクションに関連する合併症を回避し、BDNFの均質な標識を確実にするために、インビトロ反応に適応されています。mbtBDNFの生物活性は、微小流体室におけるBDNFの逆行軸索輸送を研究するためのpCREBおよび生細胞イメージングの活性化を含む、ウェスタンブロットおよび蛍光顕微鏡実験によって実証された。このプロトコルを使用すると、均質なモノビオチン化および生物学的に活性なBDNFの最適化された高収率生産が可能になります。
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Protocol
すべての実験は、CONICYT(チリ国家科学技術研究委員会)の承認されたガイドラインに従って行われました。本研究で使用されたプロトコルは、ポンティフィシア大学カトリカ・デ・チリのバイオセキュリティおよび生物倫理的および動物福祉委員会によって承認された。脊椎動物を含む実験は、ポンティフィシア大学カトリカ・デ・チリの生物倫理・動物福祉委員会によって承認されました。
注:次のプロトコルは、HEK293細胞で産生されるコンディション培地の合計体積500 mLからBDNFAviを浄化するように設計されました。BDNFAviを精製するために製造および処理されるコンディショルドされた培地の量は、必要に応じて増減することができます。ただし、このような状況では、さらなる最適化が必要になる場合があります。プロトコル全体で使用される培養培地およびバッファーの組成は、補足資料に記載されています。
1. HEK293コンディショナティングメディアからのBDNFAviの製造と精製
- HEK293細胞のトランスフェクション
- ヘク293細胞を、37 ºCで15cm培養皿で、補充されたDMEM培地(10%ウシ胎児血清、1xグルタミン酸サプリメント、1x抗生物質/抗ミコティック)で70%の合流点に成長させます。
- 媒体をトランスフェクションバッファーに変更します。
- PEI-DNA混合物をトランスフェクション用に準備します。DNAとPEI 25 Kを希釈するために、2つの異なる15 mL円錐管を使用します。プラスミドDNAを20μgの最終体積500μLで1本のチューブに希釈します。他のチューブの最終容積500μLで60μgのリニアPEI 25Kを希釈します。室温で5分間インキュベートします。
- DNA溶液をPEIチューブに慎重にピペットし、アップダウン動作で1回混合します。室温で25分間インキュベートします。
- 各15cmの皿全体にPEI-DNA混合物の1 mLを滴下する。37 ºCで3時間のPEI-DNA混合物で細胞をインキュベートします。
- 培地をフレッシュインキュベーションバッファに変更します。
- メディアの収集と保存
- HEK293細胞のトランスフェクション後、すべての皿48時間から培地を収集します。補足ファイル1の「上清修飾バッファー」セクションに記載されている溶液の濃縮在庫を準備し、一覧表示された最終濃度を達成するためにHEK293上清にそれらを追加します。
メモ:セルは、さらなる分析のために廃棄または回収することができます。 - 培地を氷の中で15分間インキュベートします。
- 遠心分離管に媒体をアリコート。
- 4°C遠心分離機で45分間10,000xgで培地を遠心分離します。 gこのステップは、培地に懸濁した細胞デブリおよび死細胞の除去を可能にする。
- 上清を収集し、0.1%の最終濃度でBSAを追加します。そして-20°Cで保管する。メディアは、浄化ステップ中に迅速な解凍のために凍結する前にアリクォートすることができます。
注:最大2ヶ月の凍結されたコンディションされたメディアの保管時間は肯定的な結果をもたらし、より長い貯蔵時間は評価されていない。
- HEK293細胞のトランスフェクション後、すべての皿48時間から培地を収集します。補足ファイル1の「上清修飾バッファー」セクションに記載されている溶液の濃縮在庫を準備し、一覧表示された最終濃度を達成するためにHEK293上清にそれらを追加します。
- メディアの濃縮と精製
- 37°Cの熱調節浴槽でメディアを解凍します。
- 遠心分離管にメディアをアリコート。
- 4°C冷却遠心分離機で3,500xggで1時間の培地を遠心分離する。このステップは、クロマトグラフィーカラムを通る適切な流れを確保するために残りの細胞デブリの除去を可能にする。
- 10 kDa カットオフのタンパク質濃縮器を使用して、媒体を 500 mL から 100 mL に減らします。最適な濃度を得るための、メーカーの推奨遠心調整パラメータに従ってください。
- 500 μL の Ni-NTA アガロースビーズを濃縮培地に加え、ロッカーで一晩 4 °C でインキュベートします。
- クロマトグラフィー装置を組み立て、媒体を注ぎます。5分間休ませてから、2ウェイストップコックを開けて、中程度の流れを通します。
- 5 mLの洗浄バッファーでビーズを5分間洗います。2方向の栓を開けて洗浄バッファーを排出します。3回繰り返します。
- 1 mL の溶出バッファーをカラムに追加します。列のビーズを再中断してください。15分間インキュベートし、1.5 mLマイクロ遠心チューブに溶出物を回収します。BDNFAvi の完全な溶出のためにこのステップを 3 回繰り返します。
- 各溶出物の5 μLおよび市販のBDNF(40-160 ng)の異なる濃度を15%ポリアクリルアミドゲルにロードする。抗BDNF抗体を用いてウェスタンブロッティングにより精製タンパク質を検出する。
- 市販のBDNFで調製した濃度曲線を用いて各溶出物中の精製BDNFAviの濃度を決定する。
- アリコートを、精製されたBDNFAviを-80°Cで保管します。
2. ビラ酵素を用いたBDNFAviのインビトロモノビオチン化
-
インビトロモノビオチン化反応
- バイオチン化緩衝試薬の濃縮ストック溶液を調製する。濃縮ストックの使用は、組換えタンパク質の希釈を最小限に抑えます。
- 800 ngのBDNFAviを取り、ビオチン化緩衝試薬と酵素BirAをBDNFとの1:1モル関係で添加します。例えば、200 μL の最終反応量の追加。BDNFAvi 800 ngを含む溶液の100 μL、20 μL ビシン 0.5 M pH 8.3、20 μL ATP 100 mM、20 μL MgOAc 100 mM、20 μL d-ビオチン 500 μM、0.8-1 μg ~1 μL の超純水を含む
注:成功したビオチン化反応は、約30 ng / μL BDNFAviの濃度を含む400 μLのアリコートで行われ、最終的な反応において、均質にビオチン化されたBDNFAviを最終濃度〜20 ng/μLに導いた。 - 30 °Cの混合物をハイブリダイゼーションオーブンで1時間インキュベートし、15分ごとにチューブ反転によって内容を混ぜます。
- ステップ 2.1.2 と同じボリュームの ATP および BirA を追加し、ステップ 2.1.3 を繰り返します。
- 将来の分析のために-80 °Cで保管するか、すぐに使用するために氷の上に保管してください(例えば、バイオタイニル化品質管理)。
- ビオチン化分析
- ブロックバッファーの1 mLでBDNFサンプルあたりのストレプトアビジン磁気ビーズのブロック30 μL。マイクロ遠心チューブ回転器で室温で1時間インキュベートします。
- 磁気分離ラックを使用して磁気ビーズを沈殿させ、3~5分間、またはバッファーがビーズから完全にクリアされ、ブロッキング バッファを廃棄します。
- 50 μLの新鮮なブロッキングバッファーと80 ngのモノビチン化 BDNFAvi(mbtBDNF)サンプルをビーズに加え、ピペット処理で完全に再中断します。
- マイクロ遠心チューブ回転回転器で約20RPMで回転する4°Cで1時間インキュベートします。
- 磁気分離ラックを使用してビーズを3~5分間回収し、上清を収集して、分析のために30 μLアリコを保持します。
- 500 μL の PBS でビーズを 1 回洗い、磁気分離ラックを使用して 3 ~ 5 分間回収します。上清を回収し、分析のために30 μLアリコを保持します。
- ビーズに4xローディングバッファの10 μLを追加します。
- サンプルを97°Cに加熱して7分間加熱し、mbtBDNFを溶出させます。
- 抗BDNF特異的抗体19を用いてmbtBDNFを検出する。
3. mbtBDNF生物活性の検証
- ウェスタンブロットによるpTrkBおよびpERKの検出
- 60 mm培養皿に200万個のラット皮質ニューロンを種付け。
- 7日間のニューロンを培養する(DIV7)。次いで、実験を開始するときに培地を非補充神経基底メディオンに変更する。
- 培地交換の1時間後、50 ng/mLの最終濃度にmbtBDNFを加えます。37 ºCで30分間インキュベートします。ネガティブコントロールディッシュ(BDNFで刺激されない)とポジティブコントロールディッシュ(市販BDNFの50 ng /mLで処理)を保ちます。
- 媒体を収集し、1x PBSですべての皿を静かに洗います。1x PBS を収集して破棄します。
- 皿を氷の上に置き、各皿に50〜80 μLのリシスバッファーを加えます。細胞スクレーパーを使用して細胞を取り上けます。
注:タンパク質脱リン酸化や分解を避けるために、できるだけ迅速に分解ステップを実行する必要があります。1~2分の激しい掻き取りは、ウェスタンブロッティングにより目的のタンパク質を可視化するのに十分です。 - 溶液バッファーを収集し、5 sの最高速度で渦ミキサーでかき混ぜます。
- 14,000 x g (4 °C) で 14,000 x g (4 °C) でリシス バッファーを遠心分離します。
- BCAタンパク質定量プロトコル20により上清のタンパク質含有量を定量する。
- 条件ごとに30〜50 μgのタンパク質を含むアリコートに負荷バッファーを追加し、ウェスタンブロッティング用に12%ポリアクリルアミドゲルにロードします。特定のホスホ抗体を用いてpTrkBおよびpERKを検出し、BDNFAviの生物学的活性を検証します。
- pCREB免疫蛍光によるBDNF-QD生物学的活性の検証
- シード40,000ラット皮質ニューロンは、10mmのカバーリップで、以前にオートクレーブされ、先に説明したポリL-リジンで処理された21。
- ニューロンを37ºCで神経維持バッファー(補足材料を参照)で7〜8日間培養します。
- 実験を開始するには、培地を非補充神経基底培地に変更し、37ºCで1時間インキュベートします。
- mbtBDNFアリコートに加えて、量子ドットストレプトアビジンコンジュゲート(ストレプトアビジン-QD)の必要量を1:1 BDNF-QDモル比を達成することにより、量子ドット(BDNF-QD)に結合して調製します。その後、神経基底培地で20μLに希釈する。チューブをアルミニウム箔で包み、光から保護します。
注:同じ量の量子ドットストレプトアビジンコンジュゲートで別のチューブを準備し、陰性対照として神経基底培地で20μLに希釈します。 - ロッカーで室温で30分間、mbtBDNF/ストレプトアビジン-QD混合物をインキュベートします。
- BDNF-QDを神経基底培地で所望の最終濃度(200pMおよび2nM)に希釈する。
- 非補充神経基底培地で1時間のインキュベーションを行った後、37°Cで30分間、BDNF-QDまたはストレプトアビジン-QD(対照)でニューロンを刺激し、200pMおよび2nMのBDNFを最終濃度にする。
- カバーリップを1x PBS(37°C)で3回洗浄し、ホスファターゼ阻害剤を含む4%パラホルムアルデヒド溶液でカバースリップを処理して15分間細胞を固定します。
- 細胞をPBSで3回洗浄し、ブロッキング/透過バッファー(BSA 5%、トリトンX-100 0.5%、1xホスファターゼ阻害剤)で1時間インキュベートする。
- 抗pCREB抗体をインキュベート 1:500 (3% BSA で, 0.1% トリトン X-100) 4 °C で一晩.
- 翌日、1x PBSで3回洗浄し、2次抗体1:500で1時間インキュベートする(3%BSA、0.1%トリトンX-100)。
- 1倍のPBSで3回洗います。7分間、Hoechst核染色液(5 μg/mL)を加えます。
- 1x PBSで3回洗浄し、マウントします。
- 生きたニューロンにおけるBDNF-QDの逆行軸索輸送の可視化
- 前述のようにマイクロ流体室および種子ニューロンを準備する16.
- 培養で7〜8日後、培地を非補充神経基底培地に変更する。
- mbtBDNFアリコートに加えて、量子ドットストレプトアビジンコンジュゲート(ストレプトアビジン-QD)の必要量を1:1 BDNF-QDモル比を達成することにより、量子ドット(BDNF-QD)に結合して調製します。その後、神経基底培地で20μLに希釈する。チューブをアルミニウム箔で包み、光から保護します。
注:同じ量の量子ドットストレプトアビジンコンジュゲートで別のチューブを準備し、コントロールとして神経基底媒体で20 μLに希釈します。 - ロッカーで室温で30分間、mbtBDNF/ストレプトアビジン-QD混合物をインキュベートします。
- BDNF-QDを望ましい最終濃度(2 nM)まで希釈します。
- 非補充神経基底培地による1時間のインキュベーションの後、マイクロ流体室の軸索コンパートメントにBDNF-QDまたは対照混合物を加える。BDNF-QDの正味逆行輸送を確実にするために37°Cで210分間インキュベート。
- 生細胞イメージングの場合、これらの目的に適した顕微鏡(37°Cおよび5%CO2)を用いて100x目的を用いて、細胞体区画に近いマイクロ溝のセグメントにおける軸索逆行輸送を可視化する。1 フレーム/sで画像を取得します。
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Representative Results
クロマトグラフィーカラムベースのプロトコルを使用することで、HEK293コンディションメディアの大量処理が可能になります。図1に、500mLのコンディションされた培地からBDNFAviを精製した結果が示されている。Ni-NTAアガロースビーズからのBDNFAviの連続溶出は、BDNFAviの濃度を減少させる(図1A)。4回連続の溶出(それぞれ15分)後、ビーズによって捕捉されたBDNFの大部分が回収される。溶出液の濃度は6〜28ng/μLの範囲で、総収量はBDNFAviの約60μgに及んだ(表1)。製造されたBDNFAviは、その後、上清中の非ビオチン化BDNFAviの欠如によって示されるように、BirA-GSTによって媒介されるインビトロ反応によって効率的にビオチン化された(図1B)。図1Bに示すビオチン化は、BDNFの総生成物のアリコートに相当しますが、反応はより大きなボリュームに合わせてスケールアップすることができます。
次いで、mbtBDNFの生物活性を2つの異なる実験手法を用いて評価した。まず、60mmプレートに播種した皮質ニューロン(200万個のニューロン、DIV7)を50ng/mLのmbtBDNFで30分間刺激し、次いで、ウェスタンブロット分析のためにタンパク質を調製した。このmbtBDNFの生物活性をpTrkB(Y515)およびpERK(T202/Y204)を検出して定量した。TrkBへのBDNFの結合は、その細胞内ドメインにおける自己リン酸化反応を通じて受容体の活性化を引き起こし、そしてERKはBDNFシグナル伝達経路22の既知の標的である。両方のリン酸化タンパク質のバンドは、市販のBDNFおよびmbtBDNFで処理されたニューロンにおいて同様の強度を有し、両方とも対照条件よりも強いシグナルを示した(図2A)。次に、streptavidin-QDに結合したmbtBDNFの生物活性を評価し、ライブイメージング実験で使用できることを実証した。皮質ニューロンは10mmカバー(カバーあたり40,000細胞、DIV7)に播種し、pCREBの固定および染色の前に30分間200pMまたは2 nM BDNF-QDの最終濃度で処理した。CREBは、皮質ニューロン22,23,23において活性化されたERK1/2によって標的とされる転写因子である。BDNF-QDの濃度の増加に伴う刺激ニューロンは、CREBのリン酸化の用量依存的増加をもたらし、核を取り巻くQD粒子の存在(図2B)、BDNF-QD粒子がエンドサイトース化され、BDNF媒介性TrkB活性化に関連するシグナル伝達経路の活性化を引き起こしたことを示す。Figure 2BBDNF-QD(200 pM)の低濃度のニューロンを刺激するとpCREBシグナルが2倍に増加し、2nMで刺激するとpCREBシグナルが3.5倍増加した(図2C)。これらの結果は、ビオチン化BDNFAviが生物学的に活性であり、ストレプトアビジン-QDに結合しても活性を失わないことを示し、免疫蛍光および生細胞イメージングに適している。
最後に、BDNF-QDの撮像電位を、マイクロ流体室を用いた区画化培養物で評価した。皮質ニューロンはマイクロ流体室(15mmカバー、マイクロ流体室に播種された 微小流体室あたり50,000個のニューロン、DIV7)軸索と体性樹状調節コンパートメントを分離し、2 nM BDNF-QDで3.5時間刺激した。Figure 3A平均移動速度は0.91μm/sが検出された(図3B)、これは細胞質ダイネイン媒介輸送77,1616の以前の分析に沿った。2 nMストレプトアビジンQDで処理されたマイクロ流体室は、キモグラフ(図3A)で示されるように、マイクログルーブ内の移動QDを示さなかった。同じ条件で増殖した細胞を、500pMまたは2 nM BDNF-QDで210分間刺激し、次いで核染色で固定および標識した。図3Cに示すように、ニューロンは、マイクログルーブおよび体性樹状コンパートメントの近位および遠位部分を含む、分析されたすべてのサブコンパートメントにおける用量依存的なBDNF-QDの蓄積を示す。対照的に、制御ニューロンはチャンバー全体にほとんどQD信号を示さなかった。従って、BDNF-QDはマイクロ流体室の生きているおよび固定された細胞で検出することができる。
図1:HEK293細胞におけるBDNFAviの産生および単一バイオチン化。HEK293細胞は、PEI試薬およびBDNFAviコードプラスミドを用いてトランスフェクトし、48時間後にコンディションされた培地を回収した。市販の組換えヒトBDNFは、〜13kDaの分子量が期待されているのに対し、BDNFAviは〜18kDaの分子量を表示する。樹脂に結合したBDNFAviは、4つの連続した溶出工程で完全に溶出した。(A)家で調製された組換えBDNFおよび商業BDNFで検出する抗BDNF抗体を用いたウェスタンブロット。市販のヒトBDNFおよび5μLの既知の量の市販のヒトBDNFおよび5μLを含むアリコートは、BDNFに対する抗体を用いてBDNFAviを検出するためにSDS-PAGEゲルにロードした。表1は、各溶出物中に存在するBDNFAviの濃度を示す。各溶出物中のBDNFの量および濃度は、市販のBDNFの濃度曲線から濃度分析および補間を行った。(B) BDNFAvi ビオチン化の検証ビオチン化BDNFAvi(mbtBDNF)の80ナノグラムを、30μLのストレプトアビジンを磁気ビーズ(20%スラリー)と結合して4°Cで1時間インキュベートした。次いで、磁気ビーズを磁気セパレータを用いて単離した。ストレプトアビジンビーズを負荷バッファーで加熱し、ビオチン化 BDNFAvi (ビーズレーン) を溶出させた。上清(SNレーン)もローディングバッファで処理し、ゲル(SNレーン)に加熱して装填した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:mbtBDNF生物活性の検証(A)DIV7皮質ニューロンは、血清を1時間飢えさせた その後、30分間市販のBDNFまたはmbtBDNFの50 ng/mLで刺激し、タンパク質を抽出し、リン酸化特異的抗体を使用したTrkBおよびERK1/2リン酸化を分析するためにSDS-PAGEゲルにロードし、全TrkBおよびERK1/2に対する抗体を使用したタンパク質の総レベルと比較した。(B)DIV7皮質ニューロンを1時間飢えさせ、200pMまたは2nMのmbtBDNFを30分間ストレプトアビジン-QD(BDNF-QD)に結合して最終濃度で刺激した。次いで、細胞を固定し、pCREBを蛍光顕微鏡分析用に標識した。(C) 核pCREB蛍光強度の定量化結果は、3つの独立した実験から一緒にプールされた90個のニューロンに対応し、平均±SEMとして示した。統計分析は、Tukeyの多重比較検定(****p<0.0001)を用いた一方向の分散分析に対応しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:生細胞および固定細胞におけるBDNF-QDの可視化(A)微小流体室で成長したDIV7皮質ニューロンを軸索コンパートメントで刺激し、最終濃度は2 nM BDNF-QDを3.5時間、次いでマイクログルーブの近位部分を生細胞顕微鏡設定で画像化した。対照条件(ストレプトアビジン-QDで処理)およびBDNF-QDによる治療時の代表的な動調を示す。(B) BDNF-QDの移動速度の定量化。モバイルパンクタは、120秒の記録で10μm以上移動したものと定義された。(C)微小流体室で成長したDIV7皮質ニューロンを軸索コンパートメントで刺激し、最終的な濃度のBDNF-QDを500pMまたは2 nMで3.5時間、ヘーヒストで固定して標識して核を視覚化した。体性樹状コンパートメントおよびマイクロ溝の遠位部および近位部の代表的な画像が示されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| エリューアテ | 5μlのBDNF(ng) | [ng/μl] | 総 BDNF [μg] |
| E1 | 142.2 | 28.4 | 28.4 |
| E2 | 101.2 | 20.2 | 20.2 |
| E3 | 65.6 | 13.1 | 13.1 |
| E4 | 30.4 | 6.1 | 6.1 |
| 67.8 |
表1:BDNFAvi精製収率の定量化(図1Aに関連)HEK293細胞をBDNFAvi発現を駆動するプラスミドをトランスフェクトし、タンパク質をNi-NTAアフィニティークロマトグラフィーで精製した。タンパク質濃度および最終収率は、市販の組換えヒトBDNFの既知濃度曲線における濃度分析および補間法によって算出した。
補足ファイル1:カルチャメディアとバッファコンポーネントこのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、親和クロマトグラフィーベースの手順におけるmbtBDNFの生成および精製のための最適化された方法論が、Sungおよび共同研究者17の研究に基づいて説明される。最適化には、リポフェクタミンなどのより高価なトランスフェクション方法の効率を維持しながら、費用対効果の高いトランスフェクション試薬(PEI)の使用が含まれます。この最適化により、プロトコルの大幅なコスト削減が実現し、高いコスト効率を維持しながらスケーラビリティが実現します。このプロトコルには、最大 2 か月間の条件付きメディアの凍結を含む使いやすさに関する考慮事項も含まれています。これらの最適化により、各ラボのニーズに適応可能な手順を実現し、費用対効果を向上させ、均質で生物学的に活性な組換えBDNFを得ることができます。このプロトコルは、クロマトグラフィー装置の使用を円錐管内のビーズの重力沈殿に置き換えることによって、小規模生産に適応することもできる。これは実行可能な方法論を構成しますが、時間効率が低く、私たちの経験の収率が低下しました。ビオチン標識BDNFは、フルオロフォアや常磁性ナノ粒子を含む異なるストレプトアビジン結合プローブに結合することができ、BDNFポストエンドサイト人身売買の分析のための多様な種類の実験を行うための貴重なツールです。したがって、このタンパク質の最適化された簡単な生産プロトコルは、この分野で働く研究所にとって非常に有用です。
BDNF24のような複雑な翻訳後修飾を伴う組換えタンパク質の生産は、原核生物系において、しばしば正しく折り畳まれていないタンパク質を生じ、したがって生物学的活性が悪い25を有する。そのため、哺乳動物細胞での発現は、生理活性タンパク質を得る必要がある。PEIの使用は、トランスフェクション哺乳類細胞25,26における組換えタンパク質の大規模生産のための実行可能な代替手段として先に述べられており、26学術研究所の文脈におけるHEK293細胞のトランスフェクションにおけるその効率が27に強調されている。したがって、この細胞株の使用は、学術機関で管理できるスケールでBDNFAviを生産するための有効なオプションを表します。提案されたプロトコルは、BDNFAviに安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞株の生成によってさらに最適化することができ、一時的なトランスフェクションステップを排除し、時間とリソースを節約する。最適化のもう一つの潜在的なソースは、接着細胞の代わりに懸濁液中の細胞の使用である。HEK293細胞は懸濁液中に維持することができ、1リットル当たりグラム28の範囲でかなりの量の組換えタンパク質を生成する。
プロトコルのもう一つの改善は、インビトロ戦略を用いたBDNFAviタンパク質のビオチン化であり、以前のin vivo共トランスフェクションプロトコルに取って代わる。過渡的な共トランスフェクションは、複数の細胞株およびいくつかのトランスフェクション試薬29で実証されているように、構築物の発現の点で予期しない結果を有し得る。様々な要因は、ベクター、細胞タイプおよびプラスミド濃度を含む、共トランスフェクションコンテキストにおけるトランスフェクションタンパク質の発現に影響を与える可能性がある。この因子の多重度により、最適化と再現性が複雑なタスクになります。一方、インビトロ方法論は、ビオチン化反応が起こる条件をより良く制御することを可能にする。この方法論は、組換えBDNFの再現性と均質な標識を生じる。
生物活性検証実験によって示されるように、このプロトコルを用いて産生されるmbtBDNFは、BDNF-TrkBシグナル伝達経路活性化の観点から市販の組換えヒトBDNFに匹敵する。また、このデータは、BDNFとストレプトアビジン-QDの結合がBDNF-TrkBシグナル伝達を妨げないことを示している。また、BDNF-QDは生細胞や固定細胞において、蛍光顕微鏡で検出できることを示した。したがって、mbtBDNFは逆行軸索の密売を研究するための貴重なツールを表し、BDNF-GFP16のような代替プローブよりも大きな利点を提示する。この記事で説明するプロトコルは、MbtBDNFの生産のための信頼性と一貫した方法論を提供し、TrkBまたはp75を発現する異なる神経モデルにおける終末ダイナミクス研究で使用することができる。BDNFシグナル伝達は、神経形態および機能33、4、214,21に対して強力な効果を有し、最近では神経再生30,31,31を高める潜在的な治療ツールとして提案されており、細胞生物学および生物医学の分野で関連する研究を行っている。BDNFシグナル伝達と人身売買の効果の研究は、神経細胞生物学の理解をさらに進め、臨床現場での再生可能性の利用を可能にするかもしれない。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、フォンデサイト(1171137)(FCB)、科学技術基礎優秀センター(AFB 170005)(FCB)、ミレニアム核(P07/011-F)(FCB)、ウェルカム・トラスト上級研究員賞(107116/Z/15/Z)からの財政的支援を感謝して認めている。この研究は、ウニダード・デ・ミクロスコフィア・アバンザダUC(UMA UC)によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
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