Summary
Rekombinant BDNF som innehåller en Avi-sekvens (BDNFAvi) produceras i HEK293-celler på ett kostnadseffektivt sätt och renas genom affinitetkromatografi. BDNFavi är därefter direkt mono-biotinylated med enzymet BirA i ett rör. BDNFavi och monobiotinylerade BDNFavi behåller sin biologiska aktivitet jämfört med kommersiellt tillgängliga BDNF.
Abstract
Rekombinant BDNF som innehåller en Avi-sekvens (BDNFAvi) produceras i HEK293-celler och renas sedan kostnadseffektivt genom affinitetkromatografi. Ett reproducerbart protokoll utvecklades för att direkt mono-biotinylate BDNFAvi med enzymet BirA i ett rör. I denna reaktion behåller monobiotinylerade BDNFAvi sin biologiska aktivitet.
Neurotrophins är mål-härledda tillväxtfaktorer spelar en roll i neuronal utveckling och underhåll. De kräver snabba transportmekanismer längs den endocytiska vägen för att tillåta långväga signalering mellan olika neuronala avdelningar. Utvecklingen av molekylära verktyg för att studera handeln med neurotroféer har möjliggjort exakt spårning av dessa proteiner i cellen med hjälp av in vivo-registrering. I detta protokoll utvecklade vi ett optimerat och kostnadseffektivt förfarande för produktion av monobiotinylerad BDNF. En rekombinant BDNF-variant som innehåller en biotinylable avi-sekvens (BDNFAvi) produceras i HEK293-celler i mikrogramområdet och renas sedan i ett lätt skalbart förfarande med affinitetskromatografi. Den renade BDNF kan sedan homogent mono-biotinyleras genom en direkt in vitro-reaktion med enzymet BirA i ett rör. Den biologiska aktiviteten hos den monobiotinylerade BDNF (mbtBDNF) kan konjugeras till streptavidin-konjugerade till olika fluorofores. BDNFAvi och mbtBDNF behåller sin biologiska aktivitet som påvisas genom detektion av fosforylerade mål nedströms med hjälp av västra blot respektive aktivering av transkriptionsfaktorn CREB. Med hjälp av streptavidin-quantum prickar, kunde vi visualisera mbtBDNF internalisering samtidigt med aktivering av CREB, som upptäcktes med en phospho-CREB specifik antikropp. Dessutom mbtBDNF konjugerade till streptavidin-quantum prickar var lämplig för bakåtsträvande transport analys i när nervceller odlas i mikrofluidiska kammare. Således, i röret produceras MBTBDNF är ett tillförlitligt verktyg för att studera fysiologiska signalering endosome dynamik och handel med nervceller.
Introduction
Nervceller är de funktionella enheterna i nervsystemet som har en komplex och specialiserad morfologi som tillåter synaptisk kommunikation, och därmed, generering av samordnade och komplexa beteende som svar på olika stimuli. Neuronala projektioner som dendriter och axoner är kritiska strukturella funktioner som är involverade i neuronal kommunikation, och neurotrophins är avgörande aktörer för att bestämma deras morfologi och funktion1. Neurotroferna är en familj av utsöndrade tillväxtfaktorer som inkluderar NGF, NT-3, NT-4, och hjärnan-härledda neurotrofisk faktor (BDNF)2. I det centrala nervsystemet (CNS), BDNF deltar i olika biologiska processer inklusive neurotransmission, dendritisk arborization, mognad av dendritiska taggar, långsiktig potentiering, bland annat3,4. Därför spelar BDNF en avgörande roll i regleringen av neuronal funktion.
Olika cellulära processer reglerar BDNF dynamik och funktion. På den neuronala ytan binder BDNF tropomyosinreceptorkinesen B (TrkB) och/eller p75 neurotrofilceptorn (p75). Komplexen BDNF-TrkB och BDNF-p75 är endocytosed och sorterade i olika endocytiska organeller5,,6,7,8. Korrekt intracellulär handel med BDNF/TrkB-komplexet krävs för korrekt BDNF-signalering i olika neuronala kretsar9,10,11. Av denna anledning är en djup förståelse av BDNF människohandel dynamik och dess förändringar som finns i patofysiologiska processer viktigt att förstå BDNF signalering i hälsa och sjukdom. Utvecklingen av nya och specifika molekylära verktyg för att övervaka denna process kommer att bidra till att driva detta område framåt och möjliggöra ett bättre grepp om de berörda regleringsmekanismerna.
Det finns flera verktyg tillgängliga för studier av BDNF handel med nervceller. En vanlig metod innebär transfection av rekombinanta BDNF märkta med fluorescerande molekyler såsom grönt fluorescerande protein (GFP) eller den monomeriska fluorescerande rödförskjutna varianten av GFP mCherry12,13. En stor brist i BDNF överuttryck är dock att det eliminerar möjligheten att leverera kända koncentrationer av denna neurotrotroin. Det kan också resultera i cellulär toxicitet, dölja tolkningen av resultat14. En alternativ strategi är transfection av en epitop-märkt TrkB, såsom Flag-TrkB. Denna metod möjliggör studiet av TrkB internalisering dynamik15, men det innebär också transfection, vilket kan resultera i förändrad TrkB funktion och cellulär toxicitet. För att övervinna dessa metodologiska hinder utvecklades rekombinanta varianter av NGF och BDNF som innehåller en Avi-sekvens (BDNFAvi), som kan vara monobiotinylerat av biotinligasenzymet BirA,16,17. Biotinylated recombinant BDNF kan kopplas till olika streptavidin-bundna verktyg, som inkluderar fluorofores, pärlor, paramagnetiska nanopartiklar bland annat för detektion. När det gäller live-cell imaging, kvantprickar (QD) har blivit ofta används fluorofores, eftersom de har önskvärda egenskaper för enpartikel spårning, såsom ökad ljusstyrka och motståndskraft mot fotobleaching jämfört med små molekyl fluorofores18.
Produktionen av monobiotinylerad BDNF (mbtBDNF) med BDNFAvi har uppnåtts genom samtransfekt av plasmider som driver uttrycket av BDNFAvi och BirA. följt av rening av det rekombinanta proteinet genom affinitetkromatografi med en avkastning på 1-2 μg BDNF per 20 ml HEK293-konditionerad kulturmedia17. Här föreslår vi en ändring av detta protokoll som möjliggör BDNFAvi rening från 500 ml HEK293-konditionerade medier, som syftar till att maximera proteinåtervinning i en kromatografi-kolumn baserat protokoll för enkel manipulation. Det använda transfectionmedlet, polyetenimin (PEI), säkerställer en kostnadseffektiv metod utan att offra transfection avkastning. Monobiotinylationssteget har anpassats till en in vitro-reaktion för att undvika komplikationer i samband med co-transfections och för att säkerställa homogen märkning av BDNF. Den biologiska aktiviteten hos mbtBDNF visades av västra blot och fluorescensmikroskopi experiment, inklusive aktivering av pCREB och levande cell imaging att studera bakåtsträvande axonal transport av BDNF i mikrofluidiska kammare. Användningen av detta protokoll möjliggör optimerad, hög avkastning produktion av homogen mono-biotinylerade och biologiskt aktiva BDNF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna från CONICYT (Chiles nationella kommission för vetenskaplig och teknisk forskning). De protokoll som används i denna studie godkändes av biosäkerhets- och bioetiska och djurskyddskommittéer vid Pontificia Universidad Católica de Chile. Experiment med ryggradsdjur godkändes av den bioetiska kommittén och djurskyddskommittén vid Pontificia Universidad Católica de Chile.
OBS: Följande protokoll har utformats för att rena BDNFAvi från en total volym på 500 ml konditionerat medium som produceras i HEK293 celler. Mängden konditionerat medium som produceras och bearbetas för att rena BDNFAvi kan skalas upp eller nedskalas efter behov. Ytterligare optimering kan dock vara nödvändig under dessa omständigheter. Sammansättningen av de kulturmedier och buffertar som används i hela protokollet finns i kompletterande material.
1. Produktion och rening av BDNFAvi från HEK293-konditionerade medier
- Transfektion av HEK293-celler
- Odla HEK293 celler till 70% sammanflödet i kompletterade DMEM medium (10% nötkreatur fetala serum, 1x glutamat tillägg, 1x antibiotikum/antimycotic) i 15 cm kultur rätter på 37 ºC.
- Ändra medel- och transfsektionsbufferten.
- Förbered PEI-DNA-blandningen för transfection. Använd två olika koniska rör på 15 ml för att späda ut DNA respektive PEI 25 K. Späd 20 μg plasmid-DNA i en slutlig volym på 500 μL i ett rör. Späd 60 μg linjär PEI 25K i en slutlig volym på 500 μL i det andra röret. Inkubera i rumstemperatur i 5 min.
- Pipetten rör försiktigt in DNA-lösningen i PEI-röret och blanda en gång genom upp-ned-rörelse. Inkubera i rumstemperatur i 25 min.
- Droppa 1 ml PEI-DNA-blandningen i varje 15 cm maträtt. Inkubera cellerna med PEI-DNA-blandningen i 3 timmar vid 37 °C.
- Ändra medium till färsk inkubationsbuffert.
- Insamling och lagring av media
- Samla medium från alla rätter 48 h efter transfection av HEK293 celler. Förbered koncentrerade lager av de lösningar som beskrivs i avsnittet "supernatant modification buffer" i Supplemental File 1 och lägg till dem i HEK293-supernatanten för att uppnå de listade slutliga koncentrationerna.
Celler kan kasseras eller återvinnas för vidare analys. - Inkubera mediet i is i 15 min.
- Aliquot mediet i centrifugrör.
- Centrifugera mediet vid 10 000 x g i 45 minuter i en centrifug på 4 °C. Detta steg gör det möjligt att eliminera cellskräp och döda celler som är upphängda i mediet.
- Samla supernatants, tillsätt BSA vid en slutlig koncentration på 0,1%. och sedan lagra på -20 °C. Mediet kan aliciteras innan de fryser för snabbare upptining under reningssteget.
Obs: Lagringstider för frysta konditionerade medier på upp till 2 månader har gett positiva resultat, längre lagringstider har inte utvärderats.
- Samla medium från alla rätter 48 h efter transfection av HEK293 celler. Förbered koncentrerade lager av de lösningar som beskrivs i avsnittet "supernatant modification buffer" i Supplemental File 1 och lägg till dem i HEK293-supernatanten för att uppnå de listade slutliga koncentrationerna.
- Mediekoncentration och rening
- Tina upp mediet i ett termoreglerat bad på 37 °C.
- Aliquot media i centrifugrör.
- Centrifugera mediet i 1 h vid 3 500 x g i en 4 °C kyld centrifug. Detta steg gör det möjligt att eliminera återstående cellskräp för att säkerställa tillräckligt flöde genom kromatografikolonnen.
- Använd proteinkoncentratorerna med en 10 kDa cutoff för att minska mediet från 500 ml till 100 ml. Följ tillverkarens rekommenderade centrifugeringsparametrar för optimal koncentration.
- Tillsätt 500 μl Ni-NTA-agarose pärlor till det koncentrerade mediet och inkubera över natten vid 4 °C i en vipp.
- Montera kromatografiapparaten och häll in mediet i den. Låt den vila i 5 min och öppna sedan 2-vägskranen för att låta mediet rinna igenom.
- Tvätta pärlorna med 5 ml tvättbuffert i 5 min. Se till att återuppstämra pärlorna i kolonnen. Töm tvättbufferten genom att öppna 2-vägskranen. Upprepa 3 gånger.
- Lägg till 1 ml elueringsbuffert i kolumnen. Se till att återsuspend pärlorna i kolumnen. Inkubera i 15 min, och samla sedan eluate i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Upprepa detta steg 3 gånger för fullständig eluering av BDNFAvi.
- Belastning 5 μl av varje eluate och olika koncentrationer av kommersiellt tillgängliga BDNF (40-160 ng) i en 15% polyakristlig gel. Detektera det renade proteinet genom västra blotting med hjälp av en anti-BDNF-antikropp.
- Bestäm koncentrationen av den renade BDNFAvi i varje eluate med hjälp av koncentrationskurvan som beretts med den kommersiellt tillgängliga BDNF.
- Aliquot och förvara den renade BDNFAvi vid -80 °C.
2. In vitro mono-biotinylation av BDNFAvi med biraenzym
-
In vitro mono-biotinylation reaktion
- Förbered koncentrerade stamlösningar av biotinylationsbuffertreagenserna. Användningen av koncentrerade lager kommer att minimera utspädningen av det rekombinanta proteinet.
- Ta en alikvot på 800 ng BDNFAvi och tillsätt biotinylationsbuffertreagenser och enzymet BirA i en 1:1 molar relation till BDNF. Till exempel, för en 200 μL slutlig reaktionsvolym lägg till; 100 μL lösning som innehåller 800 ng BDNFAvi, 20 μL bicine 0,5 M pH 8.3, 20 μl ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100 mM, 20 μl d-biotin 500 μM, 0,8-1 μg till 1 μl BirA-GST och komplett till 200 μL med ultrapurevatten.
OBS: Framgångsrika biotinylationsreaktioner har utförts med alikvoter på 400 μL som innehåller en koncentration på ca 30 ng/ μL BDNFAvi, vilket resulterar i en homogent biotinylerad BDNFAvi till en slutlig koncentration på ~20 ng/ μL i den slutliga reaktionen. - Inkubera blandningen vid 30 °C i en hybridiseringsugn i 1 h. Blanda innehållet genom rörinvertering var 15:e minut.
- Lägg till samma volym ATP och BirA som i steg 2.1.2 och upprepa steg 2.1.3.
- Förvaras vid -80 °C för framtida analyser eller förvaras på is för omedelbar användning (t.ex. kvalitetskontroll av biotinylering).
- Analys av biotinylering
- Blockera 30 μL streptavidin magnetiska pärlor per BDNF prov i 1 ml blockerande buffert. Inkubera i rumstemperatur i 1 h i en mikrocentrifugrörrotator.
- Fäll ut de magnetiska pärlorna med hjälp av ett magnetiskt separationsställ i 3 till 5 minuter eller tills bufferten verkar helt rensad från pärlorna och kassera blockeringsbufferten.
- Tillsätt 50 μl färsk blockeringsbuffert och 80 ng monobiotylerat BDNFAvi (mbtBDNF) prov till pärlorna och se till att de tas upp helt igen genom rörpappning.
- Inkubera vid 4 °C i 1 h i en mikrocentrifugrörrotator som snurrar vid cirka 20 varv/min.
- Samla pärlorna med hjälp av det magnetiska separationsstället i 3 till 5 minuter och samla upp supernatanten och håll en 30 μL alikvot för analys.
- Tvätta pärlorna en gång med 500 μl PBS och samla sedan in dem med hjälp av magnetseparationsstället i 3 till 5 minuter. Återställ supernatanten och håll en 30 μL alikvot för analys.
- Tillsätt 10 μL 4x lastbuffert till pärlorna.
- Värm proverna till 97 °C i 7 min för att eluera mbtBDNF.
- Känn av mbtBDNF med hjälp av en anti-BDNF specifik antikropp19.
3. Kontroll av mbtBDNF biologisk aktivitet
- Detektion av pTrkB och pERK av västra blot.
- Utsäde 2 miljoner råtta när nervceller i 60 mm kultur rätter.
- Kultur nervceller i 7 dagar (DIV7). Ändra sedan mediet till icke-kompletterade neurobasala mediun när du startar experimentet.
- En timme efter medium förändring, tillsätt mbtBDNF till en slutlig koncentration på 50 ng/mL. Inkubera i 30 min vid 37 ºC. Håll en negativ kontrollskål (icke-stimulerad med BDNF) och en positiv kontrollskål (behandlad med 50 ng/ml kommersiellt tillgänglig BDNF).
- Samla på mediet och tvätta varsamt varje disk med 1x PBS. Samla in och kassera 1x PBS.
- Placera disken på is och tillsätt 50-80 μL lysbuffert till varje maträtt. Använd en cellskrapa för att lyse cellerna.
OBS: Lyssteget bör utföras så snabbt som möjligt för att undvika proteindefosforylering och nedbrytning. 1-2 minuter av kraftig skrapning är tillräckligt för att visualisera proteiner av intresse genom västra blotting. - Samla lysbufferten och rör om i en virvelblandare med högsta hastighet i 5 s.
- Centrifugera lysbufferten vid 14 000 x g (4 °C) i 10 min. Samla upp supernatanten.
- Kvantifiera proteinhalten i supernatanten genom BCA protein kvantifiering protokoll20.
- Tillsätt lastbuffert till en alikvot som innehåller 30-50 μg protein per tillstånd och ladda den i en 12% polyakrylamidgel för västra blotting. Detekterar pTrkB och pERK med hjälp av specifika fosfoantikroppar för att verifiera BDNFAvi biologisk aktivitet.
- Verifiering av BDNF-QD biologisk aktivitet genom pCREB immunofluorescens.
- Utsäde 40.000 råtta när nervceller i 10 mm coverslips, tidigare autoklavererade och behandlade med poly-L-lysin som beskrivits tidigare21.
- Kultur nervceller för 7-8 dagar i neuronal underhåll buffert (se kompletterande material) vid 37 ºC.
- För att starta experimentet, ändra mediet till unsupplemented neurobasal medium och inkubera vid 37 ºC för 1 h.
- Förbered mbtBDNF konjugerade till kvantprickar (BDNF-QD) genom att lägga till en mbtBDNF aliquot, den nödvändiga volymen av quantum dot streptavidin konjugat (streptavidin-QD) för att uppnå en 1:1 BDNF-QD molar ratio. Späd sedan till 20 μL med neurobasalmedium. Linda röret i aluminiumfolie för att skydda den från ljuset.
OBS: Förbered ett annat rör med samma volym kvantpunkt streptavidinkonjugat och späd det till 20 μL med neurobasal medium som en negativ kontroll. - Inkubera mbtBDNF/ streptavidin-QD blandningen i 30 min vid rumstemperatur i en vipp.
- Späd BDNF-QD till önskad slutlig koncentration (200 pM och 2 nM) i neurobasal medium.
- Efter 1 h inkubation med icke-kompletterat neurobasalmedium, stimulera nervcellerna med BDNF-QD eller streptavidin-QD (kontroll) till en slutlig koncentration av 200 pM och 2 nM BDNF i 30 min vid 37 °C.
- Tvätta täckglidorna 3 gånger med 1x PBS (37 °C) och fäst cellerna i 15 min genom att behandla täckslip med 4% paraformaldehydlösning som innehåller fosfatashämmare.
- Tvätta cellerna 3 gånger med PBS och inkubera sedan med blockering/permeabiliseringsbuffert (BSA 5%, Triton X-100 0,5%, 1x fosfatashämmare) i 1 h.
- Inkubera med anti-pCREB-antikropp 1:500 (i 3% BSA, 0,1% Triton X-100) över natten vid 4 °C.
- Följande dag, tvätta 3 gånger med 1x PBS och inkubera i 1 h med den sekundära antikroppen 1:500 (3% BSA, 0,1% Triton X-100).
- Tvätta 3 gånger med 1x PBS. Tillsätt Hoechst kärnfläcklösning (5 μg/ml) i 7 min.
- Tvätta 3 gånger med 1x PBS och montera.
- Visualisering av bakåtsträvande axonal transport av BDNF-QD i levande nervceller
- Förbered mikrofluidiska kammare och fröneuroner enligt beskrivningen tidigare16.
- Efter 7-8 dagar i kultur, ändra mediet till icke-kompletterat neurobasal medium.
- Förbered mbtBDNF konjugerade till kvantprickar (BDNF-QD) genom att lägga till en mbtBDNF aliquot, den nödvändiga volymen av quantum dot streptavidin konjugat (streptavidin-QD) för att uppnå en 1:1 BDNF-QD molar ratio. Späd sedan till 20 μL med neurobasalmedium. Linda röret i aluminiumfolie för att skydda den från ljuset.
OBS: Förbered ett annat rör med samma volym kvantpunkt streptavidinkonjugat och späd det till 20 μL med neurobasal medium som kontroll. - Inkubera mbtBDNF/ streptavidin-QD blandningen i 30 min vid rumstemperatur i en vipp.
- Späd BDNF-QD till önskad slutlig koncentration (2 nM).
- Efter 1 h inkubation med icke-kompletterat neurobaserat medium tillsätt BDNF-QD eller kontrollblandningen till mikrofluidiska kammarens axonalavdelningar. Inkubera i 210 minuter vid 37 °C för att säkerställa en nettoretrovig transport av BDNF-QD.
- För live-cell imaging, visualisera axonal bakåtsträvande transport i segmentet av mikrogroover som är proximala till cellen kroppen facket med hjälp av en 100x mål med hjälp av ett mikroskop som lämpar sig för detta ändamål (37 °C och 5% CO2). Hämta bilder på 1 bildruta/s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användningen av ett kromatografiskt kolumnbaserat protokoll gör det möjligt att bearbeta betydande volymer HEK293-konditionerade medier. I figur 1visas resultaten av reningen av BDNFAvi från 500 ml konditionerade medier. På varandra följande elutions av BDNFAvi från Ni-NTA agarose pärlor ger minskande koncentrationer av BDNFAvi (figur 1A). Efter fyra på varandra följande elutions (var och en varar 15 min), återvunns majoriteten av BDNF som fångas av pärlorna. Koncentrationerna av eluaterna varierar mellan 6 och 28 ng/μL och den totala avkastningen uppgick till cirka 60 μg BDNFAvi (tabell 1). Den producerade BDNFAvi biotinylerades sedan effektivt av en in vitro-reaktion som förmedlades av BirA-GST, vilket framgår av bristen på icke-biotyylerade BDNFAvi i supernatanten (figur 1B). Observera att den biotinylation som presenteras i figur 1B motsvarar en alikvot av den totala BDNF som produceras, men reaktionen kan skalas upp för större volymer.
Sedan utvärderades den biologiska aktiviteten hos mbtBDNF med hjälp av 2 olika experimentella metoder. Först var när nervceller sådd i 60 mm plattor (2 miljoner nervceller, DIV7) stimulerades med 50 ng/mL mbtBDNF för 30 min, och sedan proteiner förbereddes för västra blot analys. Den biologiska aktiviteten hos mbtBDNF kvantifierades genom att pTrkB (Y515) och pERK (T202/Y204) upptäcktes. Bindning av BDNF till TrkB utlöser aktivering av receptorn genom en autofosforyleringsreaktion i dess intracellulära domän, och ERK är ett känt mål för BDNF-signalvägen22. Banden för både fosforylerade proteiner hade en liknande intensitet i nervceller som behandlades med kommersiella BDNF och mbtBDNF, och båda visade en starkare signal än kontrolltillstånd (Figur 2A). Sedan utvärderades den biologiska aktiviteten hos mbtBDNF kopplad till streptavidin-QD för att visa att de kan användas i levande bildexperiment. Kortikala nervceller såddes i 10 mm täcker (40.000 celler per lock, DIV7) och behandlas med en slutlig koncentration av 200 pM eller 2 nM BDNF-QD för 30 min före fastställande och färgning för pCREB. CREB är en transkriptionsfaktor som är inriktad på aktiverad ERK1/2 i när nervceller22,23. Stimulerande nervceller med ökande koncentrationer av BDNF-QD resulterade i en dosberoende ökning av fosforylering av CREB och förekomst av QD-partiklar som omger kärnan (figur 2B), vilket indikerar att BDNF-QD partiklar var endocytosed och utlöste aktivering av signalering vägar i samband med BDNF-medierad TrkB aktivering. En dubbel ökning av pCREB-signalen upptäcktes när man stimulerade nervceller med en låg koncentration av BDNF-QD (200 pM), medan stimulerande med 2 nM resulterade i en 3,5-faldig ökning av pCREB-signalen (figur 2C). Dessa resultat visar att den biotinylerade BDNFAvi är biologiskt aktiv och att den inte förlorar sin aktivitet när den kopplas till streptavidin-QD, vilket gör den lämplig för immunofluorescens och levande cellavbildning.
Slutligen utvärderades bildframställningspotentialen hos BDNF-QD i uppdelade kulturer med hjälp av mikrofluidiska kammare. När nervceller såddes i mikrofluidiska kammare (15 mm omslag, 50 000 nervceller per mikrofluidisk kammare, DIV7) för att separera de axonala och somatodendritiska facken och stimulerades med 2 nM BDNF-QD för 3,5 h. Levande cellmikroskopi utfördes, och de resulterande kymografierna användes för att kvantifiera hastigheten på BDNF-QD som innehåller organeller (figur 3A). En genomsnittlig glidande hastighet på 0,91 μm/s upptäcktes (figur 3B), vilket är i linje med tidigare analyser av cytoplasmatisk dyninmedierad transport7,16. Mikrofluidiska kammare som behandlats med 2 nM streptavidin-QD visade inte rörliga QDs i mikrogroviterna, vilket visas av kymograph (Figur 3A). Celler som odlas under samma förhållanden stimulerades med 500 pM eller 2 nM BDNF-QD i 210 min, och sedan fast och märkt med en nukleär färgning. Som visas i figur 3C,visar nervceller en dosberoende ackumulering av BDNF-QD i alla analyserade delfack, inklusive de proximala och distala delarna av mikrogrooven och det somatodendritiska facket. Däremot visade kontroll nervceller nästan ingen QD signal i hela kammaren. Därför kan BDNF-QD detekteras i levande och fasta celler i mikrofluidiska kammare.
Figur 1: Produktion och monobiotinylation av BDNFAvi i HEK293-celler. HEK293 celler transfekterades med pei reagens och en BDNFAvi kodning plasmid och konditionerade media samlades in efter 48 h. BDNFAvi innehåller en 6x Histidine tag tillåter rening med nickel-nitrilotriacetic syra (Ni-NTA) kromatografi. Kommersiellt tillgänglig rekombinant människa BDNF har en förväntad molekylvikt på ~13 kDa, medan BDNFAvi visar en molekylvikt på ~18 kDa. BDNFAvi bunden till hartset var helt elueras med fyra på varandra följande eluering steg. (A)Western blot med anti-BDNF antikroppar för att upptäcka i hus beredd rekombinant BDNF och kommersiella BDNF. Alikvoter som innehåller kända mängder kommersiellt tillgängliga mänskliga BDNF och 5 μL av varje eluat lastades i en SDS-PAGE gel för detektion av BDNFAvi med hjälp av en antikropp mot BDNF. Tabell 1 anger de koncentrationer av BDNFAvi som finns i varje eluate. Mängden och koncentrationen av BDNF i varje eluate erhölls genom densitometrisk analys och interpolation från koncentrationskurvan för kommersiellt tillgängliga BDNF. b)Kontroll av BDNFAvi-biotinylation. Åttio nanogram biotinylerade BDNFAvi (mbtBDNF) inkuberades med 30 μL streptavidin kopplade till magnetiska pärlor (20% slam) för 1 timme vid 4 °C. Sedan isolerades magnetiska pärlor med hjälp av en magnetisk separator. Streptavidin pärlor värmdes med lastning buffert för att eluera biotinylated BDNFAvi (pärlor körfält). Supernatanten (SN lane) behandlades också med laddande buffra, upphettat och laddat i gelen (SN lane). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kontroll av mbtBDNF biologisk aktivitet. (A)DIV7 när nervceller var serum utsvulten i 1 h, och stimuleras sedan med 50 ng/ml kommersiellt tillgänglig BDNF eller mbtBDNF i 30 min. Proteiner extraherades och laddades i en SDS-PAGE gel för analys av TrkB och ERK1/2 fosforylering med fosfo-specifika antikroppar och jämfördes med de totala nivåerna av proteinet med antikroppar mot totalt TrkB och ERK1/2. (B)DIV7 när nervceller var serum utsvulten i 1 h, och sedan stimuleras med en slutlig koncentration av 200 pM eller 2 nM mbtBDNF kopplade till streptavidin-QD (BDNF-QD) för 30 min. Sedan var cellerna fasta och pCREB var märkt för fluorescens mikroskopi analys. CCKvantifiering av fluorescensintensiteten hos kärnpCREB. Resultaten motsvarar 90 nervceller som poolas samman från 3 oberoende experiment, visas som medelvärde ± SEM. Den statistiska analysen motsvarar en enkelriktad ANOVA med Tukeys flertal jämförelsetest (****p < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Visualisering av BDNF-QD i levande och fasta celler. (A)DIV7 när nervceller som odlas i mikrofluidiska kammare stimulerades i axonal facket med en slutlig koncentration av 2 nM BDNF-QD för 3,5 timmar, och sedan den proximala delen av mikrogroviterna avbildades med hjälp av en levande cell mikroskopi inställning. Representativa kymografier för kontrolltillstånd (behandlas med streptavidin-QD) och vid behandling med BDNF-QD visas. b)Kvantifiering av hastigheten på rörliga BDNF-QD. Mobil puncta definierades som de som flyttade mer än 10 μm i 120 s inspelning. (C) DIV7 när nervceller som odlas i mikrofluidiska kammare stimulerades i axonal facket med en slutlig koncentration av BDNF-QD på 500 pM eller 2 nM för 3,5 timmar, och sedan fast och märkt med Hoechst att visualisera kärnorna. Representativa bilder av det somatodendritiska facket och de distala och proximala delarna av mikrogrooverna visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Eluatet | BDNF (ng) i 5μl | [ng/μl] | Totalt BDNF [μg] |
| E1 (på andra sätt) | 142.2 | 28.4 | 28.4 |
| E2 (på andra) sätt | 101.2 | 20.2 | 20.2 |
| E3 | 65.6 | 13.1 | 13.1 |
| E4 | 30.4 | 6.1 | 6.1 |
| 67.8 |
Tabell 1: Kvantifiering av BDNFAvi-reningsutbyte (relaterad till fig. 1A). HEK293 celler var transfected med en plasmid kör BDNFAvi uttryck, och proteinet renades av Ni-NTA affinitet kromatografi. Proteinkoncentration och slutlig avkastning beräknades genom densitometrisk analys och interpolation i den kända koncentrationskurvan för kommersiellt tillgängliga rekombinanta mänskliga BDNF.
Kompletterande fil 1: Kultur media och komponenter buffert Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln beskrivs en optimerad metod för produktion och rening av mbtBDNF i en affinitetkromatografibaserad procedur, baserad på Sungs och medarbetares arbete17. Optimeringarna omfattar användning av ett kostnadseffektivt transfection reagens (PEI) samtidigt som effektiviteten i dyrare transfection metoder såsom lipofectamin. Den här optimeringen leder till en betydande kostnadsminskning i protokollet, vilket möjliggör skalbarhet samtidigt som hög kostnadseffektivitet bibehålls. Protokollet innehåller också användarvänlighet överväganden, inklusive frysning av konditionerade medier i upp till 2 månader. Dessa optimeringar gör förfarandet anpassningsbart till varje laboratories behov, förbättrar kostnadseffektiviteten och ger homogena och biologiskt aktiva rekombinanta BDNF. Protokollet kan också anpassas till mindre produktioner genom att ersätta användningen av kromatografiapparaten med gravitationsutfällning av pärlorna i koniska rör. Detta är en genomförbar metod, men dess mindre tidseffektiva och har resulterat i lägre avkastning i vår erfarenhet. Den biotinmärkta BDNF kan sedan kopplas till olika streptavidin-bundna sonder, inklusive fluoroforeer och paramagnetiska nanopartiklar, vilket gör det till ett värdefullt verktyg för att utföra olika typer av experiment för analys av BDNF post-endocytic trafficking. Därför är ett optimerat och enkelt produktionsprotokoll för detta protein mycket användbart för laboratorier som arbetar inom detta område.
Produktion av rekombinanta proteiner med komplexa post-translationella modifieringar, såsom BDNF24, i prokaryota system resulterar ofta i proteiner som inte är korrekt vikta och därmed har dålig biologisk aktivitet25. Därför är uttryck i däggdjursceller nödvändigt för att erhålla ett bioaktivt protein. Användningen av PEI har tidigare beskrivits som ett lönsamt alternativ för storskalig produktion av rekombinanta proteiner i transfected däggdjursceller25,,26, och dess effektivitet i transfekten av HEK293-cellerna i samband med akademiska laboratorier har belysts27. Därför representerar användningen av den här cellinjen ett giltigt alternativ för att producera BDNFAvi i en skala som kan hanteras av ett akademiskt laboratorium. Det föreslagna protokollet skulle kunna optimeras ytterligare genom att en HEK293 cellinje högt transfected med BDNFAvi, vilket skulle eliminera den övergående transfection steg, vilket sparar tid och resurser. En annan potentiell optimeringskälla är användningen av celler i suspension i stället för vidhäftade celler. HEK293 celler kan upprätthållas i suspension, genererar betydande mängder rekombinant protein i intervallet gram per liter28.
En annan förbättring i protokollet är biotinylationen av BDNFAvi-proteinet med hjälp av en in vitro-strategi som ersätter det tidigare in vivo-co-transfection-protokollet. in vivo Transient co-transfection kan få oväntade resultat när det gäller uttrycket av konstruktioner, vilket har visats i flera cellinjer och med flera transfection reagenser29. Olika faktorer kan påverka uttrycket av transinfekterade proteiner i en co-transfection sammanhang, inklusive vektorer, celltyper och plasmid koncentration. Denna mångfald av faktorer gör optimering och reproducerbarhet en komplex uppgift. Å andra sidan möjliggör en in vitro-metod bättre kontroll över de förhållanden under vilka biotinylationsreaktionen äger rum. Denna metod resulterar i reproducerbar och homogen märkning av rekombinant BDNF.
Som framgår av experimenten för verifiering av biologisk aktivitet är mbtBDNF som produceras med detta protokoll jämförbart med kommersiellt tillgängliga rekombinanta mänskliga BDNF när det gäller aktivering av BDNF-TrkB-signalvägen. Uppgifterna visar också att koppling av BDNF till streptavidin-QD inte stör BDNF-TrkB-signalering. Dessutom visade vi att BDNF-QD kan detekteras genom epifluorescensmikroskopi i levande och fasta celler. MbtBDNF är därför ett värdefullt verktyg för att studera bakåtsträvande axonal handel och det ger betydande fördelar jämfört med alternativa sonder, såsom BDNF-GFP16. Protokollet som beskrivs i denna artikel ger en tillförlitlig och konsekvent metod för produktion av mbtBDNF, som sedan kan användas i post-endocytic dynamik studier i olika neuronala modeller som uttrycker TrkB eller p75. BDNF signalering har potenta effekter på neuronal morfologi och funktion3,4,21, och har nyligen föreslagits som ett potentiellt terapeutiskt verktyg för att förbättra neuronal regenerering30,31, vilket gör sin studie relevant inom cellbiologi och biomedicin. Studien av effekterna av BDNF signalering och människohandel kommer att ytterligare främja vår förståelse av neuronal cellbiologi och kan möjliggöra utnyttja dess regenerativ potential i kliniska inställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt ekonomiskt stöd från Fondecyt (1171137) (FCB), Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) och ett brittiskt pris för Dementia Research Institute Foundation (GS). Detta arbete stöddes av Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
- Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
