Summary
Mikrobobinler kullanılarak ultra yüksek alan manyetik rezonans mikroskobu (MRM) kullanılarak yüksek uzamsal çözünürlükte biyolojik doku çalışması için bir protokol sunulmuştur. Mikrobobinlerin karakterizasyonu için adım adım talimatlar verilir. Son olarak, görüntüleme optimizasyonu bitki kökleri üzerinde gösterilmiştir.
Abstract
Bu protokol, mr mikroskobu (MRM) olarak da adlandırılan yüksek çözünürlüklü manyetik rezonans görüntüleme (MRG) için tasarlanmış biyolojik numunelerle birlikte solenoidal mikrobobinler için bir sinyal-gürültü oranı (SNR) kalibrasyonu ve numune hazırlama yöntemini tanımlar. Medicago truncatula kök örneklerinde gösterilen pre-klinik MRG spektrometrelerindekullanılabilir. Microcoils, RF rezonatörünün boyutunu ilgi örneğinin boyutuyla eşleştirerek duyarlılığı artırır ve böylece belirli bir veri toplama zamanında daha yüksek görüntü çözünürlükleri sağlar. Nispeten basit tasarımı sayesinde, solenoidal mikrobobinler basit ve ucuz inşa etmek ve kolayca örnek gereksinimlerine adapte edilebilir. Sistematik olarak, bir referans çözümü kullanarak yeni veya ev yapımı mikrobobinlerin nasıl kalibre edilebildiğini açıklarız. Kalibrasyon adımları şunlardır: bir nutation eğrisi kullanarak darbe güç tayini; RF-alan homojenliğinin tahmini; ve standart darbe dizilerini kullanarak hacim normalleştirilmiş sinyal-gürültü oranı (SNR) hesaplanması. Küçük biyolojik numuneler için numune hazırlamada önemli adımların yanı sıra manyetik duyarlılık farklılıkları gibi olası azaltıcı faktörler tartışılmıştır. Optimize edilmiş bir solenoid bobinin uygulamaları, bir kök örneğinin yüksek çözünürlüklü (13 x 13 x 13 μm3, 2,2 pL) 3D görüntülemesi ile gösterilmiştir.
Introduction
Manyetik rezonans görüntüleme, insandan tek hücrelere kadar çok çeşitli biyolojik numuneleri invaziv bir şekilde görüntülemek için çok yönlü biraraçtır, 1,2,3. Tıbbi görüntüleme uygulamaları için MR-tarayıcılar genellikle 1,5 T ile 3 T alan gücüne sahip mıknatıslar kullanırken, tek hücreli uygulamalar çok daha yüksek alan güçlü1,3,4görüntülenir. 100 mikrometrenin altındaki çözünürlüklerde örneklerin incelenmesine manyetik rezonans mikroskobu (MRM)5denir. Ancak MRM, mevcut diğer mikroskopi veya görüntüleme tekniklerine (örn. optik mikroskopi veya BT) göre düşük sinyal-gürültü oranı (SNR) ile karşılaştırıldığında zarar görür. SNR6'yıoptimize etmek için çeşitli yaklaşımlar izlenebilir. Bir yaklaşım daha yüksek bir manyetik alan gücü kullanmaktır, tamamlayıcı bir yaklaşım ise tek tek numuneler için sinyal dedektörü optimize etmektir. İkincisi için, dedektörboyutları ilgi örneğinin boyutlarına uyacak şekilde ayarlanmalıdır. Çapı ≈0.5-2 mm olan küçük numuneler için (örn. kök dokular), Mikrobobinler, SNR bobin çapı6,7ile ters orantılı olduğu için yararlıdır. Hayvan hücrelerinde 7,8 x 7,8 x 15 μm3'e kadar olan çözünürlüklere özel mikrobobinler kullanılarak ulaşılmıştır8. Mikrocoil türleri çeşitli, düzlemsel ve solenoid bobinler ile en yaygın uygulamave doku geometrisi 9 bağlı olarak kullanılır. Düzlemsel bobinler yüzeyine yakın yüksek hassasiyete sahiptir, bu da ince dilimler üzerindeki uygulamalar için yararlıdır. Örneğin, perfüzyon doku görüntüleme için özel olarak tasarlanmış bir yöntem düzlemsel microcoils10için açıklanmıştır. Ancak, düzlemsel bobinler duyarlılık yüksek bir düşüş ve iyi tanımlanmış referans darbe gücü var. Solenoid bobinler, silindirik olan, uygulama daha geniş bir alana sahip ve daha kalın örnekler için tercih edilir. Burada, solenoid bobinin özelliklerini, mikrocoil MRG için numune ler hazırlamak için bir protokol, hem de bir solenoid mikrobobin kalibrasyonu(Şekil 1A) açıklar.
Solenoid bobin, örneği tutan bir kılcal damarın etrafında bir tirbuşon gibi sarmal bir iletken telden oluşur (Şekil 1B). Mikrobobmontajlar sadece emaye bakır tel, kapasitörler bir ürün yelpazesine ve bileşenleri lehim için uygun bir taban kullanılarak inşa edilebilir(Şekil 1B). En büyük avantajları, birim hacim başına SNR ve B1 alan homojenliği açısından iyi performans özellikleri ile birlikte, basitlik ve düşük maliyettir. Yapı nın kolaylığı, bobin tasarımlarının ve geometrilerinin hızlı bir şekilde yinelanmasını sağlar. Solenoid mikrocoil tasarım ve prob karakterizasyonu(yani, elektronik teorisi, çalışma tezgahı ölçümleri ve bobin geometrileri çeşitli için spektrometre ölçümleri) özel gereksinimleri yaygın başka bir yerde7tarif edilmiştir7 ,11,12,13,14.
Bir solenoid bobin başka bir yerde açıklanan kurallara göre istenilen boyutlar için tasarım kuralları akılda tutarak inşa edilebilir15,16. Bu özel durumda, 1,5 mm dış çapında bir kılcal damar etrafında halkalı, emaye bakır telden yapılmış, 1,5 mm iç çapı ile bir bobin kullanılmıştır. Bu solenoid, bir tuning kondansatör (2,5 pF), değişken eşleşen kapasitör (1,5-6 pF) ve bakır bağlantı tellerinden oluşan bir devrenin yapıldığı taban plakası üzerinde tutulur(Şekil 1A, 1C). Alet kondansatör 950 MHz istenilen rezonans frekansını elde etmek için seçilirken, eşleşen kondansatör 50 Ohm'luk bir empedansta maksimum sinyal iletimini elde etmek için seçilir. Büyük kondansatör, daha hassas bir ayar için değişkendir. Normal operasyonda, sonda tabanındaki kapasitörler kullanılarak atokslama ve eşleştirme yapılır. Monte edilmiş mikrobobinin mıknatısa yerleştirilebilmesi için bir sondaüzerine monte edilmesi gerekir. Sisteme bağlı olarak ek bir tutucu gerekebilir. Burada Bir Micro5 prob ile birlikte bruker Konsol Avance III HD ile 22.3 T mıknatıs kombinasyonu kullanın. Bu durumda, probun 1H kanalına bağlanmak için gerekli bağlantılara sahip değiştirilmiş bir destek kesici uç kullandık (Şekil 1A).
Bobinin duyarlılık la uyumlu tasarımı, bakır bobinin numuneye yakın olması nedeniyle oluşan duyarlılık uyuşmazlıklarını azaltmak için perfluorinated sıvıiçeren bir rezervuar içerir17. Bir rezervuar bobin içine plastik bir şırınga yapılmış ve fomblin ile doldurulmuş. Perflorlu sıvının bobini içine alması gerektiğinden, numunenin mevcut çapı 1 mm dış çapa indirgenir. Numune değişiminin kolaylığı için numune dış çapı 1 mm ve iç çapı 700 m olan bir kılcal damarda hazırlanmıştır. Numune hazırlama için gerekli araçlar Şekil 2A'dagösterilmiştir.
Temel deneysel MR parametreleri, degrade sistemi, alan gücü ve konsol dahil olmak üzere kullanılan sistemin donanımına son derece bağlıdır. Birim hacmi başına 90° darbe uzunluğu ve gücü, B 1-homojenliği ve SNR'ı (SNR/mm3)en uygun olan sistem performansını tanımlamak için çeşitli parametreler kullanılabilir. SNR/mm3 aynı sistem18farklı bobinlerin performansını karşılaştırmak için yararlıdır. Sistemler arasında donanım farklılıkları olsa da, kıyaslama protokolünün tek tip uygulaması da sistem performansının karşılaştırını kolaylaştırır.
Bu protokol kalibrasyon ve numune hazırlama üzerinde duruluyor. Solenoid mikrocoils performansıadım adım karakterizasyonu gösterilir: 90 ° darbe uzunluğu veya güç kalibre; RF- alan homojenliğini değerlendirmek; ve birim hacim başına SNR hesaplanması (SNR/mm3). Bir hayalet kullanılarak standart laştırılmış spin-yankı ölçümü, farklı uygulamaların optimizasyonuna olanak tanıyan bobin tasarımlarının karşılaştırılmasını kolaylaştırmak için tanımlanmıştır. Mikrobobinlere özgü hayalet ve biyolojik numune preparatları tanımlanmıştır. Protokol, ticari olarak kullanılabilen bir mikrogörüntüleme sistemi ile donatılmış uygun dar delikli (≤60 mm) dikey mıknatıs üzerinde uygulanabilir. Diğer sistemler için, bir kılavuz olarak hizmet verebilir ve bazı ayarlamalar ile kullanılabilir.
Mrölçümleri için biyolojik numune hazırlama genellikle çok geniş değildir, çünkü numune mümkün olduğunca sağlam olarak görüntülenir. Ancak, biyolojik dokudaki hava boşlukları manyetik duyarlılık farklılıkları nedeniyle görüntü eserlerine neden olabilir19. Etkisi artan manyetik alan gücü ile artar20. Bu nedenle, hava boşlukları yüksek alan güçlü kaçınılmalıdır, ve bu doku etrafında hava önlemek için bir sıvı içinde örnek daldırma ve doku yapıları içinde hava boşluklarının kaldırılması gerektirebilir. Özellikle, mikrobobinler kullanıldıklarında, istenilen örnek dokunun eksizyonu gerekebilir, ardından uygun bir sıvıya batırılabilir. Bunu, numunenin önceden kesilmiş bir kılcal damara yerleştirilmesi ve son olarak kılcal ağda ile kapama nın izlenmesi takip edilir. Tutkal yerine bir dolgu olarak balmumu kullanarak, alev sızdırmazlık veya alternatifler, örnek kolayca ayıklanabilir anlamına gelir. Bu prosedür Medicago truncatula kökünde gösterilmiştir, küçük bir baklagiller bitki. Bu protokolün bir avantajı, MRI ölçümü sırasında numune yok olmadığından, MR verilerinin optik mikroskopi ile daha sonra birlikte kaydedilmesi potansiyelidir.
Sunulan protokol yerinde ölçümlerde yüksek uzamsal çözünürlük için uygundur ve daha ayrıntılı tasarımlar yaşam destek sistemleriyle ilgili zorlukların ele alınması gereken in vivo numunelerinin görüntülenmesine olanak sağlayabilir.
Protocol
NOT: Bu protokol, 1,5 mm'lik bir iç çap (ID) solenoid bobinin bobin özelliklerinin kullanımı ve değerlendirilmesi prosedürlerini açıklar (Şekil 1). Protokolü göstermek için kullanılan bobin, duyarlılıkla eşleşen bir rezervuarda bulunur, ancak protokol eşsiz bobinler için de aynı şekilde geçerlidir. Protokol diğer boyutlara ve farklı spektrometre kurulumlarına uyarlanabilir.
1. Referans numune hazırlama
- 100 mL hassasiyet referans çözeltisinin 100 mL'ini hazırlamak için 100 mL GL45 şişede bulunan 156,4 mg CuSO4 • 5 H2O'yu 80 mL D2O'ya çözün. Bakır sülfat hem T1 hem de T2 gevşeme süresini kısaltarak daha hızlı ölçümler sağlarken, D2O radyasyon sönümleme ve doygunluk etkilerini önler. Katılar tamamen eriyene kadar elle karıştırın.
- 1 g/L CuSO4 (susuz, 6,3 mM) son konsantrasyoniçin deiyonize su kullanarak hacmi 100 mL'ye ayarlayın. Bu konsantrasyon T 1 ve T2 gevşemesini kısaltmak için yeterlidir ancak yağıştan etkilenmeyecek kadar yüksek değildir. H2O: D2O oranının değişmesini önlemek için referans örneğini kapatın.
- İsteğe bağlı olarak, bobinin istenilen rezonans frekansında yankı bulayıp yanan olmadığını test etmek için prob'u bir ağ çözümleyicisine bağlayın. Haase ve ark.14tarafından ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, ayarı ve Q-faktör ölçümleri ile elde edilen frekans aralığını ölçmek için bir S11 yansıtma testi gerçekleştirin. Ortak eksenel kablo kullanarak mikrobobiyi ağ çözümleyicisine bağlayın. Gerekirse BNC adaptör kablosu kullanın.
- Ağ analizöründeki merkez frekansını, bobinin tasarlandığı amaçlanan manyetik alan gücüne bağlı olarak istenilen rezonans frekansına ayarlayın. Ardından, süpürme genişliğini 10 MHz'e ayarlayın.
- Yansıma düzeyini merkez frekansında, f1 ve f2 frekansını -7 dB düzeyinde kaydedin. Haase ve ark.14'e göre -7 dB düzeyinde Q-faktör'ü hesaplamak için bunları kullanın
2. Örnek hazırlama
- Bobin kalibrasyonu için referans numune sayılsa, 1 mL CuSO4 çözeltisini stereomikroskop altında bir saat cam kabına aktarın.
- Biyolojik bir numune hazırlanırken, 1 mL perfluorodecalin (PFD) stereomikroskop altında bir saat camı içine aktarın ve numuneyi batırmak için kullanılacaktır. PFD, biyolojik hücrelere girmeden numunedeki hava boşluklarını doldurabileceği için kullanılır. Ayrıca proton MRG ile gözlemlenebilir değildir. PFD'ye ihtiyaç duyulmadan önce buharlaşma kaybını önlemek için saat camını hemen Petri kabı kapağıile kapatın.
NOT: PFD son derece uçucu ve güçlü bir uzun vadeli sera gazı21. Oksijen giderici özellikleri ve düşük viskozitesi gerekli olmadığında, aynı zamanda gözlemlenebilir 1H sinyali vermeyen, ancak buharlaşmayan fomblin ile değiştirilebilir17. - Mikrobobin tutucunun çapına sığacak şekilde (18 mm) uygun dış çaptaki kılcal damarları kesin ve yeniden konumlandırmaya izin verir (Şekil 1C). Her 10-12 mm'lik bir kesi yapmak için seramik kesici kullanın ve kesi noktasını dikkatlice kırın.
- Bir referans numunesi hazırlarken, saat camının içindeki CuSO4 çözeltisinin yüzeyiyle temas ederek, kılcal damar hareketinin kılcal damarı doldurmasına izin vermek için cımbız ve stereomikroskop kullanın.
- Biyolojik bir numune hazırlarken, saat camının içindeki PFD'nin yüzeyi ile temas eden önceden kesilmiş bir kılcal damar getirmek için cımbız ve stereomikroskop kullanın ve kılcal damar hareketinin kılcal damarı tamamen doldurmasına olanak sağlar. Kılcal damarı saat camına bırakın, böylece tamamen batırılmış olur.
- Perlit toprak değişimi gibi beş haftalık bir tüm kök sistemini büyüme substratından dikkatlice ayıklayın. Rizosheath kök örneğini titizlikle temizleyin. Cımbız kullanarak büyük toprak parçacıkları çıkarın ve küçük parçacıklar varsa, distile su ile kök sistemi yıkayarak kaldırın. Gelecekteki başvuru için gerekirse fotoğraf. Bir neşter kullanarak rizosheath içermeyen lifli kökün küçük bir bölümünü seçin ve çıkarın.
- Vakum tedavisi için, numuneyi uygun bir fiksatif solüsyon içeren 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Tüp kapağını kapalı bırakın ve tüpün açılmasını mühürlemek için tüpü parafilm ile kapatın. Daha sonra, tüp havalandırma sağlamak için keskin bir araç ile filmde delik delik.
- Örnek tüpü bir vakum odasına yerleştirin, hazneyi kapatın ve bir laboratuvar membran vakum pompasını odaya bağlayın. Biyolojik numuneler içinde hava ceplerinin varlığını azaltmak için numuneyi 30 dakikaya kadar vakum tedavisine tabi tart.rınlayın. Numuneden kaçan hava kabarcıkları görülmediğinde vakum tedavisini durdurun.
- Stereomikroskoptan bakarken, numuneyi daha önce hazırlanmış sızma ortamına batırmak için cımbız kullanın. Potansiyel enkaz örneğini yıkayın.
- Hem kılcal damar hem de numune hava kabarcıklarının dahil edilmesini önlemek için tamamen batırılırken, numuneyi cımbız kullanarak kapilleriçine yerleştirin. Daha küçük bir kılcal veya şırınga iğne ucunu itme çubuğu olarak kullanın(Şekil 2B).
- Cımbız kullanarak orta saat camından örnek kılcal alın. PFD durumunda, Petri çanak kapağını kapatın.
- Doku kağıdını ince bir noktaya şekillendirin ve kılcal damarın her iki ucundan yaklaşık 1 mm sıvıyı çıkarmak için kullanın.
- Bir balmumu kalem kullanarak kılcal balmumu küçük bir hacim eritin. Her iki tarafta balmumu uygulayın. Balmumu katılanınca opak olur. Kılcal damardan hava kabarcıkları hariç tutmak için dikkat edin (Şekil 2C).
NOT: Bitmiş numune soğuduğunda, patlayıcı kaynamaya ve kavitasyon ceplerine neden olabileceğinden aşırı ısınmaya karşı durun. - Daha sonra, bir neşter kullanarak kılcal damar dış aşırı balmumu kazımak ve ince doku kağıt ile temiz silin.
3. Numunenin montajı
- Stereomikroskopun altına bir mikrobobin yerleştirin ve mikrobobiyi sabit tutarken cımbız kullanarak numuneyi yerleştirin(Şekil 2D).
- Solenoid bobin içinde kılcal kaydırarak, mikrobobin de örnek ortalamak için bir çubuk kullanın.
- İsteğe bağlı olarak, kılcal damarın konumunu düzeltmek için yapışkan bant uygulayın.
- Duyarlılık farklılıklarının neden olduğu MR sinyal yıkımını önlemek için solenoid bobinin içinde hava kabarcıklarının görünmemesini sağlamak için kılcal damarı inceleyin.
- Mikrobobiyi prob tabanının soketine takın, mikrobobiyi dik tutarken(Şekil 3A,3B).
- Degradenin su soğutma konektörlerini prob tabanıyla eşleştirirken üç eksenli degrade bobinleri mikrobobinin üzerine dikkatlice kaydırın(Şekil 3C). Degradeyi yerinde düzeltmek için vida ipliğini prob tabanında çevirin.
NOT: Bu adım yalnızca bir Micro5 prob için geçerlidir. Micro2.5 veya Biospect gibi diğer sistemlerde, degradeler bobinden ayrı bir soket üzerindedir.
4. Bobin özelliklerinin belirlenmesi
- Bobin ilk kez test edilirse, güç kalibrasyonu ve B1 homojenlik testleri için yararlı olan homojen bir örnek oluşturmak için referans numune çözeltisini kullanın. Bobin telleri nedeniyle potansiyel duyarlılık sorunları bu referans numune si ile kolayca test edilebilir.
- Prob'u mıknatısa takın ve gerekli kabloları bağlayın: RF iletim/alma kablosu, su soğutma hatları, termokupl kablosu ve hava soğutma hattı.
- Su soğutma ünitesi için istenilen su soğutma sıcaklığını (tavsiye edilen 298 K) ayarlayın.
- Hedef sıcaklığı (298 K) ve hedef gaz akışını (300 L/h) ayarlayın. Gaz akışı farklı bir bobin tasarımı veya örnek hacmi için farklı olabilir. Bu sadece sıcaklık kontrol sistemine sahip sistemler için geçerlidir.
NOT: Sonraki adımlar yalnızca yeni (ev yapımı) bobinleri test ederken gereklidir. - Prob'u 50 Ω ortak eksenel kablo kullanarak, hedeflenen rezonans frekansına odaklanmış, uygun geniş süpürme genişliğine (400 MHz) sahip bir ağ analizörüne bağlayın.
- Prob tabanında bulunan değişken eşleştirme ve ayar kapasitörlerini ayarlayarak rezonans modlarını gözlemleyin.
- Rezonans modunu istenilen frekansta ayarlayın ve eşleştirin.
- İsteğe bağlı olarak, ağ çözümleyicisi üzerinde bobin kalite faktörü (Q-faktörü) belirleyin. Kalite faktörünün elde edilmesinde kullanılan yöntemlerden biri, bir bağlantı ağı kullanmak ve merkez frekansını(fc)-7 dB'deki yansıma dibinin genişliğine göre bölmektir (yani, Q = fc /(f1 - f2)14. Mıknatısınçalışma frekansına fc ayarlayın, f1 ve f2 ise fc'ninsolunda ve sağında -7 dB noktasına ayarlanır. Bazı ağ çözümleyicilerinde yerleşik Q-faktörü tayini vardır.
- Tarayıcıda genellikle titreme eğrisi olarak adlandırılan bir yansıtma testi başlatın ve gerektiğinde ayarlama ve eşleştirmeyi ayarlayın. Yeni bobinler için herhangi bir ayar ve eşleşen kapasitörleri kendi aralığının orta noktasına ayarlamak için önerilir. Bu nedenle, yüksek spektral süpürme genişliği ile başlayın. Bazı durumlarda, bir ağ çözümleyicisi üzerinde mıknatıs dışında bobin ayarlamak ve maç daha uygun olabilir.
- Varsa görüntüleme sondasının en büyük hacim bobini için bir şim dosyası seçin. Daha önce kullanılmış bir bobinden başlayarak, kullanılabilir bir şim dosyası kullanın. Her iki seçenek de kullanılamıyorsa, 0 olarak ayarlanmış tüm şim değerleriyle başlayın.
- Görüntüleme yazılımında (yani ParaVision)'da mevcutsa, mikrobobin için doğru bobin yapılandırmasını seçin. Aksi takdirde, sistemin el kitabına göre bobinin özelliklerine (örn. tek ayarlı veya çift ayarlı) eşleşen yeni bir bobin konfigürasyonu oluşturun. Bu araştırmada kullanılan bu solenoid mikrobobinin güvenli limitleri 1,5 mm iç çapı 1 W tepe gücünde ve 1 mW sürekli güçte 1 mm'dir.
DİkKAT: Mikrobobinler için gerekli olan küçük kapasitörler (genellikle 1 mm boyutunda) yüksek gerilimlerden dolayı son derece hassastır ve kolayca hasar görür. Otomatik darbe gücü tayini standart olmayan bobinlerle çalışmayabilir ve çok yüksek güçler bobine veya spektrometrenin diğer kısımlarına zarar verebilir. Bu nedenle, el ile ayarlamalar önerilir. - Bobin için doğru RF gücü göstergesini elde etmek için yeni bir bobin için bir nutasyon eğrisi kaydedin (Şekil 4). Bobinin güvenli limitlerinin bilinmemesi durumunda, 0,6 W'lık düşük darbe gücünde 10 μ'lık bir güçle başlayın ve sinyal görünene kadar darbe uzunluklarını bir seferde 1 μ artırın.
- Degrade kodlama yokluğunda bir FID deneyi kullanarak, darbe gücünü sabit tutarken RF-pulse uzunluğunu sistematik olarak değiştirin. İdeal darbe uzunluğu sinyal yoğunluğunun maksimuma ulaştığı darbe uzunluğudur. Yeni bir bobin test ediyorsanız, ilk önce çok düşük güçle 10 μs darbe kullanın ve darbe gücünü kademeli olarak artırmaya başlayın.
NOT: Bobin özellikleri ve spektrometre kombinasyonu için gücün beklenenden çok daha yüksek olması durumunda, bu zaten yanlış rezonans modunun seçildiğinin bir göstergesidir. - Homojen B1-alana sahip bir bobin için, solenoid bobin gibi, sinyal yoğunluğunun sıfıra düştüğü 180° darbeyi belirleyin22.
- Degrade kodlama yokluğunda bir FID deneyi kullanarak, darbe gücünü sabit tutarken RF-pulse uzunluğunu sistematik olarak değiştirin. İdeal darbe uzunluğu sinyal yoğunluğunun maksimuma ulaştığı darbe uzunluğudur. Yeni bir bobin test ediyorsanız, ilk önce çok düşük güçle 10 μs darbe kullanın ve darbe gücünü kademeli olarak artırmaya başlayın.
- Belirlenen 90° darbe gücünü oluşturulan çalışmanın ayar kartına ayarlayın. ParaVision'da, referans güç ayarlama kartı sabit darbe gücünü girmek için kullanılabilir.
- Mıknatıs ın içindeki bobinin konumunu bulmak için üç ana eksenin her birinde bir dilim olmak üzere 3 dilimli yerelleştirici bir taraya kullanın. Bunu yapmak için, spektrometrenin varsayılan kitaplığından bir yerelleştirici tazyik yükleyin. Ofset olmadan geniş bir görüş alanı ile başlayarak önerilir. Otomatik bir alıcı kazanç ayarlaması yapın ve ölçümü el ile başlatın.
NOT: Örnek tam olarak degrade sisteminin merkezindeyse, yerelleştirici talan örneği gösterir. Bobin veya örnek görüntü dilimlerinde ortalanmış veya eksik değilse, yerelleştirici taraya ayarlanması gerekir, bu durumda adım 4.12 yeniden gerçekleştirilmesi gerekir. - Alternatif olarak, görüntü değerlendirmesine dayalı olarak doğru 90° darbeyi bulmak için tamamlayıcı bir yol kullanın. Yaklaşık darbe gücü nutation eğrisi kullanılarak bulunduğunda, B1-alan homojenliği için görüntüyü kontrol etmek için darbe güçlerini kademeli olarak ayarlayın. Homojen olmayan B1 alanına sahip bazı bobinler için, sıva eğrisi kullanılarak belirlenen 90° darbe gücü fazla büyütülebilir ve bu da bobinin istenilen tatlı yerinde aşırıya kalarak abartılabilir. Bu durumda, referans darbe gücünü azaltın ve yeni görüntüleri önceki görüntülere karşı kontrol edin (Şekil 5).
- FID sinyaline göre manyetik alanı manuel olarak şim. İlk şimleme için önerilen sıra Z-Z2-Z-X-Y-Z-Z2-Z-XY-XZ-YZ-Z'dir. Bir solenoid durumunda, ana simetri ekseni XY düzlemindedir. Bu nedenle, farklı yönlerdeki şimler, bu bobin konfigürasyonu için B0 homojenliğinin daha güçlü bir şekilde düzeltilmesine neden olabilir. Yüksek sıralı şimlerin çok az etkisi vardır ve göz ardı edilebilir.
- Üreticinin protokolü18uyarlanmış farklı sistemler arasında mikrocoil özellikleri karşılaştırmasağlamak için bir hacim normalleştirilmiş SNR hesaplayın. Burada kullanılan mikrobobinler için, aşağıdaki parametrelere sahip bir spin-echo dizisi kullandık: görüş alanı (FOV) 6 mm x 6 mm, tekrarlama süresi (TR) 1000 ms, yankı süresi (TE) 7 ms, Matrix 256 x 256 ve dilim kalınlığı = 0,5 mm. Alıcı kazancı üniter olana kadar dilim kalınlığını ayarlayın. Ardından, dilimlerin B1-alan homojenliği bölgesinin ötesine uzanabilmesi için dilim sayısını ayarlayın. Mümkünse, sinyal ortalaması olmadan görüntüleri kaydedin.
- SNR (SNR/mm3)hacmini iki adımda belirleyin. İlk olarak, voxel hacmini hesaplamak (Vvoxel)(Eq. 1):
(1)
NOT: D x, Dy ve Ddilimlerinin üniteleri mm'dir. Bu hesaplama aynı şekilde bir dizi dilim için de gerçekleştirilebilir. - Numunenin sinyal yoğunluğunu(μYatırım Getirisi)ve numunenin dışındaki bir bölge için sinyal yoğunluğunu(μgürültüsü)ve standart sapmayı (σgürültü)belirlemek için ilgi bölgelerini seçin. Ortalama sinyal görüntünün merkezinden alınırken, ses sinyali köşe yamaları üzerinden hesaplanır(Şekil 6). Bu hesaplamalar için spektrometre kontrol yazılımı veya genel amaçlı görüntü işleme yazılımı kullanılabilir. Farklı bobinler arasında karşılaştırılabilirliği korumak için mümkünse tek bir yineleme kullanın.
- Normalleştirilmiş bir snr hacmini hesaplamak için değerleri kullanın (Eq. 2):
(2)
Referans çözeltisi ile birlikte burada kullanılan bobin için, aşağıdaki çözeltide Eq. 2 sonuçları kullanılarak:
(3)
NOT: Bobinlerin SNR'sini farklı manyetik alan mukavemetlerinde karşılaştırırken, çok uzun bir tekrarlama süresi ve çok kısa yankı süresi kullanılmadığı sürece, hayaletin gevşemeözelliklerinin 23olarak ölçülmesi gerekir.
- SNR (SNR/mm3)hacmini iki adımda belirleyin. İlk olarak, voxel hacmini hesaplamak (Vvoxel)(Eq. 1):
- Manyetik alan yetersizliğinden kaynaklanan duyarlılık problemlerini kontrol edin: birden fazla degrade-eko (MGE) dizisini yükleyin ve çalıştırın (Şekil 7). Degrade yankı, statik alan yetersizliği nedeniyle defaze olan spinlere yeniden odaklanmadığı için, duyarlılık farklılıklarına bağlı manyetik alan inhomojeniteleri daha uzun yankı sürelerine sahip görüntülerde görülebilir. Bu şekilde, örnekteki homojenlikler (numunedeki hava boşlukları nedeniyle) ve bobin materyalinin getirdiği B0 alan inhomogeneities görüntülenebilir. Kullanılan spektrometre ve bobinözelliklerine bağlı olarak ayarlanacak aşağıdaki parametreleri kullanın: TR 200 ms, 48 yankıları ile TE 3.5 ms aralıklı 3.5 ms, çevirme açısı 30 derece. Matris boyutu 128 x 128.
NOT: Rezonans (titreme) eğrisinde birden fazla (potansiyel) rezonans modu veya yansıma dipleri gözlendiyse, en hassas olanı belirlemek için her rezonans modu için yukarıdaki adımları tekrarlayın. Mikrobobine bağlı olarak, mikrobobin tertibatının farklı bölümleri istenmeyen rezonans modlarına yatkın olabilir.
(1)
(2)
(3)5. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme
- Aşağıdaki parametrelerle 3D FLASH deneyi çalıştırın: TR 70 ms, TE 2.5 ms, matris boyutu 128 x 64 x 64, FOV 1.6 x 0.8 x 0.8 mm, çevirme açısı 30°, ve alıcı bant genişliği 50 kHz.
- Darbe güçlerini daha önce belirlenen referans darbe gücünden türetin; bu çoğu görüntüleme yazılımında otomatiktir. Otomatik ayarlamaları kullanarak alıcı kazancını belirleyin. Diğer adı takma önlemek için tüm nesneyi her iki faz kodlama yönde kaplayarak gerekirse FOV'u ayarlayın. Denemenin görev döngüsünün degrade bobinlerinin özellikleri içinde kaldığını doğrulamak için, sistemde varsa bir degrade görev döngüsü simülasyonu çalıştırın.
NOT: Bu parametreler gösteri için kullanılan bobine özgüdir; yerel sistem özelliklerini optimize etmek önemlidir.
6. Daha fazla çalışma veya depolama için numuneleri geri alma
- Örnek kılcal damarı mikrocoil'den çıkarın.
- Cımbız kullanarak, bir stereomikroskop altında balmumu fişleri çıkarın.
- Tercih edilen bir çözüm le numuneyi kılcal damardan yıkamak için bir şırınga kullanın. Alternatif olarak, numuneyi çıkarmak için cam bir itici çubuk kullanın.
- Numunenin susuzolmasını önlemek için, depolama için uygun bir ortamda saklayın.
Representative Results
Bobin Karakterizasyonu
Bir bobinin başarılı bir şekilde ayarı ve eşleşmesi üzerine, performansı Bobin Q-faktörü, 90° referans darbesi ve SNR/mm3ile karakterize edilebilir. Burada gösterilen 1,5 mm ID duyarlılık uyumlu solenoid bobin için, ölçülen Q-factor (boşaltılmış) 244 iken, 5 mm'lik kuş kafesi bobini için 561 mm idi.
Referans 90° darbe 0.6 W güç seviyesinde 12 μs idi; cf. 5 mm'lik kuş kafesi bobini için 45 W'da 5 μs(Şekil 4 ve Şekil 5). Bu bir RF darbe alanı gücü eşittir(B1), 
mikrobobin için 0.53 mT kullanarak ve 1.17 mT kuş kafesi bobin i için14 y jiromanyetik oranı ise tau darbe süresi. Darbe güç seviyeleri(P)farklı olduğundan, bobinler iletim verimliliği açısından karşılaştırılabilir 
: 0.69 mT/W1/2 ve 0.18 mT/W1/2 mikrobobin ve kuş kafesi için sırasıyla14. 90° darbe ile karşılaştırıldığında, mikrobobinin kuş kafesi bobininden 4 kat daha hassas ≈ bir faktör olduğu saptandı.
Duyarlılık eşleştirmesinin etkisi
Ultra yüksek alan mukavemetlerinde, örnek ve bobin duyarlılığı Şekil 7A,7B'degörüldüğü gibi görüntü kalitesi için baskın bir faktör haline gelir. Duyarlılık eşleşen sıvı rezervuarı olmayan bir bobinle karşılaştırıldığında, sinyal referans numunede daha uzun ve daha homojen bir şekilde korunur. Ancak, duyarlılık rezervuarı nedeniyle, maksimum numune boyutları rezervuar olmadan bobin e göre azalır.
Yüksek çözünürlüklü görüntüleme
Bir Medicago truncatula kökü örneğinin 13 x 13 x 13 μm3 yüksek çözünürlüğe 20 saat 23 dakikada ulaşıldı(Şekil 8). Kök yüzeyinden başlayarak, kök korteks, kök dışında bazı artık su ile birlikte görülür. Ayrıca, ksilem phloem çevreleyen karanlık bir bant olarak gözlenir. Bazı hava cepleri tam sinyal kaybı ile karanlık noktalar olarak gözlenir.
M. truncatula simbiyotik kök nodülleri de bu protokol kullanılarak görüntülenebilir(Şekil 9). Biraz daha büyük eşsiz bir bobin (uzunluk yaklaşık 3500 μm, iç çapı 1500 μm) kullanılarak, 33 dakikada 16 x 16 x 16μm'ye kadar çözünürlüğe sahip görüntüler elde edildi.
Şekil 1: Bir solenoid mikrobobin. (A) Solenoid bobin tasarımı tel helically döngülü oluşur, genellikle bir kılcal etrafında sarılmış. Telin kalınlığı, çapı, sargı sayısı ve tel aralığı gibi geometrisi bobin özelliklerini etkiler. (B) Duyarlılık eşleşen sıvı (Fomblin) için bir rezervuar ile ev yapımı solenoid mikrobobin. 0.4 mm kalınlığında, 1500 μm dış çapı ve 3500 μm'lik bobin uzunluğu ile kılcal damar çevresinde altı kez kaplı bakır tel yaradan oluşur. Bobin bir şırınga yapılmış bir rezervuar batırılır. Dış çapı 1000 m'ye kadar olan örnek kılcal damarlar takılabilir. İki kondansatör kullanılır, indüktörlü seri halinde 1.5 pF kondansatör, indüktöre paralel olarak ikinci bir değişken 1.5-6 pF kondansatör yerleştirilir. Tüm bileşenler fiberglas tahtaya (sarı) lehimlenir. Rezervuarı desteklemek için modifiye edilmiş bir ticari tutucuya (gri polimer) monte edilmiştir. (C) Solenoid bobin tasarım bileşenleri: 1. solenoid bobin, 2. örnek kapiller, 3. 1.5 pF alamı kondansatör, 4. değişken eşleşen kapasitör, 5. fiberglas taban plakası, 6. bakır tel yol açar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Stereomikroskop altında numune hazırlama. (A) Mikrobobinlerin hazırlanması için gerekli öğeler. Soldan sağa: 1. CuSO4 referans çözümü, 2. perfluorodecalin, 3. mikrobobin, 4. neşter, 5. pozitif gerilim cımbız, 6. cımbız, 7. kılcal damarlar dış çapı = 1000 μm, 8. balmumu kalem, 9. kılcal balmumu, 10. nitril eldiven, 11. stereomikroskop, 12. Petri çanak kapaklı cam izle, 13. büyüme substrat bitki malzemesi. Gösterilmez: Ø 0.8 x 40 mm iğne ve ince mendil kağıt ile 2 mL şırınga. (B) Her ikisi de su altında tutulurken, cımbız kullanarak bir kılcal içine örnek ekleme kapatın. (C) Erimiş balmumu kullanılarak kılcal damarsızlık mühürleme. (D) Hazırlanan kılcal damarın mikrobobinin içine yerleştirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mikro görüntüleme sondasının bileşeni. (A) Su soğutma, ısıtma, sıcaklık sensörleri, degrade gücü, RF (koaksiyel konektör görünür) ve isteğe bağlı prob tanımlama (PICS) için gerekli tüm bağlantıları içeren Micro5 prob tabanı. Prob tabanının altında, değişken ayar ve eşleşen kapasitörlerin ayarlanmasına olanak tanıyan düğümler ve prob'u spektrometrenin içinde yerinde tutmak için istinat vidaları bulunmaktadır. (B) Sonda tabanının üzerine monte edilen ev yapımı mikrobobin. Ayarı ve eşleştirmeye izin veren prob tabanına monte edilmiş değişken kapasitörlere (beyaz seramik) dikkat edin. (C) Degradenin topraklanması için su soğutma kaprisleri ve altın kaplama kontaklarla sonda tabanına monte edilmiş entegre 3 eksenel degrade. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Nutation eğrisi. Referans darbe gücünü belirlemek için bir nutation eğrisi elde edilir. Referans darbe gücü (90° darbe) z yönünde mevcut tüm manyetizasyonu enine düzleme çeviren bir B1 alanı oluşturmak için gereken güç ve darbe uzunluğunun birleşimi olarak tanımlanır. Bir dizi darbe degrade kodlama yokluğunda kaydedilir. Her darbe ile, ya darbe uzunluğu veya darbe gücü artımlı. Burada darbe gücü 0,6 W olarak ayarlanırken, darbe uzunluğu her seferinde 1 μ'lık olarak artımlanır. Maksimum sinyal yoğunluğu 90° darbeyi gösterir, yaklaşık 12 μs. 180° darbe de minimum yoğunluk kullanılarak bu şekilde belirlenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 90° darbe gücünün görsel tayini. Yaklaşık bir referans darbe gücü bir nutation eğrisi kullanılarak bulunduktan sonra, darbe uzunluğu değiştirilerek görsel olarak kontrol edilebilir. Bobine bağlı olarak, B1 alanı değişikliklere karşı az çok hassas olabilir. (A) 11 μs darbe uzunluğu. (B) 12 μs darbe uzunluğu, bu bobin için en uygun. (C) 13 μs darbe uzunluğu. (D) 20 μs darbe uzunluğu. Darbe gücü çok yüksek ayarlanırsa, aşırı devrilme oluşabilir, böylece bobinin (ok ucu) merkezindeki görüntü yoğunluğunu azaltır. Artan B1 alanı, görüntünün genişliğinde de görülebileceği gibi bobinin menzilini de artırır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İlgi Alanı yerleşimi. Normalleştirilmiş snr hesaplaması için ilgi bölgeleri (YG) görülebilir. Ortalama örnek yoğunluğu, referans çözüm numunesi içine giren bir YG'den alınır. Ortalama gürültü ve standart sapma, görüntünün köşelerinde bulunan bir veya daha fazla YG'den hesaplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Gradyan eko görüntüleme ile değerlendirilen RF homojenliği. Bir dizi degrade yankısı kullanarak RF(B1 -Alan) homojenliğini değerlendirmek için birden fazla degrade yankı (MGE) dizisi kullanılır. Temel parametreler: tekrarlama süresi 200 ms, yankı süresi 3.5 ms yankı sayısı 48, yankı aralığı 3.5 ms, 64 ortalamalar, edinme süresi 27 m 18 s, çevirme açısı 30°. Görüş alanı 5 x 5 mm, matris 128 x 128, çözünürlük 39 x 39 x 200 μm.(A) Duyarlılık-uyumlu bobin. RF bobinini çevreleyen duyarlılık eşleştirme sıvısı (Fomblin) bobin teli nedeniyle duyarlılık etkilerini azaltır. Yankı süresi arttıkça küçük hava kabarcıkları sinyal kaybına neden olur. (B) Eşit bobin çapına sahip bir bobin (duyarlılık eşleşmez). Daha uzun yankı zamanlarında, B0 alan inhomogeneity neden artan eserler gözlenmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Medicago truncatula kök bölümünün 3boyutlu görüntülemesi. (Üst) FLASH görüntü. Epidermis (e), korteks (c), phloem (ph) ve ksilem (ksy) dahil olmak üzere kök bölümünün çeşitli özellikleri ayırt edilebilir. Kökteki hava cepleri (a) tam sinyal kaybına neden olur. Temel parametreler şunlardır: Tekrarlama süresi 70 ms, yankı süresi 2.5 ms, 256 ortalamalar, edinme süresi 20 h 23 m. Çözünürlük 13 x 13 x 13 μm3. Matris boyutu 128 x 64 x 64 ve görüş alanı 1.6 x 0.8 x 0.8 mm idi. Alıcı bant genişliği 50 kHz. (Alt) MSME görüntüsü. Temel parametreler şunlardır: Tekrarlama süresi 500 ms, yankı süresi 5.2 ms, 28 ortalama, kazanım süresi 15 h 55 m. Çözünürlük 13 x 13 x 13 μm3. Matris boyutu 128 x 64 x 64 ve görüş alanı 1.6 x 0.8 x 0.8 mm idi. Alıcı bant genişliği 70 kHz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Medicago truncatula kök nodülünün 3boyutlu görüntülemesi. (Üst) Düşük çözünürlüklü görüntü. Temel parametreler şunlardır: Tekrarlama süresi 60 ms, yankı süresi 2.3 ms, 4 ortalama, edinme süresi 4 m. Çözünürlük 31 x 31 x 31 μm3. Matris boyutu 64 x 32 x 32 ve görüş alanı 2 x 1 x 1 mm idi. Alıcı bant genişliği 50 kHz. (Alt) Yüksek çözünürlüklü görüntü. Temel parametreler şunlardır: Tekrarlama süresi 60 ms, yankı süresi 2.3 ms, 8 ortalama, edinme süresi 33 m. Çözünürlük 16 x 16 x 16 μm3. Matris boyutu 128 x 64 x 64 ve görüş alanı 2 x 1 x 1 mm idi. Alıcı bant genişliği 50 kHz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Birçok malzeme ve jeolojik numune, burada kullanılan diziler tarafından görüntülenemez önemli ölçüde kısa T2 gevşeme süreleri olduğundan, bu protokol biyolojik numuneler için en uygun olanıdır. Hatta bazı biyolojik dokular, hangi yüksek örnek manyetik duyarlılık heterojenite sergileyen, etkileri alan gücü 24 ile ilişkili olarak ultra-yüksek alanda görüntü zor olabilir24. Protokol sadece yeni bobinler için yararlı değil, aynı zamanda sorun giderme ve potansiyel sorunların tanısında yardımcı olabilir. Yeni veya bilinmeyen örnekleri sınarken, bu protokol, deneme kurulumunun belirtimlere göre çalıştığını doğrulamak için başvuru çözümü üzerinde önceden gerçekleştirilebilir. Spektrometre yapıtve arıza kaynağı olarak dışlanabileceğinden, sorun gidermede bu yardımcı olur. Buna ek olarak, bu, prob üzerindeki ayar ve eşleşen kapasitörleri mikrobobin için tipik değerlere ayarlar.
İlk denemede sinyal kaydedilmezse, yerelleştirici scan'ın görüş alanı büyütülebilir ve numunenin görülip görülmediğini kontrol eder. Ardından, bobinin doğru ayarlanıp ayarlanıp ayarlatılolmadığını yeniden kontrol edin ve başka bir yerelleştirici tarayıp denemeyi deneyin. Bobinin ek istenmeyen rezonans modları sergilemesi mümkündür, bu durumda doğru olanın belirlenmesi gerekir. Hala görüntü elde edilenemezse, mikrobobin tertibatıiçindeki konumunu kontrol etmek için numuneyi çıkarın ve numunenin sağlam olduğunu doğrulayın (örn. mühürlerde hava kabarcığı veya sızıntı yok). Son olarak, pfd yerine su ile bir örnek hazırlanabilir. Numunenin lokalize tbmada çok az tespit edilebilir sinyal vermesi durumunda, kılcal damardaki su hala tespit edilebilir.
Mikrobobinler ideal olarak örneğe çok yakın olduğundan, hava ve tel arasındaki manyetik duyarlılık farkları Şekil 7B'degörüldüğü gibi ek sinyal kaybına neden olabilir. Potansiyel eserler mekansal yanlış haritalama ve anormal sinyal yoğunluğu değişimi içerir. Özellikle degrade-eko tipi darbe dizileri bu tekdüze olmayan sinyal kaybından etkilenir. Bu nedenle, florinert sıvı (Fomblin veya FC-43) tel batırarak, bir duyarlılık eşleşen bobin sundu. Bu protokolde yer alan B1 tahmin yöntemi, B1 duyarlılık farklılıklarının bobin tertibatının tasarımına duyarlılık eşleştirme stratejilerinin dahil edilmesini gerektirip gerekmediğini belirlemeye yardımcı olabilir. Bir duyarlılık uyumlu bobin oluşturmak için alternatif bir yaklaşım duyarlılık eşleşen telkullanmaktır 25. Ayrıca, sadece bobin nedeniyle duyarlılık sorunları bu yaklaşım ile ele alınmaktadır. Numunenin içindeki duyarlılık uyuşmazlıkları (örn. hava boşlukları nedeniyle) zorlu olmaya devam eder.
Hava cepleri veya kabarcıklar, hava nın ve sıvı nın veyanumunenin arabirimindeki duyarlılık farklılıklarının neden olduğu kapsamlı sinyal kaybına neden olan deneysel bir sorun teşkil eder(Şekil 5A). Başarılı numune hazırlamanın kritik bir yönü hem numunenin hem de kapillerin batırışıdır. Ancak, küçük kabarcıklar bile, özellikle degrade yankı türü dizileri için sinyal kayıplarına neden olabilir. Mobil hava kabarcıkları, numuneyle temas edene kadar kılcal damardan geçebilirler. Bu etkilerden bazıları kılcal damarı hafifçe yatırarak hafifletilebilir, böylece bir ucu diğerinden daha yüksektir. Eğim, numuneyi rahatsız etmeden potansiyel hava kabarcıklarının üst uçta yerinde tutulmasını sağlar. Dehidratasyon büyük hava kabarcıkları oluşturmak için neden olabilir gibi, kılcal balmumu iyi bir mühür formları kontrol etmek de önemlidir.
Numunenin içindeki hava boşlukları için, PFD hücre zarlarını delmezken hücreler arası hava alanlarını doldurmak için kullanılmıştır26. Ancak, bu yaklaşımla bile, tüm hava alanlarını kaldırabildik. Ayrıca, bu yaklaşım biz genellikle mümkün olduğunca noninvaziv bir sistem çalışma arzusu nedeniyle tercih edilmez ek bir ajan, ihtiyaç anlamına gelir.
Kılcal damarların silindirik şekli, perfüzyon kurulumlarının özellikle biyopsiler veya canlı kök materyalindeki çalışma süreçleri gibi çürümeye karşı savunmasız dokular için uygun olması gerektiği anlamına gelir. İki adım bir perfüzyon kurulum fark edebilirim. İlk olarak, bir orta yem tüpü yanı sıra kılcal bir drenaj tüpü bağlamak bir chemostat oluşturmak için yeterli olacaktır. İkinci olarak, örnek kılcal damarına bir girintineklenmesi, numuneyi akış yönüne karşı yerinde tutabilir. Bu düzlemsel microcoils10için yayınlanan bir protokol benzer.
MR görüntülemenin noninvaziv yapısı, bu protokolde kullanılan inert sıvı ile birlikte (PFD veya Fomblin) deneylertamamlandıktan sonra, numuneler daha fazla çalışma için kılcal damarlarından çıkarılabilir anlamına gelir. Kombinasyonlar optik veya elektron mikroskobu ve diğer yıkıcı görüntüleme tekniklerini içerir. Son zamanlarda Medicago truncatula kök nodülleri27optik mikroskopi ile bir arada göstermiştir.
Biz ultra-yüksek alan NMR spektrometre üzerinde özel mikrobobinler kullanarak bitki materyalgörüntüleme için bir yöntem göstermiştir. Nispeten büyük numune hacimleri iyi RF homojenliği ile yüksek çözünürlükte incelenebilir. Ayrıca, spektroskopik görüntüleme başka türlü mümkün olandan daha yüksek çözünürlüklerde yapılabilir. Mikrobobin tasarımının numunelere uyarlanması, bobin performans özelliklerini belirlemek için etkili bir yöntemle kolaylaştırılır. Solenoid bobin yaklaşımı da kolayca hayvan dokusu da dahil olmak üzere bitkiler dışında diğer örnekler, uygulanabilir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
950 MHz'lik cihazdaki deneyler, Hollanda'nın NWO tarafından finanse edilen Ulusal Yol Haritası Büyük Ölçekli Tesisi uNMR-NL tarafından desteklendi (proje 184.032.207). R.S. BioSolarCells konsorsiyum projesi U2.3 tarafından desteklendi. J.R.K. Hollanda Manyetik Rezonans Araştırma Okulu (NMARRS) lisansüstü okulu [022.005.029] tarafından desteklendi. Medicago truncatula örneklerini sağladıkları için Defeng Shen ve Ton Bisseling'e teşekkür ederiz. Klaartje Houben, Marie Renault ve Johan van der Zwan'a uNMR-NL tesisinde teknik destek için teşekkür ederiz. Ayrıca Volker Lehmann, Henny Janssen ve Pieter de Waard'a teknik yardım için teşekkür ederiz. Frank Vergeldt, John Philippi ve Karthick B. Sai Sankar Gupta'ya tavsiyelerinden dolayı şükranlarımızı sunuyoruz. Son olarak, jessica de Ruiter'e videonun seslendirmesini sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reference solution preparation | |||
| CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
| D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
| Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
| Sample preparation | |||
| Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
| Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
| Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
| Syringe | Generic | - | Used to apply PFD and manipulate the sample |
| Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
| Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
| Imaging Hardware | |||
| 22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
| Air cooler | Bruker GmbH | - | Used to regulate probe temperature |
| Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
| Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
| Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
| RF microcoil | Home-built | - | contains Fomblin |
| Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
| Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |
References
- Ciobanu, L., Pennington, C. H. 3D micron-scale MRI of single biological cells. Solid State Nuclear Magnetic Resonance. 25 (1-3), 138-141 (2004).
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Radecki, G., Nargeot, R., Jelescu, I. O., Le Bihan, D., Ciobanu, L. Functional magnetic resonance microscopy at single-cell resolution in Aplysia californica. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8667-8672 (2014).
- Lee, C. H., et al. Magnetic Resonance Microscopy (MRM) of Single Mammalian Myofibers and Myonuclei. Scientific Reports. 7 (1), 39496 (2017).
- Callaghan, P. T. Principles of nuclear magnetic resonance microscopy. , Oxford University Press. Oxford. (1994).
- Glover, P., Mansfield, S. P. Limits to magnetic resonance microscopy. Reports on Progress in Physics. 65 (10), 1489-1511 (2002).
- Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and analysis of microcoils for NMR microscopy. Journal of Magnetic Resonance. Series B. 108, 114-124 (1995).
- Lee, C. H., Flint, J. J., Hansen, B., Blackband, S. J. Investigation of the subcellular architecture of L7 neurons of Aplysia californica using magnetic resonance microscopy (MRM) at 7.8 microns. Scientific Reports. 5, 11147 (2015).
- Fratila, R. M., Velders, A. H. Small-Volume Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Annual Review of Analytical Chemistry. 4 (1), 227-249 (2011).
- Flint, J. J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition. Journal of Visualized Experiments. (128), 1-10 (2017).
- Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design. Part I: Optimizing RF homogeneity and coil dimensions. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (2), 128-142 (2001).
- Vegh, V., Gläser, P., Maillet, D., Cowin, G. J., Reutens, D. C. High-field magnetic resonance imaging using solenoid radiofrequency coils. Magnetic Resonance Imaging. 30 (8), 1177-1185 (2012).
- Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design Part II: Optimizing winding parameters for maximum signal-to-noise performance. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (3), 190-210 (2001).
- Haase, A., et al. NMR probeheads for in vivo applications. Concepts in Magnetic Resonance. 12, 361-388 (2000).
- Webb, A. G. Radiofrequency microcoils for magnetic resonance imaging and spectroscopy. Journal of Magnetic Resonance. 229, 55-66 (2013).
- Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and Analysis of Microcoils for NMR Microscopy. Journal of Magnetic Resonance, Series B. 108 (2), 114-124 (1995).
- Olson, D. L., Peck, T. L., Webb, A. G., Magin, R. L., Sweedler, J. V High-Resolution Microcoil 1H-NMR for Mass-Limited, Nanoliter-Volume Samples. Science. 270 (5244), (1995).
- Oerther, T. Micro Imaging Manual for AV3 Systems. , Bruker Biospin GmbH. Rheinstetten, Germany. (2012).
- Callaghan, P. T. Susceptibility and Diffusion Effects in NMR Microscopy. Encyclopedia of Magnetic Resonance. , (2007).
- Donker, H. C. W., Van As, H., Snijder, H. J., Edzes, H. T. Quantitative 1H-NMR imaging of water in white button mushrooms (Agaricus bisporus). Magnetic Resonance Imaging. 15 (1), 113-121 (1997).
- Tsai, W. T. Environmental property modelling of perfluorodecalin and its implications for environmental fate and hazards. Aerosol and Air Quality Research. 11 (7), 903-907 (2011).
- Keifer, P. A. 90° pulse width calibrations: How to read a pulse width array. Concepts in Magnetic Resonance. 11 (3), 165-180 (1999).
- Vlaardingerbroek, M. T., den Boer, J. A. Magnetic Resonance Imaging: Theory and Practice. , Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg. 05252-05255 (2003).
- Schenck, J. F. The role of magnetic susceptibility in magnetic resonance imaging: MRI magnetic compatibility of the first and second kinds. Medical Physics. 23 (6), 815-850 (1996).
- Kc, R., Henry, I. D., Park, G. H. J., Aghdasi, A., Raftery, D. New solenoidal microcoil NMR probe using zero-susceptibility wire. Concepts in Magnetic Resonance Part B: Magnetic Resonance Engineering. 37 (1), 13-19 (2010).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).
- van Schadewijk, R., et al. Magnetic Resonance Microscopy at Cellular Resolution and Localised Spectroscopy of Medicago truncatula at 22.3 Tesla. Scientific Reports. 10 (1), 971 (2020).
