Summary
血液脳関門(BBB)は、マイクロバブル媒介性集中超音波(FUS)で一時的に破壊することができる。ここでは、非超音波専門家がアクセス可能なモジュラーFUSシステムを使用して、高スループットBBBのインビボでの開口のためのステップバイステッププロトコルについて説明する。
Abstract
血液脳関門(BBB)は、様々な脳疾患の治療のための主要なハードルとなっています。狭い接合によって連結された内皮細胞は、大きな分子(>500 Da)が脳組織に入るのを防ぐ生理的障壁を形成する。マイクロバブル媒介型集中超音波(FUS)は、一過性の局所BBB開口部を誘導するために使用することができ、より大きな薬物が脳の気質に入ることを可能にする。
臨床翻訳のための大規模な臨床装置に加えて、薬剤候補の治療応答評価のための前臨床研究は、標的BBB開口部のための専用の小動物超音波セットアップを必要とする。これらのシステムは、高空間精度と統合キャビテーションモニタリングの両方でハイスループットのワークフローを可能にする一方で、初期投資コストとランニングコストの両方でコスト効率が良いものです。
ここでは、市販成分に基づき、前述の要件を満たす生物発光及びX線誘導体系小型動物FUSシステムを提示する。特に、大量の前臨床薬物評価研究で一般的に遭遇する課題を促進する高度な自動化に重点が置かれている。これらの課題の例として、データの再現性を確保し、グループ内変動を低減し、サンプルサイズを削減し、倫理的要件に準拠し、不要な作業負荷を軽減するために標準化が必要です。提案されたBBBシステムは、多形性神経膠芽腫およびびまん性正中性神経膠腫の患者由来異種移植片モデルに対するBBB開封促進薬物送達試験の範囲で検証された。
Introduction
血液脳関門(BBB)は、脳のパレンチマへの薬物送達のための主要な障害です。開発されたほとんどの治療薬は、その物理化学的パラメータ(例えば、親油性、分子量、水素結合アクセプターおよびドナー)のためにBBBを横断しないか、または脳内の流出輸送体に対する親和性のために保持されない1、2。BBBを横断できる薬物の小さなグループは、典型的には小さな親油性分子であり、これは限られた数の脳疾患1,2にのみ有効である。その結果、大多数の脳疾患では、薬理学的治療の選択肢が限られており、新しい薬物送達戦略が3,4に必要である。
治療超音波は、BBB破壊(BBBD)、神経変調、およびアブレーション4、5、6、7などの異なる神経学的用途に使用することができる新たな技術である。頭蓋骨を介して体外超音波エミッタを有するBBB開口部を達成するために、集中超音波(FUS)は、マイクロバブルと組み合わされる。マイクロバブル媒介FUSは、脳のパレンチマ5、8、9における薬物の生物学的利用能の増加をもたらす。音波の存在下では、マイクロバブルがBBBの内皮細胞間の緊密な接合部の開始と破壊を開始し、より大きな分子10の細胞内輸送を可能にする。これまでの研究では、音響放射の強度とBBB開口部11、12、13、14に及ぼす生物学的影響との相関が確認された。FUSは、マイクロバブルと組み合わせて、化学療法剤としてテモゾロミドまたはリポソームドキソルビシンを用いた神経膠芽腫の治療、またはアルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症5、9、15、16の治療に対する臨床試験で既に使用されている。
超音波は、薬物療法のための全く新しい可能性のBBB開口部を介して仲介するので、臨床翻訳のための前臨床研究は、選択された薬物候補の治療応答を評価するために必要とされる。通常、高空間精度の高スループット ワークフローと、高い再現性を備えたターゲット BBB 開口部の監視用の統合キャビテーション検出が必要です。可能であれば、これらのシステムは、研究規模に応じてスケーラブルにするために、初期投資とランニングコストの両方でコスト効率が高い必要があります。ほとんどの前臨床FUSシステムは、画像誘導および治療計画15、17、18、19のためにMRIと組み合わされる。MRIは腫瘍の解剖学と容積に関する詳細な情報を提供するが、それは一般的に訓練を受けた/熟練したオペレータによって行われる高価な技術である。さらに、高精細MRIは、常に前臨床施設の研究者が利用できるとは限らず、動物1匹あたりのスキャン時間が長く必要であり、高スループットの薬理学的研究にはあまり適していません。注目すべきは、神経腫瘍学の分野における前臨床研究、特に浸潤性腫瘍モデルのために、腫瘍を可視化し標的にする可能性が治療の成功20に不可欠である。現在、この要件はMRIまたは光タンパク質を導入した腫瘍によってのみ満たされ、光タンパク質基質の投与と組み合わせて生物発光イメージング(BLI)による可視化を可能にする。
MRI誘導FUSシステムは、多くの場合、経頭蓋適用のための超音波の伝播を確実にするために水浴を使用し、それによって動物の頭部は部分的に水中に沈み、いわゆる'ボトムアップ'システム15、17、18。これらの設計は一般的に小さな動物実験でうまく機能しますが、使用中の動物の準備時間、移植性、現実的に維持可能な衛生基準の間の妥協点です。MRIの代替として、立体的ナビゲーションのための他の誘導方法は、げっ歯類解剖学的アトラス21、22、23、レーザーポインタ支援視覚目撃24、ピンホール支援機械スキャン装置25、またはBLI26の使用を包含する。これらの設計のほとんどは、トランスデューサーが動物の頭の上に置かれ、動物が自然な位置に置かれる「トップダウン」システムです。'トップダウン'のワークフローは、水浴22、25、26または水で満たされたコーン21、24のいずれかで構成されています。閉じたコーンの内部のトランスデューサーを使用することの利点は、よりコンパクトなフットプリント、セットアップ時間の短縮、簡単な除染の可能性がワークフロー全体を簡素化することです。
マイクロバブルとの音響場の相互作用は圧力依存性であり、低振幅振動(安定キャビテーションと呼ばれる)から過渡的な気泡崩壊(慣性キャビテーションと呼ばれる)27,28に及ぶ。超音波BBBDは、BBBDを成功させるために安定キャビテーション閾値をはるかに上回る音響圧力を必要とするが、慣性キャビテーション閾値を下回るが、一般的に血管/神経損傷29に関連しているという確立されたコンセンサスがある。監視および制御の最も一般的な形態は、McDannoldらが示唆する(バック)散乱音響信号の分析である受動的キャビテーション検出(PCD)である。PCDは、安定キャビテーションの特徴(高調波、低調波、超高調波)と慣性キャビテーションマーカー(ブロードバンド応答)の強度と外観をリアルタイムで測定できるマイクロバブル放出信号のフーリエスペクトルの分析に依存しています。
精密な圧力制御のためのPCD解析は、マイクロバブル製剤の多分散性(振動振幅はバブル径に強く依存する)、ブランド間の気泡殻特性の違い、および音響振動の周波数と圧力30、31、32に強く依存する音響振動のために、正確な圧力制御のためのPCD分析が複雑である。その結果、多くの異なるPCD検出プロトコルが提案されており、これらのすべてのパラメータの特定の組み合わせに適応し、様々なアプリケーションシナリオ(小動物プロトコルを介したインビトロ実験から臨床用PCDまで)で使用され、堅牢なキャビテーション検出、さらには圧力11、14、30、31、32、33、34の遡及フィードバック制御に使用されています。本研究の範囲で用いられるPCDプロトコルはMcDannoldら12に直接由来し、慣性キャビテーション検出のための安定キャビテーションおよび広帯域ノイズの存在のために高調波放出を監視する。
脳のパレンチマへの薬物送達を増加させるBBBの一過性開口のための画像誘導神経ナビゲーションFUSシステムを開発しました。このシステムは、市販のコンポーネントに基づいており、動物施設で利用可能なイメージング技術に応じて、いくつかの異なるイメージングモダリティに容易に適応することができます。高スループットのワークフローが必要なため、画像誘導と治療計画にはX線とBLIを使用することを選択しました。光タンパク質を用いてトランスニューされる腫瘍細胞(例えば、ルシメラーゼ)はBLIイメージング20に適している。光タンパク質基質の投与後、腫瘍細胞は生体内でモニタリングすることができ、腫瘍の成長および位置は20,36と判定することができる。BLIは、低コストのイメージングモダリティであり、経時の腫瘍の成長に従うことを可能にし、高速なスキャン時間を有し、MRI36、37で測定された腫瘍増殖と良好に相関する。私たちは、げっ歯類が取り付けられているプラットフォームを自由に動かすための柔軟性を可能にするために、トランスデューサーに取り付けられた水で満たされたコーンで水浴を置き換えることを選びました8,24.この設計は、X線と光学画像の両立性(III)急速着脱可能な麻酔マスク、および(IV)統合された温度調節された動物加熱システムを備えた(I)小動物立体立体性プラットフォーム(II)受託者マーカーの統合を備えた取り外し可能なプラットフォームに基づいています。麻酔の最初の誘導の後、動物は全体のプロシージャの間に残るプラットホームの精密な位置に取付けられる。その結果、プラットフォーム全体が、正確で再現可能な位置決めと持続麻酔を維持しながら、介入全体のワークフローのすべてのステーションを通過します。この制御ソフトウェアは、受託者マーカーの自動検出を可能にし、すべてのタイプの画像と画像モダリティ(マイクロCT、X線、BLIおよび蛍光イメージング)を、立体的プラットフォームの基準フレームに自動的に登録します。自動較正手順の助けを借りて、超音波トランスデューサの焦点距離は正確に内部に知られており、介入計画、音響送達およびフォローアップ画像分析の自動融合を可能にする。図 1と図 2に示すように、このセットアップは、専用の実験ワークフローを設計する高い柔軟性を提供し、さまざまなステーションでの動物のインターリーブ処理を可能にし、ハイスループット実験を容易にします。我々は、この技術を用い、びまん性正中神経膠腫などの高悪性神経膠腫のマウス異種移植片における薬物送達に成功した。
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Protocol
すべてのin vivo実験は、オランダの倫理委員会(ライセンス許可番号AVD114002017841)と、オランダのアムステルダム大学の動物福祉団体によって承認されました。研究者は、動物の不快感を最小限に抑えるためにFUSシステムの基礎訓練を受けました。
1. 集中超音波システム
注:記載されているセットアップは、市販のコンポーネントに基づいて社内構築されたBBBディスラプションシステムであり、3Dプリントされたカスタムメイドのコーンと取り外し可能な立体戦術プラットフォームが含まれています。システムは、利用可能な機器と特定の用途に応じて変更を容易にするモジュラー設計されています。プロトコルは、マウス脳のポンチン領域におけるより大きな領域のソノポレーションの手順を記述する。ターゲットの位置を調整することにより、脳の異なる部分を標的とすることができます。この研究では、焦点距離75mmの1MHz単元素トランスデューサ、60mmの絞り、1.5 x 1.5 x 5mm(ピーク圧力のFWHM)の焦点領域を使用しました。トランスデューサの焦点面は、耳の棒と交差する水平面で動物の頭蓋骨を通って配置されます。
- げっ歯類のBBBの開口部のための適切なトランスデューサを選択してください。
注:マイクロバブルの特性と採用周波数に基づいて、音響設定、特に機械的指数(MI)は、13、38に変更される場合があります。 - 3D プリントされたコーンにトランスデューサを置きます。
- ビーム伝搬経路の音響結合を達成するために、コーンの底端に音響的に透明なマイラー膜を使用し、脱気水でコーンを満たす。
- 図1に示すように、トランスデューサを動物の上に取り付け、トランスデューサの自動垂直位置を設定します。
- 図 1および図 2に示すように、温度調節された加熱、咬傷および耳棒、麻酔およびマルチモダリティ受託マーカーを含む、研究の要件に基づいて取り外し可能な立体性プラットフォームを設計する。立体的プラットフォームの取り付けは、ビームの下で動物の正確な自動位置決め(<0.1mm)を可能にする2D線形段階システムで構成されています。
- トランスデューサを、トランスデューサ、ファンクションジェネレータ、パワーアンプからなる 図1 に示す音響発光チェーンに接続します。
- 画像処理パイプラインを考案して、針ハイドロフォンによって検出された脳領域の正確なソノポレーションターゲティングとキャビテーションデータの収集を可能にするマルチモダリティ受託マーカーを検出します。
- システムを較正し、立体性プラットフォーム上の動物の垂直位置に対応してトランスデューサの焦点点を決定する。
2. 動物の準備
注: 次のプロトコルは、マウスに対して指定されていますが、ラットに適合させることができます。これらの実験のために、雌の高胸腺ヌードFoxn1--マウス(6-8週齢)が使用された。
- 動物施設で少なくとも1週間順応し、定期的に動物の重量を量ることを許可します。
- FUS治療を開始する30分前に皮下(.c)注射を介してブプレノルフィン(0.05mg/kg)を投与する。
- 3%のイソフルラン、2 L/分O2 で動物を麻酔し、動物が深く麻酔されていることを確認します。動物を全手順中に麻酔を付け、呼吸頻度と心拍数を監視してイオブルランの濃度を必要に応じて調整します。
- ドライアイを防止し、可能な怪我を避けるために、眼軟膏を適用します。
- かみそりと脱毛クリームで頭の上の髪を取り除き、皮膚への刺激を避けるために任意の残留物を取り除くために水で後で洗います。
- BLI腫瘍モデルの実験では、BLI画像誘導用に29Gインスリン注射器を用いて、D-ルシフェリン(30mg/mL)腹腔内(i.p.)を150μL注入します。
- 26-30 Gの尾静脈カテーテルを挿入し、少量のヘパリン溶液(5 UI/mL)でカテーテルと静脈を洗い流します。血液凝固を避けるためにヘパリン溶液でカテーテルを充填します。
注意:カテーテルに血液が還流すると、良好なカテーテル法が見られます。塞栓を防ぐためにカテーテルの気泡を避けてください。過度の射出圧力を避けるために、カテーテルの長さができるだけ短くしてください。 - 低体温症を避けるために、温度調整された立体性プラットフォーム上に動物を置きます。
注:低体温は、マイクロバブルの注射/循環および薬物の薬物動態に影響を与える血液循環を減少させる39。 - イヤーバーと一口バーを使用して、立体性プラットフォーム上で動物の頭を固定し、固定します。ストラップで体を固定し、プラットフォームに動物の尾をテープ。
3. 生体内画像誘導集中超音波
注:このプロトコルでは、10 msの持続時間を持つトーンバーストパルスを備えた1MHzのモノ要素トランスデューサ、0.4のMI、240秒の40サイクルの1.6 Hzのパルス繰り返し周波数が使用されました。このプロトコルは、硫化物六フッ化物(SF6)を含むリン脂質を無害なガスとして安定化させたマイクロバブルに最適化されており、それによって平均気泡径は2.5μm、泡の90%以上が8μm未満である。
- 取り付けられた動物と一緒に立体性プラットフォームをイメージングモダリティ(例えば、BLI またはX線)に配置し、動物の画像を撮ります。
- 画像処理パイプラインと組み合わせてマルチモダリティの受容マーカーを使用して、トランスデューサのフォーカスポイントに従って動物の位置をマークします。
- 獲得したX線画像の上に脳の輪郭を配置するか、BLI画像を使用して腫瘍の中心を決定することによって、ターゲット領域を決定する(図2)。脳の特定の部分の位置は、頭蓋骨のマーキングブレグマとラムダを基準点として使用して、パキシノス脳アトラス40 で指定されます。例えば、ポンはラムダからx=-1.0、y=-0.8、z=-4.5の位置にあります。
- 動物の鼻孔と口を粘着テープで保護し、超音波ゲルが呼吸を妨げるのを防ぎます。
- 動物の頭の上に超音波ゲルを適用します。
- 動物の首の皮膚を引き込み、針ハイドロフォンを超音波ゲルで潤滑し、針ハイドロフォンを後頭骨の直接近傍に置く。
- 画像処理パイプラインとフォーカスポイントを使用して、トランスデューサを正しい位置に導きます。
- あらかじめ構成された設定を接続されているすべてのデバイスに適用し、対象となる脳領域をターゲットにします。
注: 研究の質問に応じて、腫瘍または脳領域は、単一の焦点として、または容積形状としてソノポポできます( 図2を参照)。 - メーカーの説明に従ってマイクロバブルをアクティブにします。120 μL (5.4 μg) のマイクロバブルを 1 個注入します。
- 尾静脈カテーテルを生理食い物で洗い流し、カテーテルの開口部を確認します。
- マイクロバブルを注入し、インソネーションを開始します。
- 針ハイドロフォンでマイクロバブルキャビテーションを記録します。
- 血管内造影剤または薬物を、ソノポレーション後に投与する。用量, タイミングと計画は、研究の目的と薬に依存します。
注:エヴァンスブルーはBBBの開口部41を評価するための一般的なカラーエージェントです。 - 所定の時間ポイントまで、または人道的エンドポイントの前まで動物を監視します。
4. マイクロバブルキャビテーションの解析
注:ここでは、MDannoldらが最初に示唆したように、1MHzの周波数で10msの持続時間のバーストトーンパルスで励起された平均直径2.5μm(8μm以下の気泡の80%)を有するSF6-リン脂質微小気泡の生体内実験に適した適用手順を説明する。
- フーリエは、記録されたPCD信号を時間領域から周波数領域に変換します。
- 図 3 (2 MHz と 3 MHz の緑色のボックス) に示すように、得られたスペクトルパワーを統合して、2番目と 3番目の高調波 (± 50 kHz) の周囲で安定したキャビテーション検出を行います。
- 図3(赤いボックス)に示すように、慣性キャビテーション検出のためのスペクトルパワーを、主周波数、2番目、3番目の高調波、第1および第2の超高調波および第1の低調波(±150kHz)の間に統合します。
- 従来取得した PCD 信号の両方の正規化のために、原理周波数(1 MHz ± 50 kHz)の周囲にスペクトルパワーを統合します。
注:PCDシグナルは、1MHzでの生体内実験におけるSF6-リン脂質微小気泡の場合、 図3に示すように、慣性キャビテーションが設定される前に超高調波またはサブハーモニクスを表示しない。
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Representative Results
記載のFUSシステム(図1 および 図2)および関連ワークフローは100匹以上の動物に使用され、健常マウスおよび腫瘍軸受マウスの両方で再現可能なデータを生成した。マイクロバブルボーラス噴射のピークモーメントにおける記録キャビテーションと高調波におけるスペクトル密度に基づいて、各周波数のスペクトルパワーは、プロトコルのステップ4で説明されているようにフーリエ解析を用いて計算することができる。マイクロバブルと組み合わせて0.4のMIを有する音響プロトコル(1MHz、10msパルス持続時間)に基づいて、2番目 および3番目 の高調波における正規化された一体型パワースペクトルは、 図3で観察された励起周波数の一体化されたパワースペクトルを正規化した。これは、マイクロバブルが注入されなかった場合の低調波の検出や、MI 0.6が適用されたときに慣性キャビテーションの観察を行っていないのと比較して、安定したキャビテーション検出の非常に敏感で信頼性の高い手段を提供した。慣性キャビテーションの場合、超高調波や低調波の出現と同様に、最大25dBの広帯域ノイズフロアが検出されました。MIの0.4と0.6の音響圧力は、巨視的な損傷をもたらさなかったが、顕微鏡的損傷は、 図4に示すように、MI 0.6で組織学的に証明された。0.8のMIまでの圧力振幅のさらなる増加は、赤血球の精細化を伴うより大きな血管および広く広がる組織のリシスの巨視的な脳出血をもたらした。組織学的知見は、脳組織の慣性キャビテーションの損傷特性を確認する 、パッシブキャビテーションセンサからの音響データに対応した。その結果、11の前に観察されるように慣性キャビテーション体制に安全なマージンを提供しながら、非常に再現性BBB-開口部を提供する安全な圧力振幅として0.4のMIを選択した。
ポンチン領域におけるBBBの開通を検証するために静脈内エバンスブルーを注入した。エヴァンスブルーの強力なアルブミン結合は、66 kDa42以上の大きな分子につながります。ポンのレベルおよび部分的に小脳では、マイクロバブルのないマウスとは対照的にFUSおよびマイクロバブルで処理されたマウスでエバンスブルーコンジュゲートアルブミンの外挿が観察された(図5)。これは、社内構築FUSシステムと記述されたプロトコルを用いた画像誘導定位ナビゲーションに基づく対象領域の正確なターゲット化を強調する。
図1:集中超音波設定。
(A)焦点を合わせられた超音波の概略表現をセットアップ。(B)焦点を当てた超音波設定の画像。このシステムは、自動3Dポジショニング用の2Dステージ上の1Dリニアステージ上のトップダウンマウントトランスデューサで構成されています。トランスデューサーは、水で満たされたビームコーンで構築され、音響的に透明なマイラー膜で底部に閉じられ、動物の頭蓋骨に音を伝導する。トランスデューサは、信号生成のために任意の波形発生器(AWG)にインターン接続されているパワーアンプに接続されています。キャビテーション検出には、低ノイズ電圧アンプと組み合わせて取り外し可能なハイドロフォンが使用されます。ハイドロフォンは後頭骨の直下近傍に置かれる。外部ハイドロフォンは2mmの活性面を有し、超音波ゲルと音響的に結合される。励起パルスの高電圧信号と記録キャビテーション信号の両方が標準の200 MHzオシロスコープによってデジタル化され、オンザフライ処理とリアルタイム制御用の制御コンピュータ(図示せず)に中継されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:焦点を絞った超音波ワークフロー。
焦点を当てた超音波システムの提案されたワークフローは、取り外し可能な立体的プラットフォーム上での動物の初期位置決め(A)から始まり、音響カップリングゲル(適用されたポストBLI/X線)の適用に注意する。同時にマルチモーダルイメージングを行い、ターゲティングを行うことができます。(B)最初のX線イメージングは可能性があるが、関心のある領域は脳の輪郭の助けを借りて標的とすることができる(これは、今度は、頭蓋骨の大きさと姿勢に合わせてマウス脳アトラス40を参照する)。(C)あるいは、X線最大強度投影に重ね合わされたルシファーゼトランスフェインドフューズミッドリングリオーマ腫瘍のBLI画像を標的化に適用することができる。(D)続いて、立体的プラットフォームは、ハイドロフォンとトランスデューサーの両方を取り付けた治療位置に動物と取り付けられる。トランスデューサは自動的に治療位置に駆動し、ボーラス注入後に選択された軌道を超音波処理します。このシステムは、高スループットの実験用に最適化され、複数のプラットフォームがインターリーブ作業を可能にします。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:キャビテーションモニタリング
(A)1MHzで0.4のMIでマイクロバブル管理が存在しない場合のインビボ実験の周波数スペクトル(B)が示すマイクロバブルの注入後のピークボーラスにおける対応するスペクトルである。マイクロバブルの安定キャビテーションを示す高倍音の増加に注意してください。(C)マイクロバブル注入と組み合わせて0.6の高いMIで観察された対応スペクトルは、慣性キャビテーションの発症への遷移バンド内で、25dBまでの騒音床の増加および超高調波およびサブハーモニクスの出現をもたらす。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:BBBの開口および関連する占いの形態
()MI 0.4を用いた安定キャビテーションは、白色光顕微鏡とHE染色顕微鏡の両方で無傷の脳のパレンチマを証明した。(B) MI 0.6のMIの後、脳の円疹の局所的不可逆的組織損傷の最初の兆候は、HE染色された組織学的データにおいて明らかになりつつある。(C) MI 0.8の機械的圧がさらに高いため、脳のパレンチマの広い広がった組織のリシスや微小出血による赤血球の外用と同様に、巨視的な出血が明らかである。白色光マクロコピーの青い色相は、BBB開口部を示す共注入された血管内造影剤エバンスブルーの外挿を示す(矢状図の 図5 を参照)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:BBB開口部の検証。
安定キャビテーション体制で成功したBBB開口部のデモンストレーション(B)は、コントロール(A)と比較して、マイクロバブルを注入しない。この場合、エバンスブルーは血管内造影剤として使用されている。エヴァンスブルーの強力なアルブミン結合は、66 kDa以上の大きな分子につながります。その結果、エバンスブルーの外挿の証拠は、タイトな接合部の(部分的な)開口部のためにBBBを横切る細胞間輸送を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、脳のパレンチマへの薬物送達増加のための一過性BBB破壊のための費用対効果の高い画像誘導ベースのFUSシステムを開発した。このシステムは、主に市販のコンポーネントとX線およびBLIと組み合わせて構築されました。提案された設計のモジュール性は、高スループットワークフローでの計画と評価のためのいくつかのイメージングモダリティの使用を可能にします。このシステムは、高解像度MRIやマイクロCTなど、より包括的な高解像度3Dイメージングモダリティと組み合わせることができ、研究の大部分では2D X線やBLIなどの2Dイメージングモダリティが使用されます。2D X線および/またはBLIは、それぞれの短い取得時間による大量の研究に最適なだけでなく、かなり費用対効果が高い。ここで説明するトランスデューサは、脳のより深い部分(f数1.25)でより大きな領域(マウス脳のスケールで)でBBBDを生成するのに適しています。我々は、ポンチン領域43、44において腫瘤成長のためのシステムを使用してきた。これらの領域では、より大きな体積は、ポンの腫瘍領域全体を包含するソノポレートする必要があります。モジュラーシステムは、脳のより高い脳部分の他のタイプの脳腫瘍に対して容易に調節することができる。トランスデューサタイプを決定するためには、f数、焦点距離および周波数を考慮に入れるべきである。
全体的な設計は、以前に提案された設計と比較して、それによって2つの改良を提案する。(I)しばしば水浴は治療システムの超音波伝達のために使用される。小動物の経頭蓋適用では、このタイプの設計はより大きく反転したセットアップをもたらし、それによって動物は部分的に11、22、25に沈む。これらの設計は一般的に小さな動物研究の範囲で非常にうまく機能しますが、使用時のセットアップ時間、移植性、現実的に維持可能な衛生基準に関して妥協です。特に後者は、免疫不全動物を包含する範囲研究において非常に重要であり、したがって厳格な衛生基準である。その結果、よりコンパクトなフットプリント、セットアップ時間の短縮、容易な除染の可能性、および全体のワークフロー中の動物の自然な位置を持つシステムを設計するために、「トップダウン」設計が選択されました。(II) 前述の設計とは異なる第2の設計選択肢は、音響送達システムの直接統合を、MRIまたはマイクロCT15、17、18、19、45などの医療用画像システムに省略することであった。完全に統合されたシステムは、長手方向の薬物動態学的研究や限られた数の動物に関する探索的研究に最適ですが、そのようなセットアップは、複雑さ、高いランニングコスト、訓練を受けた/熟練したオペレーターの必要性のために、一般的に大量の薬理学的研究に適していません。さらに、このようなシステムは、一般に、1つの撮像モダリティのみに限定される。その結果、ここで提案された設計は、いくつかのイメージングモダリティ(マイクロCT、小動物MRI、様々なBLI /蛍光カメラ、これらは統合されたX線イメージングの有無にかかわらず)と互換性のあるモジュラー取り外し可能な立体化プラットフォームに依存し、また、すべての画像データを一般的な画像データの自動融合のためのマルチモダリティ受託者マーカーを提供します。
実用的な考慮事項に関しては、手順の最も重要な障害点は、限られた寿命とその脆弱な性質によるマイクロバブルの安定性です。我々は、以下の議論は、リン脂質によって安定化された微小気泡及び無菌六フッ化物(SF6)を無害ガス46,47として含有するものであり、他のマイクロバブル製剤は一般に異なる性質を示すことを強調する。
マイクロバブル注入前のタイミング: 再水和後の市販のマイクロバブルの宣伝寿命は3時間と4時間の間である。これは診断超音波アプリケーションに適していますが、この期間全体の間にマイクロバブルはガスを継続的に失い、結果的に平均気泡径は2.5μmの初期平均サイズから連続的な下向きのドリフトに置かれることに留意すべきです。超音波仲介BBBDのような治療用途では、安定キャビテーションの振動振幅(所定の周波数および圧力で)および慣性キャビテーションの発症閾値も連続ドリフトの影響を受ける直接的な結果として、これははるかに厳しいタイミング命令を意味する。我々の経験では、マイクロバブルは、以前の報告48と同様に、再現可能な結果を得るために、再水和後30分以内に使用するのが最善であることを観察した。
マイクロバブル注入後のタイミング: より大きな霊長類では、市販のSF6-リン脂質マイクロバブルは、約6分の血漿排除半減期を示し、投与ガスの80%以上がわずか11分後に肺を介して吐き出される48。マウスやラットなどの小さな哺乳類では、このタイプのマイクロバブルの血漿排除半減期は、心拍数が20の高さのために90〜120秒かなり短い。その結果、ボーラス注入直後のマイクロバブル濃度の急速な動きと、急速な後続のプラズマ除去と気泡の連続的なガス体積損失を組み合わせることで、超音波処理/注入プロトコルに厳密なタイミング要件が課され、3〜4分の短い期間の注入の短い期間内で再現可能な結果を得ることができます。BBBDのより長い手順またはより広範な量は、好ましくはマイクロバブルの連続的な投与を必要とする。しかし、このようなアプローチは、シリンジと給餌系の両方における気泡の浮力によって複雑化し、また、必要な注入チューブによってかなり増加した枯れ量を導入する。我々の経験では、総注入量を2〜3の小さなサブ用量に分割するというより簡単な解決策は、堅牢で再現可能な結果を提供した。
また、マイクロバブルは非常に圧力に敏感であり、射出時の高い静水圧は推奨されません。大きい針(>19 G)はプラスチック管にマイクロバブルを移すために、またはシリンジ49とマイクロバブルを描くために推薦される。マウス26-30G針のi.v.注射が推奨されます。より大きい針は尾静脈に挿入するより困難であるので。この針では静水圧が低いため、26G針をお勧めします。しかし、静脈アクセスが困難な場合には、30G針が推奨される。
マウスの頭蓋骨は、焦点での圧力振幅を大幅に低下する圧力振幅の重要な減衰器です。減衰は、トランスデューサの周波数と超音波波が伝播する媒体の密度によって決定される。高い超音波周波数と高い組織密度は、骨のような高い減衰をもたらす。圧力振幅は部分的に骨によって吸収され、反射と散乱50によってある程度の圧力振幅が失われる。我々の実験では、マウスの死体で、1MHzでの減衰は14.5±1.3dB/cmで、平均頭蓋骨厚は0.9mmの21,50の前に示されている。マイクロバブルは安定したキャビテーションおよび慣性キャビテーションの間に明確な音響放出を反映するので、キャビテーションのモニタリングは強く推薦される。広帯域放出は、慣性キャビテーション12のための独特の音響放出である。リアルタイムモニタリングにより、慣性キャビテーションを検出し、それに応じて圧力振幅を下げて組織の損傷を回避することができます。
これまでの報告では、麻酔の種類が達成されたBBB透過性11,31に及ぼす影響について説明した。イソフルランベースの麻酔では、麻酔開始直後に血管拡張が起こり、脳血流のわずかな減少に関連する。さらに、長期間にわたる麻酔は、特に温度安定化がない場合に、心拍数の低下をもたらす。両方の因子がマイクロバブルまたは共投与薬物の両方の脳濃度のより大きな分散をもたらす可能性があるので、厳密な麻酔プロトコルは、再現可能な結果51を達成することが推奨される。2 L/min酸素中の1.5%v/vイオブルランを35〜45分間用いた麻酔は問題ではなかった。McDannoldらのマイクロバブルの特定のタイプと組み合わせてこの混合ガスが問題の52であることを示したMcDannoldらとは対照的に、我々はこのタイプのマイクロバブルで注目すべき問題を観察していない。あるいは、動物は、既知の血管活性効果を有しないケタミン/キシラジンの混合物で麻酔することができる。
要約すると、ここで説明するイメージング誘導BBB-開始技術は、提案されたワークフローの効率を実証した大量の前臨床薬物評価試験に用いられている。このシステムは、自動化の高度のために短い訓練の後、非技術担当者によって操作することができます。これは、セットアップのシンプルさと組み合わせて高度な標準化をもたらし、実験再現性を保証し、グループ内変動を低減し、必要なサンプルサイズを削減することができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
このプロジェクトは、KWF-STW(小児びまん性特異性ポンチングリオーマと高級グリオーマにおけるソノポレーションによる薬物送達)によって資金提供されました。イリャ・スカチコフとチャールズ・ムーゲトがシステム開発に参加してくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | Becton Dickinson | 309628 | Plastipak |
| 19 G needle | Terumo Agani | 8AN1938R1 | |
| 23 G needle | Terumo Agani | 8AN2316R1 | |
| 3M Transpore surgical tape | Science applied to life | 7000032707 | or similar |
| Arbitrary waveform generator | Siglent | n.a. | SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s |
| Automated stereotact | in-house built | n.a. | Stereotact with all elements were in-house built |
| Bruker In-Vivo Xtreme | Bruker | n.a. | Includes software |
| Buffered NaCl solution | B. Braun Melsungen AG | 220/12257974/110 | |
| Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK limitd | n.a. | 0.324 mg |
| Cage enrichment: paper-pulp smart home | Bio services | n.a. | |
| Carbon filter | Bickford | NC0111395 | Omnicon f/air |
| Ceramic spoon | n.a | n.a. | |
| Cotton swabs | n.a. | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Ethanol | VUmc pharmacy | n.a. | 70% |
| Evans Blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Fresenius NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | n.a. | NaCl 0.9 %, 1000 mL |
| Histoacryl | Braun Surgical | n.a. | Histoacryl 0.5 mL |
| Hydrophone | Precision Acoustics | n.a. | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 324825/324826 | 0.5 mL and 0.3 mL |
| Isoflurane | TEVA Pharmachemie BV | 8711218013196 | 250 mL |
| Ketamine | Alfasan | n.a. | 10 %, 10 mL |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | Envigo | 2918-11416M | |
| Neoflon catheter | Becton Dickinson | 391349 | 26 GA 0.6 x 19 mm |
| Oscilloscope | Keysight technologies | n.a. | InfiniiVision DSOX024A |
| Plastic tubes | Greiner bio-one | 210261 | 50 mL |
| Power amplifier | Electronics & Innovation Ltd | 210L | Model 210L |
| Preamplifier DC Coupler | Precision Acoustics | n.. | Serial number: DCPS94 |
| Scissors | Sigma Aldrich | S3146-1EA | or similar |
| Sedazine | AST Farma | n.a. | 2% |
| SonoVue microbubbles | Bracco | n.a. | 8 µl/ml |
| Sterile water | Fresenius Kabi | n.a. | 1000 mL |
| Syringe | n.a. | n.a. | various syringes can be used |
| Temgesic | Indivior UK limitd | n.a. | 0.3 mg/ml |
| Transducer | Precision Acoustics | n.a. | 1 MHz |
| Tweezers | Sigma Aldrich | F4142-1EA | or similar |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | 01-02 | Aquasonic 100 |
| Vidisic gel | Bausch + Lomb | n.a. | 10 g |
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