Summary
La barriera ematico-encefalica (BBB) può essere temporaneamente interrotta con ultrasuoni focalizzati mediati da microbolle (FUS). Qui descriviamo un protocollo passo-passo per l'apertura BBB ad alta produttività in vivo utilizzando un sistema FUS modulare accessibile per esperti non ad ultrasuoni.
Abstract
La barriera ematica-encefalica (BBB) è stato un grosso ostacolo per il trattamento di varie malattie cerebrali. Le cellule endoteliali, collegate da giunzioni strette, formano una barriera fisiologica che impedisce alle grandi molecole (>500 Da) di entrare nel tessuto cerebrale. Gli ultrasuoni focalizzati mediati da microbolle (FUS) possono essere utilizzati per indurre un'apertura BBB locale transitoria, consentendo ai farmaci più grandi di entrare nel parenchima cerebrale.
Oltre ai dispositivi clinici su larga scala per la traduzione clinica, la ricerca preclinica per la valutazione della risposta terapeutica dei candidati ai farmaci richiede configurazioni dedicate di ultrasuoni per piccoli animali per un'apertura BBB mirata. Preferibilmente, questi sistemi consentono flussi di lavoro ad alta produttività con precisione spaziale elevata e monitoraggio integrato della cavitazione, pur essendo convenienti sia nell'investimento iniziale che nei costi di gestione.
Qui presentiamo un sistema FUS per piccoli animali stereotattico a bioluminescenza e a raggi X che si basa su componenti disponibili in commercio e soddisfa i suddetti requisiti. Un'enfasi particolare è stata posta su un elevato grado di automazione che facilita le sfide tipicamente incontrate negli studi preclinici di valutazione dei farmaci ad alto volume. Esempi di queste sfide sono la necessità di standardizzazione al fine di garantire la riproducibilità dei dati, ridurre la variabilità all'interno del gruppo, ridurre le dimensioni del campione e quindi rispettare i requisiti etici e ridurre il carico di lavoro non necessario. Il sistema BBB proposto è stato convalidato nell'ambito di BBB aprendo studi di somministrazione facilitata di farmaci su modelli di xenograft derivati dal paziente di glioblastoma multiforme e glioma medioline diffuso.
Introduction
La barriera ematica-encefalica (BBB) è un grosso ostacolo per il somministrazione di farmaci nel parenchima cerebrale. La maggior parte dei farmaci terapeutici che sono stati sviluppati non attraversano la BBB a causa dei loro parametri fisicochimici (ad esempio, lipofilia, peso molecolare, accettori di legami idrogeno e donatori) o non vengono mantenuti a causa della loro affinità per i trasportatori di efflux nelcervello 1,2. Il piccolo gruppo di farmaci che possono attraversare la BBB sono tipicamente piccole molecole lipofile, che sono efficaci solo in un numero limitato di malattiecerebrali 1,2. Di conseguenza, per la maggior parte delle malattie cerebrali, le opzioni di trattamento farmacologico sono limitate e sono necessarie nuove strategie disomministrazione dei farmaci 3,4.
L'ecografia terapeutica è una tecnica emergente che può essere utilizzata per diverse applicazioni neurologiche come l'interruzione della BBB (BBBD), la neuromodulazione e l'ablazione4,5,6,7. Al fine di ottenere un'apertura BBB con un emettitore ad ultrasuoni extracorporeo attraverso il cranio, gli ultrasuoni focalizzati (FUS) sono combinati con microbolle. Il FUS mediato da microbolle si traduce in una maggiore biodisponibilità di farmaci nel parenchimacerebrale 5,8,9. In presenza di onde sonore, le microbolle iniziano a oscillare iniziando la tracitosi e l'interruzione delle giunzioni strette tra le cellule endoteliali della BBB, consentendo il trasporto paracellulare di molecole piùgrandi 10. Studi precedenti hanno confermato la correlazione tra l'intensità dell'emissione acustica e l'impatto biologico sull'apertura della BBB11,12,13,14. FUS in combinazione con microbolle è già stato utilizzato in studi clinici per il trattamento del glioblastoma utilizzando temozolomide o doxorubicina liposomiale come agente chemioterapico, o per la terapia del morbo di Alzheimer e sclerosi laterale amiotrofica5,9,15,16.
Poiché l'apertura della BBB mediata da ultrasuoni si traduce in possibilità completamente nuove per la farmacoterapia, è necessaria una ricerca preclinica per la traduzione clinica per valutare la risposta terapeutica di candidati selezionati. Ciò richiede in genere un flusso di lavoro ad alta produttività con precisione sia spaziale elevata che preferibilmente un rilevamento di cavitazione integrato per il monitoraggio dell'apertura BBB mirata con un'elevata riproducibilità. Se possibile, questi sistemi devono essere convenienti sia per gli investimenti iniziali che per i costi di gestione per essere scalabili in base alle dimensioni dello studio. La maggior parte dei sistemi FUS preclinici sono combinati con la risonanza prima della mento per la guida delle immagini e lapianificazione del trattamento 15,17,18,19. Sebbene la risonanza tura dia informazioni dettagliate sull'anatomia e sul volume del tumore, è una tecnica costosa, che viene generalmente eseguita da operatori addestrati / qualificati. Inoltre, la risonanza prima o poi ad alta risoluzione potrebbe non essere sempre disponibile per i ricercatori in strutture precliniche e richiede lunghi tempi di scansione per animale, rendendola meno adatta per studi farmacologici ad alta produttività. Degno di nota è che, per la ricerca preclinica nel campo della neuro-oncologia, in particolare dei modelli tumorali infiltrativi, la possibilità di visualizzare e indirizzare il tumore è essenziale per il successodel trattamento 20. Attualmente, questo requisito è soddisfatto solo dalla risonanza magnetica o da tumori trasdotti con una fotoproteina, consentendo la visualizzazione con imaging a bioluminescenza (BLI) in combinazione con la somministrazione del substrato di fotoproteina.
I sistemi FUS guidati dalla risonanza 10 utilizzano spesso un bagno d'acqua per garantire la propagazione delle onde ultrasoniche per applicazioni transcranici, in cui la testa dell'animale è parzialmente sommersa nell'acqua, i cosiddetti sistemi "bottom-up"15,17,18. Mentre questi progetti funzionano generalmente bene negli studi sugli animali più piccoli, sono un compromesso tra tempi di preparazione degli animali, portabilità e standard igienici realisticamente manutenibili durante l'uso. In alternativa alla risonanza valutazione, altri metodi di guida per la navigazione stereotassica comprendono l'uso di un atlante anatomico roditore21,22,23, avvistamento visivo assistito da puntatore laser24,dispositivo di scansione meccanica assistito da fori stenopeico25o BLI26. La maggior parte di questi disegni sono sistemi "top-down" in cui il trasduttore è posto sopra la testa dell'animale, con l'animale in posizione naturale. Il flusso di lavoro "dall'alto verso il basso" è costituito da un bagnod'acqua 22,25,26 o da un cono riempito d'acqua21,24. Il vantaggio dell'utilizzo di un trasduttore all'interno di un cono chiuso è l'ingombro più compatto, i tempi di configurazione più brevi e le possibilità di decontaminazione diretta semplificando l'intero flusso di lavoro.
L'interazione del campo acustico con le microbolle dipende dalla pressione e varia dalle oscillazioni a bassa ampiezza (indicate come cavitazione stabile) al collasso transitorio della bolla (indicato come cavitazione inerziale)27,28. Esiste un consenso consolidato sul fatto che l'ecografia-BBBD richiede una pressione acustica ben al di sopra della soglia di cavitazione stabile per ottenere un BBBD di successo, ma al di sotto della soglia di cavitazione inerziale, che è generalmente associata a danni vascolari /neuronali 29. La forma più comune di monitoraggio e controllo è l'analisi del segnale acustico (back-)scattered utilizzando il rilevamento passivo della cavitazione (PCD), come suggerito da McDannold etal. La PCD si basa sull'analisi degli spettri di Fourier dei segnali di emissione di microbolle, in cui la forza e l'aspetto dei tratti distintivi di cavitazione stabili (armoniche, sottoarmoniche e ultraarmoniche) e dei marcatori di cavitazione inerziale (risposta a banda larga) possono essere misurati in tempo reale.
Un'analisi PCD "one size fits all" per un controllo preciso della pressione è complicata a causa della polidispersità della formulazione di microbolle (l'ampiezza di oscillazione dipende fortemente dal diametro della bolla), dalle differenze nelle proprietà del guscio della bolla tra le marche e dall'oscillazione acustica, che dipende fortemente dallafrequenza e dalla pressione 30,31,32. Di conseguenza, sono stati suggeriti molti diversi protocolli di rilevamento PCD, che sono stati adattati a particolari combinazioni di tutti questi parametri e sono stati utilizzati in vari scenari applicativi (che vanno dalla sperimentazione in vitro su piccoli protocolli animali alla PCD per uso clinico) per il rilevamento robusto della cavitazione e persino per il controllo retroattivo del feedbackdella pressione 11,14,30,31,32,33,34,35. Il protocollo PCD utilizzato nell'ambito di questo studio è derivatodirettamente da McDannold et al.
Abbiamo sviluppato un sistema FUS di neuronavigation guidato da immagini per l'apertura transitoria della BBB per aumentare il consumo di farmaci nel parenchima cerebrale. Il sistema si basa su componenti disponibili in commercio e può essere facilmente adattato a diverse modalità di imaging, a seconda delle tecniche di imaging disponibili nella struttura animale. Poiché abbiamo bisogno di un flusso di lavoro ad alta produttività, abbiamo scelto di utilizzare raggi X e BLI per la guida delle immagini e la pianificazione del trattamento. Le cellule tumorali trasdute con una fotoproteina (ad esempio, luciferasi) sono adatte per l'imaging BLI20. Dopo la somministrazione del substrato di fotoproteina, le cellule tumorali possono essere monitorate in vivo e la crescita e la posizione del tumorepossono essere determinate 20,36. BLI è una modalità di imaging a basso costo, consente di seguire la crescita tumorale nel tempo, ha tempi di scansione rapidi e si correla bene con la crescita tumorale misurata con la risonanzamagnetica 36,37. Abbiamo optato per sostituire il bagno d'acqua con un cono pieno d'acqua attaccato al trasduttore per consentire flessibilità per spostare liberamente la piattaforma su cui èmontato il roditore 8,24. Il design si basa su una piattaforma rimovibile dotata di integrazione di (I) marcatori fiduciari della piattaforma stereotattica per piccoli animali (II) con compatibilità a raggi X e immagini ottiche (III) maschera di anestesia rapidamente rimovibile e (IV) sistema integrato di riscaldamento degli animali regolato dalla temperatura. Dopo l'induzione iniziale dell'anestesia, l'animale viene montato in una posizione precisa sulla piattaforma dove rimane durante l'intera procedura. Di conseguenza, l'intera piattaforma passa tutte le stazioni del flusso di lavoro dell'intero intervento, pur mantenendo un posizionamento accurato e riproducibile e un'anestesia sostenuta. Il software di controllo consente il rilevamento automatico dei marcatori fiduciari e registra automaticamente tutti i tipi di immagini e modalità di immagine (ad esempio, micro-CT, raggi X, BLI e imaging a fluorescenza) nel quadro di riferimento della piattaforma stereotassica. Con l'aiuto di una procedura di calibrazione automatica, la lunghezza focale del trasduttore ad ultrasuoni è precisamente nota all'interno, il che consente la fusione automatica della pianificazione interventiva, della consegna acustica e dell'analisi di imaging di follow-up. Come illustrato nella figura 1 e nella figura 2, questa configurazione offre un elevato grado di flessibilità per progettare flussi di lavoro sperimentali dedicati e consente la manipolazione interfogliata dell'animale in diverse stazioni, il che a sua volta facilita gli esperimenti ad alta produttività. Abbiamo usato questa tecnica per il successo della somministrazione di farmaci negli xenografti di topo di glioma di alta qualità come il glioma medioline diffuso.
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Protocol
Tutti gli esperimenti in vivo sono stati approvati dal comitato etico olandese (numero di permesso di licenza AVD114002017841) e dall'Organismo per il benessere degli animali della Vrije Universiteit Amsterdam, paesi Bassi. Gli investigatori sono stati addestrati alle basi del sistema FUS al fine di ridurre al minimo il disagio degli animali.
1. Sistema ecografico focalizzato
NOTA: La configurazione descritta è un sistema di interruzione BBB integrato basato su componenti disponibili in commercio e include un cono stampato su misura stampato in 3D e una piattaforma stereotassica rimovibile. Il sistema è progettato modulare, il che facilita le modifiche in base alle attrezzature disponibili e all'uso specifico. Il protocollo descrive la procedura per la sonoporazione di un'area più ampia nella regione pontina del cervello del topo. Regolando la posizione del bersaglio, diverse parti del cervello potrebbero essere prese di mira. In questo studio è stato utilizzato un trasduttore mono-elemento a 1 MHz con una lunghezza focale di 75 mm, un'apertura di 60 mm e un'area focale di 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM di pressione di picco). Il piano focale del trasduttore è posizionato attraverso il cranio dell'animale nel piano orizzontale che si interseca con le barre dell'orecchio.
- Selezionare un trasduttore appropriato per l'apertura della BBB nei roditori.
NOTA: In base alle proprietà delle microbolle e alla frequenza impiegata, le impostazioni acustiche, in particolare l'indice meccanico (MI), sono soggette amodifiche 13,38. - Posizionare il trasduttore nel cono stampato in 3D.
- Utilizzare una membrana milare acusticamente trasparente all'estremità inferiore del cono per ottenere l'accoppiamento acustico del percorso di propagazione del fascio e riempire il cono con acqua degassata.
- Montare il trasduttore sopra l'animale su uno stadio lineare motorizzato, come mostrato nella figura 1, consentendo il posizionamento verticale automatico del trasduttore.
- Progettare una piattaforma stereotassica rimovibile basata sui requisiti dello studio, che includa riscaldamento regolato dalla temperatura, mordente e auricolari, anestesia e marcatori fiduciari multimodalità, come mostrato nella figura 1 e nella figura 2. Il montaggio della piattaforma stereotassiva è costituito da un sistema di stadio lineare 2D, che consente un posizionamento automatico preciso (< 0,1 mm) dell'animale sotto il fascio.
- Collegare il trasduttore alla catena di emissione acustica mostrata nella figura 1 costituita da un trasduttore, un generatore di funzioni e un amplificatore di potenza.
- Ideare una pipeline di elaborazione delle immagini per rilevare i marcatori fiduciari multimodalità che consenta un targeting preciso della sonoporazione dell'area cerebrale di interesse e la raccolta dei dati di cavitazione rilevati dall'idrofono dell'ago.
- Calibrare il sistema e determinare il punto di messa a fuoco del trasduttore in corrispondenza del posizionamento verticale dell'animale sulla piattaforma stereotassica.
2. Preparazione animale
NOTA: Il seguente protocollo è specificato per i topi ma può essere adattato per i ratti. Per questi esperimenti sono stati utilizzati topi Foxn1-/- nudi atimici (6-8 settimane).
- Consentire all'animale di acclimatarsi per almeno una settimana nella struttura animale e pesare regolarmente l'animale.
- Somministrare buprenorfina (0,05 mg/kg) tramite iniezione sottocutanea (s.c.) 30 minuti prima del trattamento FUS per iniziare il trattamento analgesico.
- Anestetizza l'animale con il 3% di isoflurane, 2 L/min O2 e verifica che l'animale sia profondamente anestetizzato. Mantenere gli animali anestetizzati durante l'intera procedura e monitorare la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca per regolare la concentrazione di isoflurane in base alle esigenze.
- Applicare unguento per gli occhi per prevenire gli occhi asciutti ed evitare possibili lesioni.
- Rimuovere i capelli sulla parte superiore della testa con un rasoio e una crema depilatoria e lavare successivamente con acqua per rimuovere eventuali residui per evitare irritazioni alla pelle.
- Per esperimenti con modelli tumorali BLI, iniettare 150 μL di D-luciferina (30 mg/mL) intraperitoneale (i.p.) con una siringa per insulina da 29 G per la guida dell'immagine BLI.
- Inserire un catetere della vena di coda da 26-30 G e sciacquare il catetere e la vena con un piccolo volume di soluzione di eparina (5 UI/mL). Riempire il catetere con soluzione di eparina per evitare la coagulazione del sangue.
NOTA: Una buona cateterizzazione si vede quando c'è un reflusso di sangue nel catetere. Evitare bolle d'aria nel catetere per prevenire gli emboli. Per evitare un'eccessiva pressione di iniezione, assicurarsi che la lunghezza del catetere sia il più breve possibile. - Posizionare l'animale sulla piattaforma stereotattica regolata dalla temperatura per evitare l'ipotermia.
NOTA: L'ipotermia riduce la circolazione sanguigna, che può influenzare l'iniezione / circolazione di microbolle e la farmacocinetica dei farmaci39. - Immobilizzare e fissare la testa dell'animale sulla piattaforma stereotassiva usando le barre dell'orecchio e una barra del morso. Fissare il corpo con una cinghia e rastremare la coda dell'animale sulla piattaforma.
3. Ultrasuoni in vivo focalizzati sull'immagine
NOTA: Per questo protocollo è stato utilizzato un trasduttore mono-elemento a 1 MHz con un impulso di scoppio di tono con una durata di 10 ms, un MI di 0,4 e una frequenza di ripetizione dell'impulso di 1,6 Hz con 40 cicli per 240 s. Il protocollo è ottimizzato per le microbolle stabilizzate da fosfolipidi contenenti esafluoruro di zolfo (SF6)come gas innocuo, per cui il diametro medio della bolla è di 2,5 μm e più del 90% delle bolle sono più piccole di 8 μm.
- Posizionare la piattaforma stereotassica con l'animale montato nella modalità di imaging (adesempio, BLI o raggi X) e scattare l'immagine o le immagini dell'animale.
- Utilizzare i marcatori fiduciari multimodalità in combinazione con la pipeline di elaborazione delle immagini per contrassegnare la posizione dell'animale in base al punto di messa a fuoco del trasduttore.
- Determinare l'area di destinazione posizionando un contorno cerebrale sull'immagine a raggi X acquisita o utilizzando immagini BLI per determinare il centro del tumore (Figura 2). La posizione di parti specifiche del cervello è specificata nel Paxinos Brain Atlas40 usando i segni del cranio bregma e lambda come punti di riferimento. Ad esempio, i pons si trovano x=-1.0, y=-0.8 e z=-4.5 da lambda.
- Proteggi le narici e la bocca dell'animale con nastro adesivo per evitare che il gel ad ultrasuoni interferisca con la respirazione.
- Applicare il gel ad ultrasuoni sopra la testa dell'animale.
- Ritrarre la pelle del collo degli animali, lubrificare l'idrofono dell'ago con gel ad ultrasuoni e posizionare l'idrofono dell'ago nelle immediate vicinanze dell'osso occipitale.
- Guida il trasduttore nella posizione corretta utilizzando la tubazione di elaborazione delle immagini e il punto di messa a fuoco.
- Applicare le impostazioni preconfigurate a tutti i dispositivi collegati e indirizzare l'area cerebrale di interesse.
NOTA: A seconda della domanda di ricerca, le regioni tumorali o cerebrali possono essere sonoporate come un singolo punto focale o come forma volumetrica, come mostrato nella figura 2. - Attivare le microbolle come descritto dal produttore. Iniettare un bolo di 120 μL (5,4 μg) di microbolle.
- Lavare il catetere della vena di coda con soluzione salina per controllare l'apertura del catetere.
- Iniettare le microbolle e iniziare l'insonation.
- Registrare la cavitazione delle microbolle con l'idrofono dell'ago.
- Somministrare un agente di contrasto intravascolare o un farmaco dopo la sonoporazione. La dose, i tempi e la pianificazione dipendono dallo scopo dello studio e dal farmaco.
NOTA: Evans blue è un agente di colore comune per valutare l'apertura BBB41. - Monitorare l'animale fino al punto di tempo predeterminato o prima dell'endpoint umano.
4. Analisi della cavitazione delle microbolle
NOTA: Qui viene descritta la procedura applicata, che è adatta per la sperimentazione in vivo di microbolle SF6-fosfolipidi con un diametro medio di 2,5 μm (80% delle bolle inferiori a 8 μm) eccitate con un impulso di tono burst di 10 ms di durata ad una frequenza di 1 MHz, come originariamente suggerito da McDannold etal.
- Trasformazione di Fourier del segnale PCD registrato dal dominio del tempo nel dominio della frequenza.
- Integrare la potenza spettrale risultante per il rilevamento della cavitazione stabile intornoall'armonica 2 ° e 3rd (± 50 kHz), come mostrato nella figura 3 (scatola verde a 2 e 3 MHz).
- Integrare la potenza spettrale peril rilevamento della cavitazione inerziale, tra la frequenza principale, la2a, 3aarmonica, la 1a e la seconda ultraarmonica e la prima sub-armonica (± 150 kHz), come mostrato nella figura 3 (caselle rosse).
- Integrare la potenza spettrale attorno alla frequenza principale (1 MHz ± 50 kHz) per la normalizzazione di entrambi i segnali PCD precedentemente ottenuti.
NOTA: Il segnale PCD, per microbolle SF6-fosfolipidiche in esperimenti in vivo a 1 MHz, non visualizza ultraarmonici o sottoarmonici prima che la cavitazione inerziale si insepol, come mostrato nella figura 3.
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Representative Results
Il sistema FUS descritto (Figura 1 e Figura 2) e il flusso di lavoro associato sono stati utilizzati in oltre 100 animali e hanno prodotto dati riproducibili su topi sani e portanti di tumore. In base alla cavitazione registrata e alla densità spettrale alle armoniche nel momento di picco dell'iniezione di bolo di microbolle, la potenza spettrale di ogni frequenza può essere calcolata utilizzando l'analisi di Fourier come spiegato nella fase 4 del protocollo. Basato sul protocollo acustico (1 MHz, durata dell'impulso di 10 ms) con un MI di 0,4 in combinazione con microbolle, lo spettro di potenza integrato normalizzato alle armoniche2 ° e 3rd ha normalizzato lo spettro di potenza integrato della frequenza di eccitazione osservata nella figura 3. Ciò ha fornito un mezzo molto sensibile e affidabile per il rilevamento stabile della cavitazione, rispetto all'inrilevamento di sottoarmonici quando non sono state iniettate microbolle o all'osservazione della cavitazione inerziale quando è stata applicata un'MI di 0,6. In caso di cavitazione inerziale, è stato rilevato un aumento del rumore a banda larga fino a 25 dB, così come la comparsa di ultraoniche e sottoarmonici. Sebbene una pressione acustica di un MI di 0,4 e 0,6 non abbia causato danni macroscopici, il danno microscopico è stato evidenziato istologicamente con un MI di 0,6, come mostrato nella figura 4. Un ulteriore aumento dell'ampiezza della pressione fino a un MI di 0,8 ha comportato un'emorragia cerebrale macroscopica di vasi più grandi e lisi tissutale diffusa con l'estravasazione degli etrociti. I risultati istologici corrispondevano ai dati acustici del sensore di cavitazione passiva, come mostrato nella figura 3, confermando le proprietà dannose della cavitazione inerziale del tessuto cerebrale. Di conseguenza, un MI di 0,4 è stato scelto come ampiezza di pressione sicura che ha fornito un'apertura BBB molto riproducibile, fornendo al contempo un margine sicuro al regime di cavitazione inerziale, come osservato primadell'11.
Il blu di Evans per via endovenosa è stato iniettato per convalidare l'apertura della BBB nella regione pontina. Il forte legame con l'albumina del blu Evans porta ad una grande molecola di oltre 66 kDa42. A livello dei pons e in parte del cervelletto, l'estravasazione dell'albumina coniugata blu evans è stata osservata nel topo trattato con FUS e microbolle in contrasto con il topo senza microbolle (Figura 5). Ciò enfatizza il targeting preciso della regione di interesse basato sulla navigazione stereotassica guidata dall'immagine con il sistema FUS di costruzione interno e il protocollo descritto.
Figura 1: Configurazione ad ultrasuoni focalizzata.
(A) Rappresentazione schematica dell'ecografia focalizzata impostata. (B) Immagine della configurazione ad ultrasuoni focalizzata. Il sistema è costituito da un trasduttore montato dall'alto verso il basso su uno stadio lineare 1D su un secondo stadio 2D per il posizionamento 3D automatico. Il trasduttore è costruito in un cono a fascio riempito d'acqua, chiuso nella parte inferiore con una membrana milare acusticamente trasparente, che conduce il suono al cranio dell'animale. Il trasduttore è collegato ad un amplificatore di potenza, che a sua volta è collegato a un generatore di forme d'onda arbitrario (AWG) per la generazione del segnale. Per il rilevamento della cavitazione viene utilizzato un idrofono rimovibile in combinazione con un amplificatore a bassa tensione di rumore. L'idrofono è posto nelle immediate vicinanze dell'osso occipitale. L'idrofono esterno ha una superficie attiva di 2 mm ed è accoppiato acusticamente con gel ad ultrasuoni. Sia il segnale ad alta tensione dell'impulso di eccitazione che il segnale di cavitazione registrato sono digitalizzati da un oscilloscopio standard a 200 MHz e trasmessi a un computer di controllo (non mostrato) per l'elaborazione al volo e il controllo in tempo reale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Flusso di lavoro ad ultrasuoni focalizzato.
Il flusso di lavoro proposto del sistema ad ultrasuoni focalizzato inizia con (A) il posizionamento iniziale dell'animale su una piattaforma stereotassia rimovibile, si noti l'applicazione del gel di accoppiamento acustico (applicato post BLI/raggi X). Contemporaneamente è possibile condurre immagini multimodali per il targeting. (B) All'inizio l'imaging a raggi X è una possibilità, mentre una regione di interesse può essere presa di mira con l'aiuto di un contorno del cervello (a sua volta si fa riferimento all'atlantecerebrale del topo 40, adattato alle dimensioni e alla postura del cranio). (C) In alternativa, è possibile applicare un'immagine BLI di un tumore del glioma medioline diffuso trasfetto luciferasi sovrapposto a una proiezione di intensità massima a raggi X per il targeting. (D) Successivamente, la piattaforma stereotassica viene montata con l'animale in posizione terapeutica con sia idrofono che trasduttore collegati. Il trasduttore guida automaticamente in posizione terapeutica e sonica la traiettoria scelta dopo l'iniezione di bolo. Il sistema è ottimizzato per esperimenti ad alta produttività, in base ai quali più piattaforme consentono il lavoro interfogliato, come mostrato in alto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Monitoraggio della cavitazione.
(A) Spettro di frequenza di un esperimento in vivo in assenza di amministrazione delle microbolle ad un MI di 0,4 a 1 MHz. (B) Mostrato è lo spettro corrispondente al picco-bolo dopo iniezione di microbolle. Si noti l'aumento delle armoniche più alte, che è indicativo per la cavitazione stabile delle microbolle. (C) Spettro corrispondente osservato ad un MI più elevato di 0,6 in combinazione con iniezione di microbolle, all'interno della banda di transizione verso l'inizio della cavitazione inerziale, portando ad un aumento del pavimento sonoro fino a 25 dB e alla comparsa di ultraarmonico e subharmonico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Apertura BBB e istologia associata.
(A) La cavitazione stabile con un MI di 0,4 ha evidenziato un parenchima cerebrale intatto sia nella macroscopia a luce bianca che nella microscopia macchiata HE. (B) Dopo un MI di 0,6 primi segni di danno tissutale irreversibile locale del parenchima cerebrale sta diventando evidente nei dati istologici macchiati di HE. (C) Per una pressione meccanica ancora più elevata di MI 0,8, è evidente un'emorragia macroscopica, nonché lisi tissutale diffusa del parenchima cerebrale e l'estravasione degli erociti dovuta alla micro-emorragia. La tonalità blu nella macroscopia a luce bianca è indicativa per l'estravasazione dell'agente di contrasto intravascolare co-iniettato Evans blu che indica l'apertura BBB (vedi figura 5 per una vista sagittale). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Convalida dell'apertura della BBB.
Dimostrazione di un'apertura BBB riuscita nel regime di cavitazione stabile (B) rispetto al controllo(A), nessuna microbolle iniettata. In questo caso il blu Evans è stato usato come agente di contrasto intravascolare. Il forte legame albumina del blu Evans porta ad una grande molecola di oltre 66 kDa. Di conseguenza, l'evidenza dell'extravasazione blu di Evans è indicativa per il trasporto paracellulare attraverso la BBB a causa di un'apertura (parziale) delle giunzioni strette. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, abbiamo sviluppato un sistema FUS basato su immagini economico per interruzioni transitorie della BBB per aumentare il consumo di farmaci nel parenchima cerebrale. Il sistema è stato in gran parte costruito con componenti disponibili in commercio e in combinazione con raggi X e BLI. La modularità del progetto proposto consente l'utilizzo di diverse modalità di imaging per la pianificazione e la valutazione in flussi di lavoro ad alta produttività. Il sistema può essere combinato con modalità di imaging 3D ad alta risoluzione più complete, ad esempio risonanza magnetica ad alta risoluzione o micro-TC, mentre per la maggior parte dello studio vengono utilizzate modalità di imaging 2D come raggi X 2D e / o BLI. I raggi X 2D e/o il BLI sono entrambi notevolmente più convenienti e ideali per studi ad alto volume a causa dei rispettivi brevi tempi di acquisizione. Il trasduttore qui descritto è adatto a produrre BBBD in aree più grandi (sulla scala di un cervello di topo) in parti più profonde del cervello (numero f di 1,25). Abbiamo utilizzato il sistema per la coltivazione diffusa di tumori nella regione pontina43,44. Per queste regioni è necessario un volume maggiore che comprenda l'intera regione tumorale nei pons. Il sistema modulare può essere facilmente regolato per altri tipi di tumori cerebrali in parti più sovratentoriali del cervello. Per decidere il trasduttore di tipo uno si dovrebbe tenere conto del numero f, della lunghezza focale e della frequenza.
Il design generale propone quindi due perfezionamenti rispetto ai disegni suggeriti in precedenza. ( I) Spesso un bagno d'acqua viene utilizzato per la trasmissione ad onda ultrasonica di sistemi terapeutici. Per applicazioni transcranici in piccoli animali questo tipo di design si traduce in configurazioni più grandi e invertite, in cui l'animale è parzialmentesommerso 11,22,25. Mentre questi progetti funzionano generalmente molto bene nell'ambito degli studi sugli animali più piccoli, sono un compromesso per quanto riguarda i tempi di configurazione, la portabilità e gli standard igienici realisticamente manutenibili durante l'uso. In particolare, quest'ultimo è di notevole importanza negli studi di portata che comprendono animali immunocompro compromessi e quindi rigorose norme igieniche. Di conseguenza, al fine di progettare un sistema con un ingombro più compatto, tempi di configurazione più brevi, facili possibilità di decontaminazione e una posizione naturale dell'animale durante l'intero flusso di lavoro, è stato scelto un design "top-down". (II) La seconda scelta progettuale che differisce da diversi progetti descritti in precedenza è stata quella di omettere l'integrazione diretta del sistema di somministrazione acustica in un sistema di imaging medico come una risonanza magnetica o una micro-TAC15,17,18,19,45. Mentre i sistemi completamente integrati sono ideali per studi farmacocinetici longitudinali o ricerche esplorativa su un numero limitato di animali, tali configurazioni sono generalmente meno adatte per studi farmacologici ad alto volume a causa di una complessità notevolmente aumentata, alti costi di gestione e necessità di operatori formati / qualificati. Inoltre, tali sistemi sono generalmente limitati a una sola modalità di imaging. Di conseguenza, il progetto proposto si basa su una piattaforma stereotassica rimovibile modulare, compatibile con diverse modalità di imaging (micro-CT, small animal MRI, una varietà di telecamere BLI/fluorescenza, queste con o senza imaging a raggi X integrato) e fornisce anche marcatori fiduciari multimodalità per la fusione automatica di tutti i dati delle immagini in un quadro di riferimento comune sia per la pianificazione interventiva che per l'apertura post BBB.
Per quanto riguarda le considerazioni pratiche, il punto più critico di fallimento della procedura è la stabilità delle microbolle a causa della loro durata limitata e della loro natura fragile. Vorremmo sottolineare che la discussione che segue riguarda le microbolle stabilizzate dai fosfolipidi e contenenti esafluoruro di zolfo (SF6)come gas innocuo46,47, mentre altre formulazioni di microbolle mostrerà generalmente proprietà diverse.
Tempi prima dell'iniezione di microbolle: La durata pubblicizzata delle microbolle disponibili in commercio dopo la reidratazione è compresa tra 3 e 4 ore. Sebbene questo sia adatto per applicazioni diagnostiche ad ultrasuoni, va notato che durante l'intero periodo le microbolle perdono continuamente gas e di conseguenza il diametro medio della bolla è soggetto a una continua deriva verso il basso dalla dimensione media iniziale di 2,5 μm. Per applicazioni terapeutiche come il BBBD mediato da ultrasuoni questo implica imperativi temporali molto più severi, poiché l'ampiezza di oscillazione della cavitazione stabile (a una data frequenza e pressione) e la soglia di insorgenza della cavitazione inerziale sono come conseguenza diretta anche soggette a una deriva continua. Nella nostra esperienza, abbiamo osservato che le microbolle sono meglio utilizzate entro 30 minuti dalla reidratazione al fine di ottenere risultati riproducibili, simili ai precedenti rapporti48.
Tempismo dopo iniezione di microbolle: Nei primati più grandi, le microbolle SF6-fosfolipidi disponibili in commercio mostrano un'emiprogenia di eliminazione del plasma sanguigno di circa 6 minuti e oltre l'80% del gas somministrato viene espirato attraverso i polmoni dopo soli 11 minuti48. Nei piccoli mammiferi come topi e ratti l'emiprotezione di eliminazione del plasma sanguigno di questo tipo di microbolle in vivo è con 90-120 secondi notevolmente più breve a causa della frequenza cardiacapiù elevata 20. Di conseguenza, la rapida dinamica della concentrazione di microbolle subito dopo l'iniezione di bolo e la rapida successiva eliminazione del plasma combinata con la perdita continua di volume di gas delle bolle impone severi requisiti di temporizzazione sul protocollo di sonicazione /iniezione al fine di ottenere risultati riproducibili entro la breve durata di 3-4 minuti dopo l'iniezione. Procedure più lunghe o volumi più estesi di BBBD richiedono preferibilmente una somministrazione continua di microbolle. Tuttavia, tale approccio è complicato dalla galleggiabilità delle bolle sia nella siringa che nel sistema di alimentazione e introduce anche un volume morto notevolmente aumentato dai tubi di infusione richiesti. Nella nostra esperienza la soluzione più semplice di dividere il volume totale di iniezione in 2-3 sotto-dosi più piccole ha fornito risultati robusti e riproducibili.
Inoltre, le microbolle sono molto sensibili alla pressione e le alte pressioni idrostatiche durante l'iniezione non sono quindi raccomandate. Per il trasferimento di microbolle in un tubo di plastica si raccomandano aghi di grandi dimensioni (>19 G) o per stilare microbolle con unasiringa 49. Per l'iniezione di i.v. nei topi si raccomandano aghi da 26-30 G; poiché gli aghi più grandi sono più difficili da inserire nella vena della coda. L'ago da 26 G è raccomandato poiché la pressione idrostatica è inferiore con questo ago. Tuttavia, in caso di difficile accesso venoso si consiglia l'ago da 30 G.
Il cranio del topo è un importante attenuatore dell'ampiezza della pressione che abbassa significativamente l'ampiezza della pressione al fuoco. L'attenuazione è determinata dalla frequenza del trasduttore e dalla densità del mezzo che l'onda ultrasonica propaga. Frequenze ultrasoniche più elevate e alte densità tissutali, come l'osso, si trattene da un'elevata attenuazione. L'ampiezza della pressione viene parzialmente assorbita dall'osso e una certa ampiezza di pressione viene persa dalla riflessione e dallo scattering50. Nei nostri esperimenti abbiamo stabilito nei cadaveri di topi che l'attenuazione a 1 MHz è di 14,5 ± 1,3 dB/cm con uno spessore medio del cranio di 0,9 mm come mostratoprima di 21,50. Il monitoraggio della cavitazione è altamente raccomandato poiché le microbolle riflettono distinte emissioni acustiche durante la cavitazione stabile e la cavitazione inerziale. L'emissione a banda larga è un'emissione acustica distinta per la cavitazioneinerziale 12. Il monitoraggio in tempo reale consente di rilevare la cavitazione inerziale e abbassare di conseguenza l'ampiezza della pressione per evitare danni ai tessuti.
Rapporti precedenti descriveva l'influenza del tipo di anestesia sulla permeabilità BBBraggiunta 11,31. Per l'anestesia a base di isoflurane, una vasodilatazione si verifica poco dopo l'iniziazione all'anestesia, che è associata a una leggera riduzione del flusso sanguigno cerebrale. Inoltre, l'anestesia su durate prolungate, in particolare in assenza di stabilizzazione della temperatura, porta a una ridotta frequenza cardiaca. Poiché entrambi i fattori possono potenzialmente portare a una maggiore varianza della concentrazione cerebrale di microbolle o farmaci co-somministrati, è consigliabile un rigoroso protocollo di anestesia per ottenere risultati riproducibili51. L'anestesia con 1,5% v/v isoflurane in 2 L/min di ossigeno per 35-45 minuti non è stata problematica, come consigliato da Constantinides etal. A differenza di McDannold et al. In alternativa, gli animali possono essere anestetizzati con un mix di ketamina / xiazina, che non ha effetti vasoattivinoti 53.
In sintesi, la tecnica di apertura BBB guidata dall'imaging descritta qui è stata utilizzata per studi di valutazione preclinica dei farmaci ad alto volume che hanno dimostrato l'efficienza del flusso di lavoro suggerito. Il sistema potrebbe quindi essere gestito da personale non tecnico dopo una breve formazione dovuta all'elevato grado di automazione. Ciò in combinazione con la semplicità dell'installazione ha portato a un alto grado di standardizzazione, che a sua volta garantisce riproducibilità sperimentale, ridotta variabilità all'interno del gruppo e consente quindi di ridurre la dimensione del campione richiesta.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato finanziato dal KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma e High-grade Glioma). Ringraziamo Ilya Skachkov e Charles Mougenot per il loro contributo allo sviluppo del sistema.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | Becton Dickinson | 309628 | Plastipak |
| 19 G needle | Terumo Agani | 8AN1938R1 | |
| 23 G needle | Terumo Agani | 8AN2316R1 | |
| 3M Transpore surgical tape | Science applied to life | 7000032707 | or similar |
| Arbitrary waveform generator | Siglent | n.a. | SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s |
| Automated stereotact | in-house built | n.a. | Stereotact with all elements were in-house built |
| Bruker In-Vivo Xtreme | Bruker | n.a. | Includes software |
| Buffered NaCl solution | B. Braun Melsungen AG | 220/12257974/110 | |
| Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK limitd | n.a. | 0.324 mg |
| Cage enrichment: paper-pulp smart home | Bio services | n.a. | |
| Carbon filter | Bickford | NC0111395 | Omnicon f/air |
| Ceramic spoon | n.a | n.a. | |
| Cotton swabs | n.a. | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Ethanol | VUmc pharmacy | n.a. | 70% |
| Evans Blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Fresenius NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | n.a. | NaCl 0.9 %, 1000 mL |
| Histoacryl | Braun Surgical | n.a. | Histoacryl 0.5 mL |
| Hydrophone | Precision Acoustics | n.a. | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 324825/324826 | 0.5 mL and 0.3 mL |
| Isoflurane | TEVA Pharmachemie BV | 8711218013196 | 250 mL |
| Ketamine | Alfasan | n.a. | 10 %, 10 mL |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | Envigo | 2918-11416M | |
| Neoflon catheter | Becton Dickinson | 391349 | 26 GA 0.6 x 19 mm |
| Oscilloscope | Keysight technologies | n.a. | InfiniiVision DSOX024A |
| Plastic tubes | Greiner bio-one | 210261 | 50 mL |
| Power amplifier | Electronics & Innovation Ltd | 210L | Model 210L |
| Preamplifier DC Coupler | Precision Acoustics | n.. | Serial number: DCPS94 |
| Scissors | Sigma Aldrich | S3146-1EA | or similar |
| Sedazine | AST Farma | n.a. | 2% |
| SonoVue microbubbles | Bracco | n.a. | 8 µl/ml |
| Sterile water | Fresenius Kabi | n.a. | 1000 mL |
| Syringe | n.a. | n.a. | various syringes can be used |
| Temgesic | Indivior UK limitd | n.a. | 0.3 mg/ml |
| Transducer | Precision Acoustics | n.a. | 1 MHz |
| Tweezers | Sigma Aldrich | F4142-1EA | or similar |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | 01-02 | Aquasonic 100 |
| Vidisic gel | Bausch + Lomb | n.a. | 10 g |
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