Summary
Blod- hjärnbarriären (BBB) kan tillfälligt störas med mikrobubble-medierat fokuserat ultraljud (FUS). Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för hög genomströmning BBB-öppning in vivo med hjälp av ett modulärt FUS-system tillgängligt för icke-ultraljudsexperter.
Abstract
Blod- hjärnbarriären (BBB) har varit ett stort hinder för behandling av olika hjärnsjukdomar. Endotelceller, förbundna med snäva korsningar, bildar en fysiologisk barriär som förhindrar att stora molekyler (>500 Da) kommer in i hjärnvävnaden. Microbubble-medierad fokuserad ultraljud (FUS) kan användas för att inducera en övergående lokal BBB öppning, så att större läkemedel kan komma in i hjärnan parenkym.
Förutom storskaliga kliniska enheter för klinisk översättning kräver preklinisk forskning för behandlingsresponsbedömning av läkemedelskandidater dedikerade smådjur ultraljudsinställningar för riktad BBB-öppning. Helst tillåter dessa system arbetsflöden med hög genomströmning med både hög rumslig precision och integrerad kavitationsövervakning, samtidigt som de är kostnadseffektiva i både initiala investeringar och driftskostnader.
Här presenterar vi ett bioluminescens- och röntgenstyrt stereotaktiskt FUS-system för smådjur som bygger på kommersiellt tillgängliga komponenter och uppfyller ovan nämnda krav. Särskild vikt har lagts vid en hög grad av automatisering som underlättar de utmaningar som vanligtvis uppstår i prekliniska läkemedelsutvärderingsstudier med hög volym. Exempel på dessa utmaningar är behovet av standardisering för att säkerställa data reproducerbarhet, minska variabiliteten inom gruppen, minska urvalsstorleken och därmed uppfylla etiska krav och minska onödig arbetsbelastning. Det föreslagna BBB-systemet har validerats inom ramen för BBB-öppnandet av underlättade läkemedelsleveransförsök på patientbaserade xenograftmodeller av glioblastom multiforme och diffusa midline glioma.
Introduction
Blod- hjärnbarriären (BBB) är ett stort hinder för läkemedelsleverans till hjärnans parenkym. De flesta terapeutiska läkemedel som har utvecklats korsar inte BBB på grund av deras fysikaliskkemiska parametrar (t.ex. lipofilibilitet, molekylvikt, vätebindnings acceptorer och givare) eller behålls inte på grund av deras affinitet för utflödestransportörer i hjärnan1,2. Den lilla gruppen läkemedel som kan korsa BBB är vanligtvis små lipofila molekyler, som bara är effektiva i ett begränsat antal hjärnsjukdomar1,2. Som en följd av detta, för de flesta hjärnsjukdomar, är farmakologiska behandlingsalternativ begränsade och nya drug delivery-strategier behövs3,4.
Terapeutisk ultraljud är en framväxande teknik som kan användas för olika neurologiska applikationer såsom BBB-störningar (BBBD), neuromodulering och ablation4,5,6,7. För att uppnå en BBB-öppning med en extrakorpooreal ultraljudsemitterare genom kraniet kombineras fokuserat ultraljud (FUS) med mikrobubblor. Mikrobubble-medierad FUS resulterar i ökad biotillgänglighet av läkemedel i hjärnan parenkym5,8,9. I närvaro av ljudvågor börjar mikrobubblor svänga initiering av transcytos och störningar av de snäva korsningarna mellan endotelcellerna i BBB, vilket möjliggör paracellulär transport av större molekyler10. Tidigare studier bekräftade sambandet mellan intensiteten i det akustiska utsläppet och den biologiska påverkan på BBB-öppningen11,12,13,14. FUS i kombination med mikrobubblor har redan använts i kliniska prövningar för behandling av glioblastom med temozolomid eller liposomal doxorubicin som kemoterapeutiskt medel, eller för behandling av Alzheimers sjukdom och amyotrofisk lateral skleros5,9,15,16.
Eftersom ultraljud medierad BBB-öppning resulterar i helt nya möjligheter till farmakoterapi, behövs preklinisk forskning för klinisk översättning för att bedöma terapisvaret hos utvalda läkemedelskandidater. Detta kräver vanligtvis ett arbetsflöde med hög genomströmning med både hög rumslig precision och helst en integrerad kavitationsdetektering för övervakning av riktad BBB-öppning med hög reproducerbarhet. Om möjligt måste dessa system vara kostnadseffektiva i både initiala investeringar och driftskostnader för att kunna skalbara enligt studiestorleken. De flesta prekliniska FUS-system kombineras med MRT för bildvägledning och behandlingsplanering15,17,18,19. Även om MRI ger detaljerad information om tumör anatomi och volym, är det en dyr teknik, som i allmänhet utförs av utbildade / skickliga operatörer. Dessutom kanske högupplöst MRT inte alltid är tillgängligt för forskare i prekliniska anläggningar och kräver långa skanningstider per djur, vilket gör det mindre lämpligt för farmakologiska studier med hög genomströmning. Anmärkningsvärt är att för preklinisk forskning inom neuro-onkologi, i synnerhet infiltrativa tumörmodeller, är möjligheten att visualisera och rikta tumören avgörande för behandlingsframgång20. För närvarande uppfylls detta krav endast av MRI eller av tumörer transduced med ett fotoprotein, vilket möjliggör visualisering med bioluminescens imaging (BLI) i kombination med administrering av fotoprotein substrat.
MRI-styrda FUS-system använder ofta ett vattenbad för att säkerställa ultraljudsvågspridning för transkraniella tillämpningar, varigenom djurets huvud delvis är nedsänkt i vattnet, de så kallade "bottom-up"-systemen15,17,18. Även om dessa konstruktioner i allmänhet fungerar bra i mindre djurstudier, är de en kompromiss mellan djurberedningstider, bärbarhet och realistiskt underhållbara hygieniska standarder under användning. Som ett alternativ till MRI omfattar andra styrmetoder för stereotaktisk navigering användningen av en gnagare anatomisk atlas21,22,23, laserpekare assisterad visuell observation24, pinhole-assisted mekanisk skanning enhet25, eller BLI26. De flesta av dessa mönster är "top-down" -system där givaren placeras ovanpå djurets huvud, med djuret i en naturlig position. Arbetsflödet "uppifrån och ned" består antingen av ett vattenbad22,25,26 eller en vattenfylld kon21,24. Fördelen med att använda en givare inuti en sluten kon är det mer kompakta fotavtrycket, kortare installationstid och möjligheter till direkt sanering som förenklar hela arbetsflödet.
Interaktionen mellan det akustiska fältet och mikrobubblorna är tryckberoende och sträcker sig från oscillationer med låg amplitud (kallas stabil kavitation) till övergående bubbelkollaps (kallad inertial kavitation)27,28. Det finns en etablerad konsensus om att ultraljud-BBBD kräver ett akustiskt tryck långt över den stabila kavitation tröskeln för att uppnå framgångsrika BBBD, men under den inertiella kavitation tröskeln, som i allmänhet är associerad med vaskulär/neuronal skada29. Den vanligaste formen av övervakning och kontroll är analysen av den (rygg)spridda akustiska signalen med passiv kavitationsdetektering (PCD), som föreslagits av McDannold et al.12. PCD bygger på analys av Fourier-spektrat av mikrobubblors emissionssignaler, där styrkan och utseendet hos stabila kavitationsmärken (övertoner, subharmoniker och ultraharmoniker) och inerta kavitationsmarkörer (bredbandsrespons) kan mätas i realtid.
En "en storlek passar alla" PCD-analys för exakt tryckkontroll är komplicerad på grund av mikrobubbleformuleringens polydispersitet (oscillationsamlituden beror starkt på bubbeldiametern), skillnaderna i bubbelskalegenskaper mellan märken och den akustiska svängningen, som starkt beror på frekvens och tryck30,31,32. Som en följd av detta har många olika PCD-detekteringsprotokoll föreslagits, som har anpassats till särskilda kombinationer av alla dessa parametrar och har använts i olika applikationsscenarier (allt från in vitro-experiment över små djurprotokoll till PCD för klinisk användning) för robust kavitationsdetektering och även för retroaktiv återkopplingskontroll av trycket11,14,30,31,32,33,34,35. PcD-protokollet som används inom ramen för denna studie härleds direkt från McDannold et al.12 och övervakar det harmoniska utsläppet för förekomst av stabil kavitation och bredbandsbuller för inertiell kavitationsdetektering.
Vi har utvecklat ett bildstyrt neuronavigation FUS-system för övergående öppning av BBB för att öka läkemedelstillförseln till hjärnan parenkym. Systemet bygger på kommersiellt tillgängliga komponenter och kan enkelt anpassas till flera olika bildframställningsmetoder, beroende på tillgängliga bildtekniker i djuranläggningen. Eftersom vi behöver ett arbetsflöde med hög genomströmning har vi valt att använda röntgen och BLI för bildvägledning och behandlingsplanering. Tumörceller transduced med ett fotoprotein (t.ex. luciferas) är lämpliga för BLI imaging20. Efter administrering av fotoproteinsubstratet kan tumörceller övervakas in vivo och tumörtillväxt och plats kanbestämmas 20,36. BLI är en billig bildframställning modalitet, det gör det möjligt att följa tumörtillväxten över tid, den har snabba skanningstider och det korrelerar väl med tumörtillväxt mätt med MRI36,37. Vi har valt att ersätta vattenbadet med en vattenfylld kon fäst vid givaren för att möjliggöra flexibilitet att fritt flytta plattformen där gnagaren är monterad8,24. Designen är baserad på en avtagbar plattform utrustad med integrering av (I) smådjurs stereotaktiska plattform (II) fiducialmarkörer med både röntgen- och optisk bildkompatibilitet (III) snabbavtagbar anestesimask och (IV) integrerat temperaturreglerat djurvärmesystem. Efter den första induktionen av anestesi monteras djuret i ett exakt läge på plattformen där det förblir under hela proceduren. Följaktligen passerar hela plattformen alla stationer i arbetsflödet för hela insatsen, samtidigt som en korrekt och reproducerbar positionering upprätthålls och en ihållande anestesi upprätthålls. Kontrollprogramvaran gör det möjligt att automatiskt detektera fiducialmarkörerna och registrerar automatiskt alla typer av bilder och bildmodaliteter (dvs. mikro-CT, röntgen, BLI och fluorescensavbildning) i referensramen för den stereotaktiska plattformen. Med hjälp av ett automatiskt kalibreringsförfarande är ultraljudsgivarens brännvidd exakt känd inom, vilket möjliggör automatisk fusion av interventionell planering, akustisk leverans och uppföljande bildanalys. Som visas i figur 1 och figur 2ger denna inställning en hög grad av flexibilitet för att utforma dedikerade experimentella arbetsflöden och möjliggör interfolierade hantering av djuret på olika stationer, vilket i sin tur underlättar experiment med hög genomströmning. Vi har använt denna teknik för framgångsrik läkemedelsleverans i mus xenografts av hög kvalitet gliom såsom diffusa mittlinjen gliom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla in vivo-experiment godkändes av den nederländska etiska kommittén (licenstillståndsnummer AVD114002017841) och djurskyddsorganet i Vrije Universiteit Amsterdam, Nederländerna. Utredarna utbildades i grunderna i FUS-systemet för att minimera djurens obehag.
1. Fokuserat ultraljudssystem
OBS: Den beskrivna installationen är ett inhousebyggt BBB-störningssystem baserat på kommersiellt tillgängliga komponenter och innehåller en 3D-utskriven specialtillverkad kon och avtagbar stereotaktisk plattform. Systemet är konstruerat modulärt, vilket underlättar modifieringar enligt tillgänglig utrustning och specifik användning. Protokollet beskriver förfarandet för sonoporation av ett större område i pontin regionen av mus hjärnan. Genom att justera målplatsen kan olika delar av hjärnan vara måltavlor. I denna studie användes en 1 MHz monoelementgivare med en brännvidd på 75 mm, en bländare på 60 mm och ett brännområde på 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM topptryck). Givarens brännplan placeras genom djurets kranium i det horisontella planet som skär med öronstängerna.
- Välj en lämplig givare för BBB-öppning hos gnagare.
OBS: Baserat på mikrobubblorna och den använda frekvensen kan de akustiska inställningarna, särskilt det mekaniska indexet (MI), ändras13,38. - Placera givaren i den 3D-utskrivna konen.
- Använd ett akustiskt transparent mylarmembran längst ner i konen för att uppnå akustisk koppling av strålutbredningsbanan och fyll konen med avgasat vatten.
- Montera givaren ovanför djuret på ett motoriserat linjärt stadium enligt figur 1 så att givaren kan placeras automatiskt vertikalt.
- Designa en avtagbar stereotaktisk plattform baserad på studiens krav, som inkluderar temperaturreglerad uppvärmning, bett- och öronstänger, anestesi och fiducialmarkörer med multimodalitet, som visas i figur 1 och figur 2. Monteringen av den stereotaktiska plattformen består av ett 2D linjärt stegsystem, vilket möjliggör exakt automatisk positionering (< 0,1 mm) av djuret under balken.
- Anslut givaren till den akustiska emissionskedja som visas i figur 1 och som består av en givare, en funktionsgenerator och en effektförstärkare.
- Utforma en bildbehandlingspipeline för att upptäcka fiducialmarkörer med flera modalitet som möjliggör exakt sonoporationsinriktning av hjärnans intresseområde och insamling av kavitationsdata som detekteras av nålhydronen.
- Kalibrera systemet och bestäm givarens fokuspunkt i korrespondens med djurets vertikala positionering på den stereotaktiska plattformen.
2. Djurberedning
OBS: Följande protokoll är specificerat för möss men kan anpassas för råttor. För dessa experiment användes kvinnliga athymic naken Foxn1-/- möss (6-8 veckor gamla).
- Låt djuret acklimatisera sig i minst en vecka i djuranläggningen och väg djuret regelbundet.
- Administrera buprenorfin (0,05 mg/kg) via subkutan (s.c.) injektion 30 min före FUS-behandling för att påbörja smärtstillande behandling.
- Bedöva djuret med 3% isofluran, 2 L/min O2 och kontrollera att djuret är djupt sövt. Håll djuren bedövade under hela proceduren och övervaka andningsfrekvensen och hjärtfrekvensen för att justera koncentrationen av isofluran efter behov.
- Applicera ögonsalva för att förhindra torra ögon och undvika eventuella skador.
- Ta bort håret på toppen av huvudet med en rakhyvel och depilatorisk kräm och tvätta efteråt med vatten för att avlägsna eventuella rester för att undvika irritation på huden.
- För experiment med BLI tumör modeller, injicera 150 μL D-luciferin (30 mg/mL) intraperitoneal (dvs. med en 29 G insulin spruta för BLI bildvägledning.
- Sätt in en 26-30 G svansvenkateter och spola katetern och venen med en liten volym heparinlösning (5 UI/ml). Fyll katetern med heparinlösning för att undvika blodkoagulering.
OBS: Bra kateterisering ses när det finns en reflux av blod i katetern. Undvik luftbubblor i katetern för att förhindra emboli. För att undvika överdrivet injektionstryck, se till att kateterns längd är så kort som möjligt. - Placera djuret på den temperaturreglerade stereotaktiska plattformen för att undvika hypotermi.
OBS: Hypotermi minskar blodcirkulationen, vilket kan påverka injektionen/cirkulationen av mikrobubblor och farmakokinetiken hosläkemedlen 39. - Immobilisera och fixera djurets huvud på den stereotaktiska plattformen med öronstänger och en bettstång. Fixera kroppen med en rem och tejpa djurets svans till plattformen.
3. In vivo bildstyrd fokuserad ultraljud
OBS: För detta protokoll användes en 1 MHz mono-element givare med en ton-burst puls med en 10 ms varaktighet, en MI på 0,4 och en puls repetition frekvens på 1,6 Hz med 40 cykler för 240 s. Protokollet är optimerat för mikrobubblor som stabiliseras av fosfolipider som innehåller svavelhexafluorid (SF6) som en harmlös gas, varigenom den genomsnittliga bubbeldiametern är 2,5 μm och mer än 90% av bubblorna är mindre än 8 μm.
- Placera den stereotaktiska plattformen med det monterade djuret i bildmodaliteten (t.ex. BLI eller röntgen) och ta bilder av djuret.
- Använd fiducialmarkörerna för multimodalitet i kombination med bildbehandlingspipelinen för att markera djurets position enligt givarens fokuspunkt.
- Bestäm målområdet genom att placera en hjärnkontur över den förvärvade röntgenbilden eller använda BLI-bilder för att bestämma tumörens mitt (figur 2). Positionen för specifika delar av hjärnan anges i Paxinos Brain Atlas40 med hjälp av skallmarkeringarna bregma och lambda som referenspunkter. Till exempel finns ponnyerna x=-1,0, y=-0,8 och z=-4,5 från lambda.
- Skydda djurets näsborrar och mun med tejp för att förhindra att ultraljudsgel stör andningen.
- Applicera ultraljudsgel ovanpå djurets huvud.
- Dra tillbaka huden på djurens nacke, smörj nålen hydrofon med ultraljud gel och placera nålen hydrofon i direkt närhet av occipital ben.
- Vägled givaren till rätt position med hjälp av bildbehandlingspipelinen och fokuspunkten.
- Tillämpa de förkonfigurerade inställningarna på alla anslutna enheter och rikta in dig på den hjärnregion som är av intresse.
OBS: Beroende på forskningsfrågan kan tumör- eller hjärnregioner sonoporeras som en enda kontaktpunkt eller som volymetrisk form, vilket visas i figur 2. - Aktivera mikrobubblor enligt tillverkarens beskrivet. Injicera en bolus på 120 μL (5,4 μg) mikrobubblor.
- Spola stjärtvetetern med saltlösning för att kontrollera kateterns öppning.
- Injicera mikrobubblorna och starta insonationen.
- Spela in mikrobubble cavitation med nålhydrofonen.
- Administrera ett intravaskulärt kontrastmedel eller läkemedel efter sonoporation. Dosen, tidpunkten och planeringen är beroende av syftet med studien och läkemedlet.
OBS: Evans blå är ett vanligt färgmedel för att bedöma BBB-öppning41. - Övervaka djuret fram till den förutbestämda tidspunkten eller före den humana slutpunkten.
4. Analys av mikrobubble kavitation
OBS: Här beskrivs det tillämpade förfarandet, som är lämpligt för in vivo-experiment för SF6-fosfolipidmikrobubblor med en genomsnittlig diameter på 2,5 μm (80% av bubblorna under 8 μm) upphetsad med en burst-ton puls på 10 ms varaktighet vid en frekvens av 1 MHz, som ursprungligen föreslogs av McDannold et al.12.
- Fourier-omvandla den inspelade PCD-signalen från tidsdomänen till frekvensdomänen.
- Integrera den resulterande spektraleffekten för stabil kavitationsdetekteringrunt 2:a och 3rd-harmoniska (± 50 kHz), som visas i figur 3 (grön låda vid 2 och 3 MHz).
- Integrera spektraleffekten för inertial kavitationsdetektering, mellanhuvudfrekvensen, 2:a,3 rd-harmonik, 1:a och2:a ultraharmonik och den första underharmoniska (± 150 kHz), som visas i figur 3 (röda lådor).
- Integrera spektraleffekten runt principfrekvensen (1 MHz ± 50 kHz) för normalisering av båda tidigare erhållna PCD-signaler.
OBS: PCD-signalen förSF 6-fosfolipidmikrobubblor in vivo-experiment vid 1 MHz visar inte ultraharmoniker eller subharmoniker innan tröghetshålan sätter in, som visas i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det beskrivna FUS-systemet (figur 1 och figur 2) och det tillhörande arbetsflödet har använts i över 100 djur och producerat reproducerbara data om både friska möss och tumörbärande möss. Baserat på den registrerade kavitationen och spektraltätheten vid övertonerna under det högsta ögonblicket av mikrobubble bolus-injektionen kan spektraleffekten för varje frekvens beräknas med hjälp av Fourier-analysen enligt vad som förklaras i steg 4 i protokollet. Baserat på det akustiska protokollet (1 MHz, 10 ms pulsvaraktighet) med en felindikation på 0,4 i kombination med mikrobubblor normaliserades det normaliserade integrerade effektspektrumet vid övertonerna2:a och 3rd normaliserade det integrerade effektspektrumet för excitationsfrekvensen i figur 3. Detta gav ett mycket känsligt och tillförlitligt sätt att stabil kavitation detektion, i jämförelse med ingen påvisande av subharmonics när inga mikrobubblor injicerades eller observation av inertial kavitation när en MI på 0,6 tillämpades. Vid inertial kavitation upptäcktes ett ökat bredbandsljudgolv på upp till 25 dB samt utseendet på ultra-övertoner och subharmoniker. Även om ett akustiskt tryck av en felindikation på 0,4 och 0,6 resulterade i inga makroskopiska skador, visades mikroskopiska skador histologiskt vid en felindikation på 0,6, som visas i figur 4. En ytterligare ökning av trycket amplitud upp till en MI på 0,8 resulterade i en makroskopisk hjärnan blödning av större fartyg och bred spridning vävnad lysis med extravasation av erytrocyter. De histologiska resultaten motsvarade akustiska data från den passiva kavitationssensorn, som visas i figur 3, vilket bekräftar de skadliga egenskaperna hos inertial kavitation av hjärnvävnaden. Till följd av detta valdes en felindikation på 0,4 som den säkra tryckamlitud som gav mycket reproducerbar BBB-öppning, samtidigt som den gav en säker marginal till det inerta kavitationssystemet, vilket observerades före11.
Intravenös Evans blå injicerades för att validera öppnandet av BBB i pontin regionen. Den starka albuminbindningen av Evans blå leder till en stor molekyl på mer än 66 kDa42. På pons och delvis lillhjärnan observerades extravasation av Evans blåkonjugerade albumin i musen som behandlades med FUS och mikrobubblor i motsats till musen utan mikrobubblor (Figur 5). Detta betonar den exakta inriktningen av den region av intresse baserat på bildstyrd stereotaktisk navigering med det interna bygg FUS-systemet och det beskrivna protokollet.
Bild 1: Fokuserad ultraljudsinställning.
(A) Schematisk representation av den fokuserade ultraljudsuppsättningen. (B) Bild av den fokuserade ultraljud setup. Systemet består av en uppifrån och ned monterad givare på en 1D linjär scen under ett andra 2D-steg för automatisk 3D-positionering. Givaren är byggd i en vattenfylld balkkon, stängd i botten med ett akustiskt transparent mylarmembran, som leder ljudet till djurets kranium. Givaren är ansluten till en effektförstärkare, som i sin tur är ansluten till en godtycklig vågformsgenerator (AWG) för signalgenerering. För kavitationsdetektering används en avtagbar hydrofon i kombination med en lågbrusig spänningsförstärkare. Hydrofonen placeras i direkt närhet av occipitalbenet. Den yttre hydrofonen har en 2 mm aktiv yta och är akustiskt ihopsydd med ultraljudsgel. Både högspänningssignalen för excitationspulsen och den registrerade kavitationssignalen digitaliseras av ett standard 200 MHz oscilloskop och vidarebefordras till en styrdator (visas inte) för bearbetning i farten och realtidskontroll. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2: Fokuserat ultraljudsarbetsflöde.
Det föreslagna arbetsflödet för det fokuserade ultraljudssystemet börjar med (A) den ursprungliga placeringen av djur på en avtagbar stereotaktisk plattform, notera tillämpningen av den akustiska kopplingsgelen (applicerad efter BLI / röntgen). Samtidigt kan multimodal avbildning utföras för inriktning. (B) Vid första röntgenbilder är en möjlighet, medan en region av intresse kan riktas med hjälp av en kontur av hjärnan (som i sin tur refereras till mushjärnatlasen40, anpassad till skallens storlek och hållning). (C) Alternativt kan en BLI-bild av en luciferastransfekterad diffus mittlinje gliom tumör överlagrad på en röntgen maximal intensitet projektion tillämpas för inriktning. (D) Därefter monteras den stereotaktiska plattformen med djuret i behandlingsläge med både hydrofon och givare anslutna. Givaren kör automatiskt i behandlingsläge och avljudar den valda banan efter bolusinjektion. Systemet är optimerat för experiment med hög genomströmning, där flera plattformar tillåter interfolierad arbete, som visas ovanifrån. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Kavitationsövervakning.
a)Frekvensspektrum för ett in vivo-experiment i avsaknad av mikrobubble administation vid en felindikation på 0,4 vid 1 MHz. (B) Visas är motsvarande spektrum vid topp-bolus efter injektion av mikrobubblor. Notera ökningen av de högre övertonerna, vilket är vägledande för stabil kavitation av mikrobubblorna. (C) Motsvarande spektrum observerat vid en högre felindikation på 0,6 i kombination med mikrobubbleinjektion, inom övergångsbandet till uppkomsten av inertial kavitation, vilket leder till en ökning av bullergolvet upp till 25 dB och utseendet på ultraharmoniker och subharmoniker. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: BBB-öppning och tillhörande histologi.
(A) Stabil kavitation med en MI på 0,4 visade en intakt hjärnan parenkym i både vitt ljus makroskopi och HE färgade mikroskopi. B)Efter en felindikation på 0, 6 första tecken på lokala irreversibla vävnad skador av hjärnan parenkym blir uppenbart i HE färgade histologiska data. (C) För ännu högre mekaniskt tryck av MI 0,8 är makroskopisk blödning uppenbar samt bred spridning av vävnadslys i hjärnans parenkym och extravasation av erytrocyter på grund av mikroblödning. Den blå nyansen i den vita ljusmakrosspyan är vägledande för extravasation av det saminjekterade intravaskulära kontrastmedlet Evans blå som indikerar BBB-öppning (se figur 5 för en sagittal vy). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Validering av BBB-öppning.
Demonstration av framgångsrik BBB-öppning i det stabila kavitationsregimen (B) jämfört med kontrollen (A), inga mikrobubblor injiceras. I detta fall har Evans blå använts som intravaskulärt kontrastmedel. Den starka albuminbindningen av Evans blå leder till en stor molekyl på mer än 66 kDa. Till följd av detta tyder bevis på Evans blå extravasation på paracellulära transporter över BBB på grund av en (partiell) öppning av de täta korsningarna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie utvecklade vi ett kostnadseffektivt bildstyrt FUS-system för övergående BBB-störningar för ökad läkemedelstillförsel till hjärnans parenkym. Systemet byggdes till stor del med kommersiellt tillgängliga komponenter och i samband med röntgen och BLI. Den föreslagna designens modularitet gör det möjligt att använda flera bildframställningsmetoder för planering och utvärdering i arbetsflöden med hög genomströmning. Systemet kan kombineras med mer omfattande högupplösta 3D-bildframställningsmetoder, till exempel högupplöst MRT eller mikro-CT, medan 2D-bildframställningsmetoder som 2D-röntgen och/eller BLI används för huvuddelen av studien. 2D-röntgen och/eller BLI är båda betydligt mer kostnadseffektiva och idealiska för högvolymsstudier på grund av deras respektive korta förvärvstider. Den givare som beskrivs här är väl lämpad att producera BBBD i större områden (på skalan av en mushjärna) i djupare delar av hjärnan (f antal 1,25). Vi har använt systemet för diffust växande tumörer i pontinska regionen43,44. För dessa regioner måste en större volym sonoporeras som omfattar hela tumörregionen i pons. Det modulära systemet kan enkelt justeras för andra typer av hjärntumörer i mer supratentoriala delar av hjärnan. För att besluta om givarens typ bör man ta hänsyn till f-nummer, brännvidd och frekvens.
Den total- designen föreslår därmed två förfiningar jämfört med tidigare föreslagna designer. (I) Ofta används ett vattenbad för ultraljudsvågöverföring av terapeutiska system. För transkraniella tillämpningar hos små djur resulterar denna typ av design i större och inverterade inställningar, varigenom djuret delvis är nedsänkt11,22,25. Även om dessa konstruktioner i allmänhet fungerar mycket bra inom ramen för mindre djurstudier, är de en kompromiss när det gäller installationstider, bärbarhet och realistiskt underhållbara hygieniska standarder under användningen. I synnerhet är dessa av stor betydelse i de omfattande studier som omfattar immunkomprometterade djur och därmed strikta hygieniska normer. För att utforma ett system med ett mer kompakt fotavtryck, kortare installationstid, enkla saneringsmöjligheter och en naturlig position för djuret under hela arbetsflödet valdes därför en "top-down"-design. (II) Det andra designvalet som skiljer sig från flera tidigare beskrivna konstruktioner var att utelämna den direkta integrationenav det akustiska leveranssystemet i ett medicinsktbildsystem, t.ex. Även om helt integrerade system är idealiska för longitudinella farmakokinetiska studier eller explorativ forskning på ett begränsat antal djur, är sådana inställningar i allmänhet mindre lämpliga för farmakologiska studier med hög volym på grund av avsevärt ökad komplexitet, höga driftskostnader och behov av utbildade/kvalificerade operatörer. Dessutom är sådana system i allmänhet begränsade till endast en bildframställningsmodalitet. Som en följd av detta förlitar sig den föreslagna designen här på en modulär avtagbar stereotaktisk plattform, som är kompatibel med flera bildframställningsmetoder (mikro-CT, smådjurs MRT, en mängd BLI / fluorescenskameror, dessa med eller utan integrerad röntgenavbildning) och ger också multimodalitetsfiducialmarkörer för automatisk fusion av alla bilddata i en gemensam referensram för både interventionell planering och uppföljning efter BBB-öppning.
När det gäller praktiska överväganden är den mest kritiska punkten för misslyckande i förfarandet mikrobubblornas stabilitet på grund av deras begränsade livslängd och deras bräckliga natur. Vi vill betona att följande diskussion gäller mikrobubblor stabiliserade av fosfolipider och innehåller svavelhexafluorid (SF6) som en harmlös gas46,47, medan andra mikrobubble formuleringar i allmänhet kommer att visa olika egenskaper.
Tidpunkt före mikrobubble injektion: Den annonserade livslängden för kommersiellt tillgängliga mikrobubblor efter återfuktning är mellan 3 och 4 timmar. Även om detta är lämpligt för diagnostiska ultraljudstillämpningar, bör det noteras att under hela denna period förlorar mikrobubblorna kontinuerligt gas och följaktligen är den genomsnittliga bubbeldiametern föremål för en kontinuerlig nedåtgående drift från den ursprungliga genomsnittliga storleken på 2,5 μm. För terapeutiska tillämpningar såsom ultraljud-medierad BBBD innebär detta mycket strängare timing-imperativ, eftersom oscillation amplitud av stabil kavitation (vid en given frekvens och tryck) och uppkomsten-tröskeln för inertial kavitation är som en direkt följd också föremål för en kontinuerlig drift. Enligt vår erfarenhet har vi observerat att mikrobubblor bäst används inom 30 minuter efter rehydrering för att erhålla reproducerbara resultat, liknande tidigare rapporter48.
Tidpunkt efter mikrobubble injektion: Hos större primater uppvisarkommersiellt tillgängliga SF 6-fosfolipida mikrobubblor en halveringstid för eliminering av blodplasma på cirka 6 minuter och mer än 80% av den administrerade gasen andas ut via lungorna efter endast 11 minuteroch 48. Hos små däggdjur som möss och råttor är halveringstid för blod-plasmaeliminering av denna typ av mikrobubblor in vivo med 90-120 sekunder betydligt kortare på grund av den högrehjärtfrekvensen 20. Som en följd av detta inför den snabba dynamiken i mikrobubblekoncentrationen direkt efter bolusinjektionen och den snabba efterföljande plasmaelimineringen i kombination med den kontinuerliga gasvolymförlusten av bubblorna strikta tidskrav på ultraljudsbehandlings-/injektionsprotokollet för att erhålla reproducerbara resultat inom den korta varaktigheten av 3-4 minuter efter injektionen. Längre procedurer eller mer omfattande volymer BBBD kräver företrädesvis kontinuerlig administrering av mikrobubblor. Ett sådant tillvägagångssätt kompliceras dock av bubblorna i både sprutan och matningssystemet och introducerar också en avsevärt ökad död volym med den nödvändiga infusionsslangen. Enligt vår erfarenhet gav den enklare lösningen att dela upp den totala injektionsvolymen i 2 till 3 mindre deldoser ett robust och reproducerbart resultat.
Dessutom är mikrobubblor mycket tryckkänsliga och högt hydrostatiskt tryck under injektion rekommenderas därför inte. Stora nålar (>19 G) rekommenderas för överföring av mikrobubblor till ett plaströr eller för att dra upp mikrobubblor med en spruta49. För injektion hos möss rekommenderas 26-30 G nålar; eftersom större nålar är svårare att sätta in i svans venen. 26 G-nålen rekommenderas eftersom det hydrostatiska trycket är lägre med denna nål. Vid svår venös åtkomst rekommenderas dock 30 G-nålen.
Musens kranium är en viktig dämpare av tryckamlituden som avsevärt sänker tryckamlituden i fokus. Dämpning bestäms av givarens frekvens och densiteten hos mediet som ultraljudsvågen förökar sig. Högre ultraljudsfrekvenser och höga vävnadstätheter, som ben resulterar i hög dämpning. Tryckamlituden absorberas delvis av ben och viss tryckamlitud går förlorad genom reflektion och spridning50. I våra experiment har vi i muskadaver fastställt att dämpningen vid 1 MHz är 14,5 ± 1,3 dB/cm med en genomsnittlig skalltjocklek på 0,9 mm som visasföre 21,50. Kavitation övervakning rekommenderas starkt eftersom mikrobubblor återspeglar distinkta akustiska utsläpp under stabil kavitation och inertial kavitation. Bredbandsemission är ett distinkt akustiskt utsläpp för inertial kavitation12. Realtidsövervakning gör det möjligt att upptäcka inertial kavitation och sänka tryckamplituden i enlighet därmed för att undvika vävnadsskador.
Tidigare rapporter beskrev påverkan av typen av anestesi på den uppnådda BBB permeabiliteten11,31. För isofluranbaserad anestesi sker en vasodilatation kort efter anestesiinitiering, vilket är förknippat med en liten minskning av cerebralt blodflöde. Dessutom leder anestesi över förlängda varaktigheter, särskilt i avsaknad av en temperaturstabilisering, till en minskad hjärtfrekvens. Eftersom båda faktorerna potentiellt kan leda till en större varians av cerebral koncentrationen av både mikrobubblor eller co-administrerade läkemedel, är ett strikt anestesiprotokoll lämpligt för att uppnå reproducerbara resultat51. Anestesi med 1,5% v/v isofluran i 2 L/min syre i 35 till 45 minuter var inte problematiskt, som rekommenderas av Constantinides et al.51. I motsats till McDannold et al. som visade att denna gasblandning i kombination med den specifika typen av deras mikrobubblor var problematisk52, har vi inte observerat anmärkningsvärda problem med denna typ av mikrobubblor. Alternativt kan djuren bedövas med en blandning av ketamin/xyzin, som inte har några kända vasoaktiva effekter53.
Sammanfattningsvis har den bildstyrda BBB-öppningstekniken som beskrivs här använts för prekliniska läkemedelsutvärderingsstudier med hög volym som visade effektiviteten i det föreslagna arbetsflödet. Systemet skulle därmed kunna drivas av icke-teknisk personal efter en kort utbildning på grund av den höga graden av automatisering. Detta i kombination med installationens enkelhet resulterade i en hög grad av standardisering, vilket i sin tur säkerställer experimentell reproducerbarhet, minskad variation inom gruppen och därmed gör det möjligt att minska den önskade provstorleken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt finansierades av KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma och High-grade Glioma). Vi tackar Ilya Skachkov och Charles Mougenot för deras bidrag i utvecklingen av systemet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | Becton Dickinson | 309628 | Plastipak |
| 19 G needle | Terumo Agani | 8AN1938R1 | |
| 23 G needle | Terumo Agani | 8AN2316R1 | |
| 3M Transpore surgical tape | Science applied to life | 7000032707 | or similar |
| Arbitrary waveform generator | Siglent | n.a. | SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s |
| Automated stereotact | in-house built | n.a. | Stereotact with all elements were in-house built |
| Bruker In-Vivo Xtreme | Bruker | n.a. | Includes software |
| Buffered NaCl solution | B. Braun Melsungen AG | 220/12257974/110 | |
| Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK limitd | n.a. | 0.324 mg |
| Cage enrichment: paper-pulp smart home | Bio services | n.a. | |
| Carbon filter | Bickford | NC0111395 | Omnicon f/air |
| Ceramic spoon | n.a | n.a. | |
| Cotton swabs | n.a. | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Ethanol | VUmc pharmacy | n.a. | 70% |
| Evans Blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Fresenius NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | n.a. | NaCl 0.9 %, 1000 mL |
| Histoacryl | Braun Surgical | n.a. | Histoacryl 0.5 mL |
| Hydrophone | Precision Acoustics | n.a. | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 324825/324826 | 0.5 mL and 0.3 mL |
| Isoflurane | TEVA Pharmachemie BV | 8711218013196 | 250 mL |
| Ketamine | Alfasan | n.a. | 10 %, 10 mL |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | Envigo | 2918-11416M | |
| Neoflon catheter | Becton Dickinson | 391349 | 26 GA 0.6 x 19 mm |
| Oscilloscope | Keysight technologies | n.a. | InfiniiVision DSOX024A |
| Plastic tubes | Greiner bio-one | 210261 | 50 mL |
| Power amplifier | Electronics & Innovation Ltd | 210L | Model 210L |
| Preamplifier DC Coupler | Precision Acoustics | n.. | Serial number: DCPS94 |
| Scissors | Sigma Aldrich | S3146-1EA | or similar |
| Sedazine | AST Farma | n.a. | 2% |
| SonoVue microbubbles | Bracco | n.a. | 8 µl/ml |
| Sterile water | Fresenius Kabi | n.a. | 1000 mL |
| Syringe | n.a. | n.a. | various syringes can be used |
| Temgesic | Indivior UK limitd | n.a. | 0.3 mg/ml |
| Transducer | Precision Acoustics | n.a. | 1 MHz |
| Tweezers | Sigma Aldrich | F4142-1EA | or similar |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | 01-02 | Aquasonic 100 |
| Vidisic gel | Bausch + Lomb | n.a. | 10 g |
References
- Lipinski, C. A. Lead- and drug-like compounds: the rule-of-five revolution. Drug Discovery Today: Technologies. 1 (4), 337-341 (2004).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
- Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
- Meng, Y., et al. Safety and efficacy of focused ultrasound induced blood-brain barrier opening, an integrative review of animal and human studies. Journal of Controlled Release. 309, 25-36 (2019).
- Darrow, D. P. Focused Ultrasound for Neuromodulation. Neurotherapeutics. 16 (1), 88-99 (2019).
- Zhou, Y. F. High intensity focused ultrasound in clinical tumor ablation. World Journal of Clinical Oncology. 2 (1), 8-27 (2011).
- O'Reilly, M. A., Hough, O., Hynynen, K. Blood-Brain Barrier Closure Time After Controlled Ultrasound-Induced Opening Is Independent of Opening Volume. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (3), 475-483 (2017).
- Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
- Dasgupta, A., et al. Ultrasound-mediated drug delivery to the brain: principles, progress and prospects. Drug Discovery Today: Technologies. 20, 41-48 (2016).
- O'Reilly, M. A., Waspe, A. C., Chopra, R., Hynynen, K. MRI-guided disruption of the blood-brain barrier using transcranial focused ultrasound in a rat model. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Physics in Medicine & Biology. 51 (4), 793 (2006).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound and circulating preformed microbubbles appears to be characterized by the mechanical index. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (5), 834-840 (2008).
- Sun, T., et al. Closed-loop control of targeted ultrasound drug delivery across the blood-brain/tumor barriers in a rat glioma model. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (48), 10281-10290 (2017).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Carpentier, A., et al. Clinical trial of blood-brain barrier disruption by pulsed ultrasound. Science Translational Medicine. 8 (343), 342 (2016).
- Chopra, R., Curiel, L., Staruch, R., Morrison, L., Hynynen, K. An MRI-compatible system for focused ultrasound experiments in small animal models. Medical Physics. 36 (5), 1867-1874 (2009).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood–brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
- Larrat, B., et al. MR-guided transcranial brain HIFU in small animal models. Physics in Medicine & Biology. 55 (2), 365 (2009).
- Contag, C. H., Jenkins, D., Contag, P. R., Negrin, R. S. Use of reporter genes for optical measurements of neoplastic disease in vivo. Neoplasia. 2 (1-2), New York, NY. 41 (2000).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 33 (1), 95-104 (2007).
- Bing, C., et al. Trans-cranial opening of the blood-brain barrier in targeted regions using astereotaxic brain atlas and focused ultrasound energy. Journal of Therapeutic Ultrasound. 2 (1), 13 (2014).
- Marquet, F., et al. Real-time, transcranial monitoring of safe blood-brain barrier opening in non-human primates. PloS One. 9 (2), (2014).
- Anastasiadis, P., et al. characterization and evaluation of a laser-guided focused ultrasound system for preclinical investigations. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 36 (2019).
- Liu, H. L., Pan, C. H., Ting, C. Y., Hsiao, M. J. Opening of the blood-brain barrier by low-frequency (28-kHz) ultrasound: a novel pinhole-assisted mechanical scanning device. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (2), 325-335 (2010).
- Zhu, L., et al. Focused ultrasound-enabled brain tumor liquid biopsy. Scientific Reports. 8 (1), 1-9 (2018).
- Bader, K. B., Holland, C. K. Gauging the likelihood of stable cavitation from ultrasound contrast agents. Physics in Medicine & Biology. 58 (1), 127 (2012).
- Neppiras, E. Acoustic cavitation series: part one: Acoustic cavitation: an introduction. Ultrasonics. 22 (1), 25-28 (1984).
- Aryal, M., Arvanitis, C. D., Alexander, P. M., McDannold, N. Ultrasound-mediated blood-brain barrier disruption for targeted drug delivery in the central nervous system. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 94-109 (2014).
- Tung, Y. S., Choi, J. J., Baseri, B., Konofagou, E. E. Identifying the inertial cavitation threshold and skull effects in a vessel phantom using focused ultrasound and microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (5), 840-852 (2010).
- Arvanitis, C. D., Livingstone, M. S., Vykhodtseva, N., McDannold, N. Controlled ultrasound-induced blood-brain barrier disruption using passive acoustic emissions monitoring. PloS One. 7 (9), (2012).
- Tsai, C. H., Zhang, J. W., Liao, Y. Y., Liu, H. L. Real-time monitoring of focused ultrasound blood-brain barrier opening via subharmonic acoustic emission detection: implementation of confocal dual-frequency piezoelectric transducers. Physics in Medicine & Biology. 61 (7), 2926 (2016).
- Chen, W. S., Brayman, A. A., Matula, T. J., Crum, L. A. Inertial cavitation dose and hemolysis produced in vitro with or without Optison. Ultrasound in Medicine & Biology. 29 (5), 725-737 (2003).
- Qiu, Y., et al. The correlation between acoustic cavitation and sonoporation involved in ultrasound-mediated DNA transfection with polyethylenimine (PEI) in vitro. Journal of Controlled Release. 145 (1), 40-48 (2010).
- Sun, T., Jia, N., Zhang, D., Xu, D. Ambient pressure dependence of the ultra-harmonic response from contrast microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 131 (6), 4358-4364 (2012).
- Rehemtulla, A., et al. Rapid and quantitative assessment of cancer treatment response using in vivo bioluminescence imaging. Neoplasia. 2 (6), 491-495 (2000).
- Puaux, A. L., et al. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. International Journal of Molecular Imaging. 2011, (2011).
- Wu, S. K., et al. Characterization of different microbubbles in assisting focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Scientific Reports. 7, 46689 (2017).
- van den Broek, M. P., Groenendaal, F., Egberts, A. C., Rademaker, C. M. Effects of hypothermia on pharmacokinetics and pharmacodynamics. Clinical Pharmacokinetics. 49 (5), 277-294 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. Paxinos and Franklin's the mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic press. (2019).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 385, 385 (2015).
- Yao, L., Xue, X., Yu, P., Ni, Y., Chen, F. Evans blue dye: a revisit of its applications in biomedicine. Contrast Media & Molecular Imaging. 2018, (2018).
- Caretti, V., et al. Monitoring of tumor growth and post-irradiation recurrence in a diffuse intrinsic pontine glioma mouse model. Brain Pathology. 21 (4), 441-451 (2011).
- Yoshimura, J., Onda, K., Tanaka, R., Takahashi, H. Clinicopathological study of diffuse type brainstem gliomas: analysis of 40 autopsy cases. Neurologia Medico-Chirurgica. 43 (8), 375-382 (2003).
- Yang, F. Y., et al. Micro-SPECT/CT-based pharmacokinetic analysis of 99mTc-diethylenetriaminepentaacetic acid in rats with blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound. Journal of Nuclear Medicine. 52 (3), 478-484 (2011).
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science, Engineering & Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Greis, C. Technology overview: SonoVue. European Radiology. 14, Bracco, Milan. 11-15 (2004).
- Schneider, M. Characteristics of sonovue. Echocardiography. 16, 743-746 (1999).
- Talu, E., Powell, R. L., Longo, M. L., Dayton, P. A. Needle size and injection rate impact microbubble contrast agent population. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (7), 1182-1185 (2008).
- Pinton, G., et al. Attenuation, scattering, and absorption of ultrasound in the skull bone. Medical Physics. 39 (1), 299-307 (2012).
- Constantinides, C., Mean, R., Janssen, B. J. Effects of isoflurane anesthesia on the cardiovascular function of the C57BL/6 mouse. ILAR journal/National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 52, 21 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The effects of oxygen on ultrasound-induced blood-brain barrier disruption in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
