Summary
A barreira hemencefálica (BBB) pode ser temporariamente interrompida com ultrassom focado (ME) mediado por microbolhas. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para abertura BBB de alto rendimento in vivo usando um sistema de FUS modular acessível para especialistas em não-ultrassom.
Abstract
A barreira hemencefálica (BBB) tem sido um grande obstáculo para o tratamento de várias doenças cerebrais. As células endoteliais, conectadas por junções apertadas, formam uma barreira fisiológica impedindo que grandes moléculas (>500 Da) entrem no tecido cerebral. O ultrassom focado (FUS) mediado por microbolhas pode ser usado para induzir uma abertura de BBB local transitória, permitindo que drogas maiores entrem no parenchyma cerebral.
Além de dispositivos clínicos em larga escala para tradução clínica, a pesquisa pré-clínica para avaliação de resposta terapêutica de candidatos a medicamentos requer configurações dedicadas de ultrassom animal para abertura de BBB direcionada. De preferência, esses sistemas permitem fluxos de trabalho de alto rendimento com alta precisão espacial, bem como monitoramento integrado de cavitação, enquanto ainda são econômicos tanto no investimento inicial quanto nos custos de execução.
Aqui, apresentamos um sistema de FUS ANIMAL de pequeno animal bioluminescência e raios-X guiado que se baseia em componentes disponíveis comercialmente e preenche os requisitos acima mencionados. Uma ênfase particular foi colocada em um alto grau de automação facilitando os desafios tipicamente encontrados em estudos de avaliação de medicamentos pré-clínicos de alto volume. Exemplos desses desafios são a necessidade de padronização para garantir a reprodutibilidade de dados, reduzir a variabilidade intra-grupo, reduzir o tamanho da amostra e, assim, cumprir com os requisitos éticos e diminuir a carga de trabalho desnecessária. O sistema BBB proposto foi validado no âmbito da abertura do BBB facilitou testes de entrega de medicamentos em modelos de xenoenxerto derivados do paciente de glioblastoma multiforme e glioma médio difuso.
Introduction
A barreira hematoencefálica (BBB) é um grande obstáculo para a entrega de drogas no cérebro. A maioria das drogas terapêuticas desenvolvidas não atravessam o BBB devido aos seus parâmetros físico-químicos (por exemplo, lipoficidade, peso molecular, aceitadores de vínculos de hidrogênio e doadores) ou não são retidos devido à sua afinidade com transportadores efflux no cérebro1,2. O pequeno grupo de drogas que podem atravessar o BBB são tipicamente pequenas moléculas lipofílicas, que só são eficazes em um número limitado de doenças cerebrais1,2. Como consequência, para a maioria das doenças cerebrais, as opções de tratamento farmacológico são limitadas e novas estratégias de entrega de medicamentos são necessárias3,4.
O ultrassom terapêutico é uma técnica emergente que pode ser usada para diferentes aplicações neurológicas, como ruptura BBB (BBBD), neuromodulação e ablação4,5,6,7. Para conseguir uma abertura BBB com um emissor de ultrassom extracorpórea através do crânio, o ultrassom focado (FUS) é combinado com microbolhas. O MEC mediado por microconstrução resulta no aumento da biodisponibilidade de drogas no cérebro parenchyma5,8,9. Na presença de ondas sonoras, os microbolhas começam a oscilar iniciando a transcitose e a interrupção das junções apertadas entre as células endoteliais do BBB, permitindo o transporte paracelular de moléculas maiores10. Estudos anteriores confirmaram a correlação entre a intensidade da emissão acústica e o impacto biológico na abertura do BBB11,12,13,14. O FUS em combinação com microbolhas já tem sido utilizado em ensaios clínicos para o tratamento de glioblastoma usando temozolomide ou doxorubicina liposômica como agente quimioterápico, ou para terapia da doença de Alzheimer e esclerose lateral amiotrófica5,9,15,16.
Uma vez que a abertura do BBB mediado pelo ultrassom resulta em possibilidades totalmente novas para farmacoterapia, é necessária pesquisa pré-clínica para tradução clínica para avaliar a resposta terapêutica de candidatos a medicamentos selecionados. Isso normalmente requer um fluxo de trabalho de alto rendimento com precisão espacial elevada e, preferencialmente, uma detecção integrada de cavitação para monitoramento da abertura do BBB com uma alta reprodutibilidade. Se possível, esses sistemas precisam ser econômicos tanto no investimento inicial quanto nos custos de execução, para serem escaláveis de acordo com o tamanho do estudo. A maioria dos sistemas de FUS pré-clínicos são combinados com ressonância magnética para orientação de imagem e planejamento de tratamento15,17,18,19. Embora a ressonância magnética dê informações detalhadas sobre a anatomia e o volume do tumor, é uma técnica cara, que geralmente é realizada por operadores treinados/qualificados. Além disso, a ressonância magnética de alta resolução pode nem sempre estar disponível para pesquisadores em instalações pré-clínicas e requer longos tempos de varredura por animal, tornando-o menos adequado para estudos farmacológicos de alto rendimento. Destaca-se que, para pesquisas pré-clínicas no campo da neuro-oncologia, em especial modelos de tumores infiltrados, a possibilidade de visualizar e atingir o tumor é essencial para o sucesso do tratamento20. Atualmente, essa exigência só é cumprida por ressonância magnética ou por tumores transduzidos com fotoproteína, possibilitando visualização com bioluminescência de imagem (BLI) em combinação com a administração do substrato de fotoproteína.
Os sistemas de FUS guiados por ressonância magnética frequentemente usam um banho de água para garantir a propagação de ondas de ultrassom para aplicações transcranianas, em que a cabeça do animal está parcialmente submersa na água, os chamados sistemas ''bottom-up''15,17,18. Embora esses projetos funcionem geralmente bem em estudos em animais menores, eles são um compromisso entre os tempos de preparação animal, portabilidade e padrões higiênicos realisticamente mantidos durante o uso. Como alternativa à ressonância magnética, outros métodos de orientação para navegação estereotática abrangem o uso de um atlas anatômico de roedores21,22,23, ponteiro laser assistido ao avistamento visual24, dispositivo de varredura mecânica assistido por pinhole25, ou BLI26. A maioria desses desenhos são sistemas "de cima para baixo" em que o transdutor é colocado em cima da cabeça do animal, com o animal em uma posição natural. O fluxo de trabalho ''top-down'' consiste em um banho de água22,25,26 ou um cone cheio de água21,24. O benefício de usar um transdutor dentro de um cone fechado é a pegada mais compacta, menor tempo de configuração e possibilidades de descontaminação direta simplificando todo o fluxo de trabalho.
A interação do campo acústico com os microbolhas é dependente da pressão e varia de oscilações de baixa amplitude (chamada de cavitação estável) ao colapso transitório da bolha (referido como cavitação inercial)27,28. Há um consenso estabelecido de que o ultrassom-BBBD requer uma pressão acústica bem acima do limiar de cavitação estável para alcançar o sucesso do BBBD, mas abaixo do limiar de cavitação inercial, que geralmente está associado a danos vasculares/neuronais29. A forma mais comum de monitoramento e controle é a análise do (back-)sinal acústico disperso utilizando detecção passiva de cavitação (PCD), conforme sugerido por McDannold et al.12. O PCD baseia-se na análise dos espectros fourier de sinais de emissão de microbolhas, nos quais a força e o aparecimento de marcas de cavitação estáveis (harmônicas, subharmônicas e ultraharmônicas) e marcadores de cavitação inercial (resposta de banda larga) podem ser medidos em tempo real.
Uma análise de PCD "de um tamanho" para controle preciso de pressão é complicada devido à polidispersidade da formulação de microbolhas (a amplitude de oscilação depende fortemente do diâmetro da bolha), as diferenças nas propriedades da casca de bolha entre as marcas e a oscilação acústica, que depende fortemente da frequência e da pressão30,31,32. Como consequência, muitos protocolos diferentes de detecção de PCD foram sugeridos, que foram adaptados a combinações particulares de todos esses parâmetros e têm sido usados em vários cenários de aplicação (que vão desde experimentações in vitro sobre pequenos protocolos animais até PCD para uso clínico robusto) para detecção robusta de cavitação e até mesmo para controle retroativo de feedback da pressão11,14,30,31,32,33,34,35. O protocolo PCD empregado no escopo deste estudo é derivado diretamente de McDannold et al.12 e monitora a emissão harmônica para a presença de cavitação estável e ruído de banda larga para detecção inercial de cavitação.
Desenvolvemos um sistema de ME FUS de neuronavigção guiado por imagem para abertura transitória do BBB para aumentar a entrega de drogas no parênquim cerebral. O sistema é baseado em componentes disponíveis comercialmente e pode ser facilmente adaptado a diversas modalidades de imagem diferentes, dependendo das técnicas de imagem disponíveis na instalação animal. Como exigimos um fluxo de trabalho de alto rendimento, optamos por usar raio-X e BLI para orientação de imagem e planejamento de tratamento. As células tumorais transduzidas com uma fotoproteína (por exemplo, luciferase) são adequadas para a imagemBLI 20. Após a administração do substrato de fotoproteína, as células tumorais podem ser monitoradas in vivo e o crescimento e localização do tumor podem ser determinados20,36. A BLI é uma modalidade de imagem de baixo custo, permite acompanhar o crescimento do tumor ao longo do tempo, tem tempos de varredura rápidos e se correlaciona bem com o crescimento do tumor medido com ressonância magnética36,37. Optamos por substituir o banho de água por um cone cheio de água ligado ao transdutor para permitir flexibilidade para mover livremente a plataforma em que o roedor é montado8,24. O design é baseado em uma plataforma destacável equipada com integração de (I) marcadores fiduciais de plataforma estereustática (II) de pequena animal com máscara de compatibilidade de imagem x e óptica (III) de alta destastésia rápida e (IV) sistema de aquecimento animal regulado pela temperatura integrada. Após a indução inicial da anestesia, o animal é montado em uma posição precisa na plataforma onde permanece durante todo o procedimento. Consequentemente, toda a plataforma passa por todas as estações do fluxo de trabalho de toda a intervenção, mantendo um posicionamento preciso e reprodutível e anestesia sustentada. O software de controle permite a detecção automática dos marcadores fiduciais e registra automaticamente todos os tipos de imagens e modalidades de imagem (ou seja, micro-CT, raio-X, BLI e imagem de fluorescência) no quadro de referência da plataforma estereotática. Com a ajuda de um procedimento de calibração automática, a distância focal do transdutor de ultrassom é precisamente conhecida dentro, o que permite a fusão automática do planejamento intervencionista, entrega acústica e análise de imagem de acompanhamento. Como mostrado na Figura 1 e Figura 2,esta configuração fornece um alto grau de flexibilidade para projetar fluxos de trabalho experimentais dedicados e permite o manuseio intercalado do animal em diferentes estações, o que, por sua vez, facilita experimentos de alto rendimento. Usamos esta técnica para a entrega bem sucedida de drogas em xenoenxertos de rato de glioma de alto grau, como glioma midline difuso.
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Protocol
Todos os experimentos in vivo foram aprovados pelo comitê de ética holandês (número de licenças AVD114002017841) e pelo Corpo de Bem-Estar Animal da Vrije Universiteit Amsterdam, nos Países Baixos. Os investigadores foram treinados no básico do sistema de FUS, a fim de minimizar o desconforto dos animais.
1. Sistema de ultrassom focado
NOTA: A configuração descrita é um sistema de disrupção BBB construído em casa com base em componentes disponíveis comercialmente e inclui um cone personalizado impresso em 3D e uma plataforma estereotática destacável. O sistema é projetado modular, o que facilita modificações de acordo com equipamentos disponíveis e uso específico. O protocolo descreve o procedimento para a sonoporação de uma área maior na região pontina do cérebro do camundongo. Ajustando o local alvo, diferentes partes do cérebro podem ser alvo. Neste estudo foi utilizado um transdutor mono-elemento de 1 MHz com distância focal de 75 mm, abertura de 60 mm e área focal de 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM de pressão máxima). O plano focal do transdutor é posicionado através do crânio do animal no plano horizontal cruzando com as barras de ouvido.
- Selecione um transdutor apropriado para abertura BBB em roedores.
NOTA: Com base nas propriedades dos microbolhas e na frequência empregada, as configurações acústicas, em especial o índice mecânico (MI), estão sujeitas a alterações13,38. - Coloque o transdutor no cone impresso em 3D.
- Empregue uma membrana mylar acústicamente transparente na extremidade inferior do cone para obter o acoplamento acústico do caminho de propagação do feixe, e encha o cone com água desgassada.
- Monte o transdutor acima do animal em um estágio linear motorizado, como mostrado na Figura 1 permitindo o posicionamento vertical automático do transdutor.
- Projete uma plataforma estereotática destacável com base nos requisitos do estudo, que inclui aquecimento regulado pela temperatura, barras de mordida e ouvido, anestesia e marcadores fiduciais multi-modalidade, como mostrado na Figura 1 e Figura 2. A montagem da plataforma estereotática consiste em um sistema de estágio linear 2D, que permite um posicionamento automático preciso (< 0,1 mm) do animal sob o feixe.
- Conecte o transdutor à cadeia de emissão acústica mostrada na Figura 1, composta por um transdutor, um gerador de função e um amplificador de energia.
- Crie um pipeline de processamento de imagem para detectar os marcadores fiduciais multi-modalidade que permitem a sonoraporção precisa visando a área de interesse do cérebro e coleta dos dados de cavitação detectados pelo hidrofone da agulha.
- Calibrar o sistema e determinar o ponto de foco do transdutor em correspondência ao posicionamento vertical do animal na plataforma estereotática.
2. Preparação animal
NOTA: O seguinte protocolo é especificado para ratos, mas pode ser adaptado para ratos. Para esses experimentos, foram utilizados ratos nus atímicos foxn1-/- ratos (6-8 semanas de idade).
- Permita que o animal se aclimata por pelo menos uma semana na instalação animal e pese o animal regularmente.
- Administre a injeção de buprenorfina (0,05 mg/kg) através de injeção subcutânea (s.c.) 30 min antes do tratamento de FUS para iniciar o tratamento analgésico.
- Anestesiar o animal com 3% de isoflurane, 2 L/min O2 e verificar se o animal está profundamente anestesiado. Mantenha os animais anestesiados durante todo o procedimento e monitore a frequência respiratória e a frequência cardíaca para ajustar a concentração de isoflurane conforme necessário.
- Aplique pomada ocular para evitar olhos secos e evite possíveis lesões.
- Retire o cabelo na parte superior da cabeça com uma navalha e creme depilatório e lave depois com água para remover quaisquer resíduos para evitar irritação na pele.
- Para experimentos com modelos de tumor BLI, injete 150 μL de D-luciferin (30 mg/mL) intraperitoneal (i.p.) com uma seringa de insulina de 29 G para orientação de imagem BLI.
- Insira um cateter de veias traseiras de 26-30 G e lave o cateter e a veia com um pequeno volume de solução de heparina (5 UI/mL). Encha o cateter com solução de heparina para evitar a coagulação sanguínea.
NOTA: Um bom cateterismo é visto quando há um refluxo de sangue no cateter. Evite bolhas de ar no cateter para evitar embolias. Para evitar pressão excessiva de injeção, certifique-se de que o comprimento do cateter seja o mais curto possível. - Coloque o animal na plataforma estereotática regulada pela temperatura para evitar hipotermia.
NOTA: A hipotermia reduz a circulação sanguínea, o que pode afetar a injeção/circulação de microbolhas e a farmacocinética dos medicamentos39. - Imobilize e conserte a cabeça do animal na plataforma estereotática usando barras de ouvido e uma barra de mordida. Fixar o corpo com uma alça e amarrar a cauda do animal na plataforma.
3. Ultrassom focado em imagem in vivo
NOTA: Para este protocolo foi utilizado um transdutor mono-elemento de 1 MHz com pulso de explosão de tom com duração de 10 ms, um MI de 0,4 e uma frequência de repetição de pulso de 1,6 Hz com 40 ciclos para 240 s. O protocolo é otimizado para microbolhas estabilizadas por fosfolipídios contendo hexafluoreto de enxofre (SF6) como um gás inócuo, pelo qual o diâmetro médio da bolha é de 2,5 μm e mais de 90% das bolhas são menores que 8 μm.
- Coloque a plataforma estereotática com o animal montado na modalidade de imagem (porexemplo, BLI ou raio-X) e tire a imagem do animal.
- Use os marcadores fiduciais multi-modalidade em combinação com o pipeline de processamento de imagem para marcar a posição do animal de acordo com o ponto de foco do transdutor.
- Determine a área alvo colocando um contorno cerebral sobre a imagem de raio-X adquirida ou usando imagens BLI para determinar o centro do tumor (Figura 2). A posição de partes específicas do cérebro são especificadas no Paxinos Brain Atlas40 usando as marcas do crânio bregma e lambda como pontos de referência. Por exemplo, os pons estão localizados x=-1.0, y=-0,8 e z=-4,5 de lambda.
- Proteja as narinas e a boca do animal com fita adesiva para evitar que o gel de ultrassom interfira na respiração.
- Aplique gel de ultrassom em cima da cabeça do animal.
- Retraia a pele do pescoço dos animais, lubrifica o hidrofone da agulha com gel de ultrassom e coloca o hidrofone da agulha nas proximidades diretas do osso occipital.
- Guie o transdutor até a posição correta usando o pipeline de processamento de imagem e o ponto de foco.
- Aplique as configurações pré-configuradas em todos os dispositivos conectados e direja a região do cérebro de interesse.
NOTA: Dependendo da questão da pesquisa, as regiões tumorais ou cerebrais podem ser sonoporadas como um único ponto focal ou como forma volumosa, como mostrado na Figura 2. - Ative microcompletos conforme descrito pelo fabricante. Injete um bolus de 120 μL (5,4 μg) de microbolhas.
- Lave o cateter da veia da cauda com soro fisiológico para verificar a abertura do cateter.
- Injete os microbolhas e inicie a insstilação.
- Registo de microbolhas com o hidrofone da agulha.
- Administre um agente de contraste intravascular ou uma droga após a sonoporação. A dose, o tempo e o planejamento dependem da finalidade do estudo e da droga.
NOTA: O azul evans é um agente de cores comum para avaliar a abertura do BBB41. - Monitore o animal até o ponto de tempo predeterminado ou antes do ponto final humano.
4. Análise da cavitação de microbolhas
NOTA: Aqui está descrito o procedimento aplicado, que é adequado para experimentação in vivo para microbolhas SF6-fosfolipid com diâmetro médio de 2,5 μm (80% das bolhas abaixo de 8 μm) animado com um pulso de tom de explosão de 10 ms de duração em uma frequência de 1 MHz, como originalmente sugerido por McDannold et al.12.
- Transforme o sinal PCD gravado do domínio de tempo para o domínio de frequência.
- Integre a potência espectral resultante para detecção estável de cavitação em torno da harmônica2ª e3ª (± 50 kHz), como mostrado na Figura 3 (caixa verde a 2 e 3 MHz).
- Integre a potência espectral para detecção de cavitação inercial, entre a frequência principal, a2ª, a3ª harmônica, a1ª ea 2ª ultraarmônica e a primeira sub-harmônica (± 150 kHz), como mostrado na Figura 3 (caixas vermelhas).
- Integre a potência espectral em torno da frequência principal (1 MHz ± 50 kHz) para a normalização de ambos os sinais PCD obtidos anteriormente.
NOTA: O sinal PCD, para microbolhas SF6-fosfolipid in vivo experimentos a 1 MHz, não exibe ultraharmônicas ou subharmônicas antes que a cavitação inercial se instale, como mostrado na Figura 3.
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Representative Results
O sistema fus descrito (Figura 1 e Figura 2) e o fluxo de trabalho associado têm sido usados em mais de 100 animais e produziram dados reprodutíveis em camundongos saudáveis e tumores. Com base na cavitação registrada e na densidade espectral nos harmônicos no momento de pico da injeção de bolus de microbolhas, o poder espectral de cada frequência pode ser calculado utilizando-se a análise de Fourier, conforme explicado na etapa 4 do Protocolo. Com base no protocolo acústico (1 MHz, duração de pulso de 10 ms) com um MI de 0,4 em combinação com microbolhas, o espectro de energia integrado normalizado nos harmônicos2 e 3rd normalizou o espectro de energia integrado da frequência de excitação observado na Figura 3. Isso forneceu um meio muito sensível e confiável de detecção estável de cavitação, em comparação com nenhuma detecção de subharmônicos quando não foram injetados microbolhas ou a observação de cavitação inercial quando um MI de 0,6 foi aplicado. Em caso de cavitação inercial, foi detectado um aumento do piso de ruído de banda larga de até 25 dB, bem como o aparecimento de ultra-harmônicos e subharmônicos. Embora uma pressão acústica de um MI de 0,4 e 0,6 não resultou em danos macroscópicos, danos microscópicos foram evidenciados histologicamente em um MI de 0,6, como mostrado na Figura 4. Um aumento adicional da amplitude de pressão até um MI de 0,8 resultou em uma hemorragia cerebral macroscópica de vasos maiores e lise tecidual de ampla disseminação com a extravasação de eritrócitos. Os achados histológicos corresponderam aos dados acústicos do sensor de cavitação passiva, como mostra a Figura 3,confirmando as propriedades prejudiciais da cavitação inercial do tecido cerebral. Como consequência, um MI de 0,4 foi escolhido como a amplitude de pressão segura que proporcionou abertura de BBB muito reprodutível, ao mesmo tempo em que proporcionava uma margem segura ao regime de cavitação inercial, como observado antesdo dia 11.
O azul Evans intravenoso foi injetado para validar a abertura do BBB na região pontina. A forte ligação de albumina de Evans blue leva a uma grande molécula de mais de 66 kDa42. Ao nível dos pons e em parte do cerebelo, a extravasão de álbuns de Evans conjugados azul foi observada no rato tratado com FUS e microbolhas em contraste com o mouse sem microbolhas(Figura 5). Isso enfatiza o direcionamento preciso da região de interesse com base na navegação estereotática guiada por imagem com o sistema FUS de construção interna e o protocolo descrito.
Figura 1: Configuração de ultrassom focada.
(A) Representação esquemática do ultrassom focado. (B) Foto da configuração de ultrassom focalizando. O sistema consiste em um transdutor montado de cima para baixo em um estágio linear 1D sobre um segundo estágio 2D para posicionamento 3D automático. O transdutor é construído em um feixe cheio de água, fechado na parte inferior com uma membrana mylar acústicamente transparente, que conduz o som ao crânio do animal. O transdutor está conectado a um amplificador de energia, que por sua vez está conectado a um gerador arbitrário de forma de onda (AWG) para geração de sinal. Para detecção de cavitação é utilizado um hidrofone destacável em combinação com um amplificador de baixa tensão de ruído. O hidrofone é colocado nas proximidades diretas do osso occipital. O hidrofone externo tem uma superfície ativa de 2 mm e é acústico acoplado com gel de ultrassom. Tanto o sinal de alta tensão do pulso de excitação quanto o sinal de cavitação gravado são digitalizados por um osciloscópio padrão de 200 MHz e retransmitidos para um computador de controle (não mostrado) para processamento on-the-fly e controle em tempo real. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho de ultrassom focado.
O fluxo de trabalho proposto do sistema de ultrassom focado começa com (A) o posicionamento inicial do animal em uma plataforma estereotática destacável, note a aplicação do gel de acoplamento acústico (aplicado pós BLI/Raio-X). Simultaneamente, imagens multimodais podem ser conduzidas para direcionamento. (B) No primeiro raio-X a imagem é uma possibilidade, enquanto uma região de interesse pode ser alvo com a ajuda de um contorno do cérebro (que por sua vez é referenciado ao cérebro do camundongo atlas40,adaptado ao tamanho e postura do crânio). (C) Alternativamente, uma imagem bli de um tumor de glioma de linha média difusa transfetificada de luciferase pode ser aplicada para direcionamento. (D) Posteriormente, a plataforma estereotática é montada com o animal em posição terapêutica com hidrofone e transdutor ligados. O transdutor dirige automaticamente em posição terapêutica e sonica a trajetória escolhida após a injeção de bolus. O sistema é otimizado para experimentos de alto rendimento, pelo qual várias plataformas permitem trabalho intercalado, como mostrado no topo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Monitoramento de cavitação.
(A) Espectro de frequência de um experimento in vivo na ausência de administation de microbolhas a um MI de 0,4 a 1 MHz. (B) Mostrado é o espectro correspondente no pico do bolus após a injeção de microbolhas. Observe o aumento das harmônicas mais elevadas, o que é indicativo para cavitação estável das microbolhas. (C) Espectro correspondente observado em um MI mais alto de 0,6 em combinação com injeção de microbolhas, dentro da banda de transição para o início da cavitação inercial, levando a um aumento no piso de ruído até 25 dB e ao aparecimento de ultraharmônicas e subharmônicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Abertura do BBB e histologia associada.
(A) Cavitação estável usando um MI de 0,4 evidecia um parenchyma cerebral intacto tanto na macroscopia de luz branca quanto na microscopia manchada de HE. (B) Após um MI de 0,6 primeiros sinais de dano tecidual irreversível local do parênquim cerebral está se tornando aparente nos dados histológicos manchados pelo HE. (C) Para uma pressão mecânica ainda maior de MI 0,8, a hemorragia macroscópica é aparente, bem como a lise tecidual de ampla disseminação do parênquimo cerebral e a extravasação de eritrócitos devido à micromorrização. A tonalidade azul na macroscopia de luz branca é indicativa para a extravasão do agente de contraste intra-vascular co-injetado Evans azul indicando abertura BBB (ver Figura 5 para uma visão sagital). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Validação da abertura do BBB.
Demonstração de abertura de BBB bem sucedida no regime de cavitação estável (B) em comparação com o controle (A), sem microbolhas injetadas. Neste caso, Evans Blue tem sido usado como um agente de contraste intravascular. A forte ligação de albumina de Evans blue leva a uma grande molécula de mais de 66 kDa. Como consequência, a evidência da extravasão azul evans é indicativa para o transporte paracelular através do BBB devido a uma abertura (parcial) dos cruzamentos apertados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, desenvolvemos um sistema de FUS baseado em imagem econômico para interrupção transitória do BBB para o aumento da entrega de medicamentos no parênquim cerebral. O sistema foi construído em grande parte com componentes comercialmente disponíveis e em conjunto com raio-X e BLI. A modularidade do projeto proposto permite o uso de diversas modalidades de imagem para planejamento e avaliação em fluxos de trabalho de alto rendimento. O sistema pode ser combinado com modalidades de imagem 3D de alta resolução mais abrangentes, por exemplo, ressonância magnética ou microcsição de alta resolução, enquanto para a maior parte do estudo são utilizadas modalidades de imagem 2D como raio-X 2D e/ou BLI. Raios-X 2D e/ou BLI são consideravelmente mais econômicos, bem como ideais para estudos de alto volume devido aos seus respectivos curtos tempos de aquisição. O transdutor descrito aqui é adequado para produzir BBBD em áreas maiores (na escala de um cérebro de camundongo) em partes mais profundas do cérebro (f número de 1,25). Utilizamos o sistema para tumores de crescimento difuso na região pontina43,44. Para essas regiões é preciso um volume maior que abrange toda a região tumoral dos pons. O sistema modular pode ser facilmente ajustado para outros tipos de tumores cerebrais em partes mais supratentoriais do cérebro. Para decidir sobre o tipo de transdutor, deve-se levar em conta o número f, distância focal e frequência.
O projeto geral propõe, assim, dois refinamentos em comparação com projetos sugeridos anteriormente. (I) Frequentemente um banho de água é usado para transmissão de ondas de ultrassom de sistemas terapêuticos. Para aplicações transcranianas em animais de pequeno porte este tipo de desenho resulta em configurações maiores e invertidas, em que o animal está parcialmente submerso11,22,25. Embora esses projetos funcionem geralmente muito bem no escopo de estudos menores em animais, eles são um compromisso em relação aos tempos de configuração, portabilidade e padrões higiênicos realisticamente mantidos durante o uso. Em particular, este último é de considerável importância nos estudos de escopo que abrangem animais imunocomprometidos e, portanto, rigorosos padrões higiênicos. Como consequência, para projetar um sistema com uma pegada mais compacta, menor tempo de configuração, possibilidades fáceis de descontaminação e uma posição natural do animal durante todo o fluxo de trabalho, foi escolhido um design "de cima para baixo". (II) A segunda escolha de design que difere de vários projetos descritos anteriormente foi omitir a integração direta do sistema de entrega acústica em um sistema de imagem médica, como uma ressonância magnética ou uma micro-CT15,17,18,19,45. Embora sistemas totalmente integrados sejam ideais para estudos farmacocinéticos longitudinais ou pesquisas explorativas em um número limitado de animais, tais configurações são geralmente menos adequadas para estudos farmacológicos de alto volume devido a uma complexidade consideravelmente aumentada, altos custos de execução e necessidade de operadores treinados/qualificados. Além disso, esses sistemas são geralmente limitados a apenas uma modalidade de imagem. Como consequência, o projeto proposto aqui conta com uma plataforma estereotática destacável modular, que é compatível com várias modalidades de imagem (micro-CT, ressonância magnética de animais pequenos, uma variedade de câmeras BLI/fluorescência, estas com ou sem imagem de raio-X integrada) e fornece também marcadores fiduciais multimodais para fusão automática de todos os dados de imagem em um quadro comum de referência tanto para o planejamento intervencionista quanto para a abertura pós-BBB.
Com relação às considerações práticas, o ponto mais crítico de falha no procedimento é a estabilidade dos microbolhas devido à sua vida limitada e sua natureza frágil. Gostaríamos de enfatizar que a discussão a seguir diz respeito a microbolhas estabilizadas por fosfolipídios e contendo hexafluoreto de enxofre (SF6) como um gás inócuo46,47, enquanto outras formulações de microbolhas geralmente exibirão propriedades diferentes.
Tempo antes da injeção de microbolhas: A vida útil anunciada de microbolhas disponíveis comercialmente após a re-hidratação é entre 3 e 4 horas. Embora isso seja adequado para aplicações de ultrassom diagnóstico, deve-se notar que durante todo esse período os microbolhas perdem gás continuamente e, consequentemente, o diâmetro médio da bolha está sujeito a uma contínua deriva descendente do tamanho médio inicial de 2,5 μm. Para aplicações terapêuticas como o BBBD mediado por ultrassom, isso implica muito mais rigorosos imperativos de tempo, uma vez que a amplitude de oscilação da cavitação estável (a uma determinada frequência e pressão) e o início limiar da cavitação inercial são como consequência direta também sujeitos a uma deriva contínua. Em nossa experiência, observamos que os microbolhas são melhor utilizados dentro de 30 minutos após a reidratação, a fim de obter resultados reprodutíveis, semelhantes aos relatórios anteriores48.
Tempo após a injeção de microbolhas: Em primatas maiores, microbolhas SF6-fosfolipid disponíveis comercialmente exibem uma meia-vida de eliminação de plasma de sangue de cerca de 6 minutos e mais de 80% do gás administrado é exalado através dos pulmões após apenas 11 minutos48. Em pequenos mamíferos, como camundongos e ratos, a eliminação do plasma de sangue de meio-tempo deste tipo de microbolhas in vivo é com 90-120 segundos consideravelmente menor devido à maior frequência cardíaca20. Como consequência, a dinâmica rápida da concentração de microbolhas logo após a injeção de bolus e a rápida eliminação de plasma subsequente combinada com a perda contínua de volume de gás das bolhas impõe rigorosos requisitos de tempo no protocolo de sônica/injeção, a fim de obter resultados reprodutíveis na curta duração de 3-4 minutos após a injeção. Procedimentos mais longos ou volumes mais extensos de BBBD exigem preferencialmente uma administração contínua de microbolhas. No entanto, tal abordagem é complicada pela flutuação das bolhas tanto na seringa quanto no sistema de alimentação e também introduz um volume morto consideravelmente aumentado pela tubulação de infusão necessária. Em nossa experiência, a solução mais simples de dividir o volume total de injeção em subdoces menores de 2 a 3 menores proporcionou um resultado robusto e reprodutível.
Além disso, microbolhas são muito sensíveis à pressão e altas pressões hidrostáticas durante a injeção não são, portanto, recomendadas. Agulhas grandes (>19 G) são recomendadas para a transferência de microbolhas em um tubo plástico ou para elaborar microbolhas com uma seringa49. Para injeção de i.v. em camundongos são recomendadas agulhas de 26-30 G; uma vez que agulhas maiores são mais difíceis de inserir na veia da cauda. A agulha de 26 G é recomendada, uma vez que a pressão hidrostática é menor com esta agulha. No entanto, em caso de difícil acesso venoso, recomenda-se a agulha de 30 G.
O crânio do camundongo é um atenuante importante da amplitude de pressão que reduz significativamente a amplitude de pressão no foco. A atenuação é determinada pela frequência do transdutor e pela densidade do meio que a onda de ultrassom se propaga. Frequências de ultrassom mais altas e altas densidades teciduais, como osso resulta em alta atenuação. A amplitude de pressão é parcialmente absorvida pelo osso e alguma amplitude de pressão é perdida pelo reflexo e dispersãode 50. Em nossos experimentos determinamos em cadáveres de camundongos que a atenuação a 1 MHz é de 14,5 ± 1,3 dB/cm com uma espessura média do crânio de 0,9 mm, como mostrado antesde 21,50. O monitoramento da cavitação é altamente recomendado, uma vez que os microbolhas refletem emissões acústicas distintas durante a cavitação estável e cavitação inercial. A emissão de banda larga é uma emissão acústica distinta para cavitação inercial12. O monitoramento em tempo real permite detectar cavitação inercial e diminuir a amplitude de pressão de acordo para evitar danos teciduais.
Relatórios anteriores descreveram a influência do tipo de anestesia na permeabilidade do BBB alcançado11,31. Para anestesia à base de isoflurane, a vasodilatação ocorre logo após o início da anestesia, que está associada a uma ligeira redução do fluxo sanguíneo cerebral. Além disso, a anestesia ao longo de longas durações, em particular na ausência de estabilização de temperatura, leva a uma redução da frequência cardíaca. Uma vez que ambos os fatores podem potencialmente levar a uma maior variância da concentração cerebral de microbolhas ou medicamentos coadministrados, um protocolo de anestesia rigoroso é aconselhável para alcançar resultados reprodutíveis51. A anestesia com isoflurane de 1,5% v/v em 2 L/min de oxigênio por 35 a 45 minutos não foi problemática, como aconselhado por Constantinides et al.51. Em contraste com McDannold et al. que mostraram que essa mistura de gás em combinação com o tipo específico de seus microbolhas era problemática52, não observamos problemas notáveis com este tipo de microbolhas. Alternativamente, os animais podem ser anestesiados com uma mistura de cetamina/xilazina, que não tem efeitos vasoativos conhecidos53.
Em resumo, a técnica de abertura de BBB guiada por imagem descrita aqui tem sido utilizada para estudos de avaliação de medicamentos pré-clínicos de alto volume que demonstraram a eficiência do fluxo de trabalho sugerido. Assim, o sistema poderia ser operado por pessoal não técnico após um curto treinamento devido ao alto grau de automação. Isso em combinação com a simplicidade da configuração resultou em um alto grau de padronização, o que, por sua vez, garante a reprodutibilidade experimental, reduziu a variabilidade intra-grupo e, assim, permite reduzir o tamanho amostral necessário.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este projeto foi financiado pelo KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrínsic Pontine Glioma and High-grade Glioma). Agradecemos a Ilya Skachkov e Charles Mougenot por sua contribuição no desenvolvimento do sistema.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | Becton Dickinson | 309628 | Plastipak |
| 19 G needle | Terumo Agani | 8AN1938R1 | |
| 23 G needle | Terumo Agani | 8AN2316R1 | |
| 3M Transpore surgical tape | Science applied to life | 7000032707 | or similar |
| Arbitrary waveform generator | Siglent | n.a. | SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s |
| Automated stereotact | in-house built | n.a. | Stereotact with all elements were in-house built |
| Bruker In-Vivo Xtreme | Bruker | n.a. | Includes software |
| Buffered NaCl solution | B. Braun Melsungen AG | 220/12257974/110 | |
| Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK limitd | n.a. | 0.324 mg |
| Cage enrichment: paper-pulp smart home | Bio services | n.a. | |
| Carbon filter | Bickford | NC0111395 | Omnicon f/air |
| Ceramic spoon | n.a | n.a. | |
| Cotton swabs | n.a. | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Ethanol | VUmc pharmacy | n.a. | 70% |
| Evans Blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Fresenius NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | n.a. | NaCl 0.9 %, 1000 mL |
| Histoacryl | Braun Surgical | n.a. | Histoacryl 0.5 mL |
| Hydrophone | Precision Acoustics | n.a. | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 324825/324826 | 0.5 mL and 0.3 mL |
| Isoflurane | TEVA Pharmachemie BV | 8711218013196 | 250 mL |
| Ketamine | Alfasan | n.a. | 10 %, 10 mL |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | Envigo | 2918-11416M | |
| Neoflon catheter | Becton Dickinson | 391349 | 26 GA 0.6 x 19 mm |
| Oscilloscope | Keysight technologies | n.a. | InfiniiVision DSOX024A |
| Plastic tubes | Greiner bio-one | 210261 | 50 mL |
| Power amplifier | Electronics & Innovation Ltd | 210L | Model 210L |
| Preamplifier DC Coupler | Precision Acoustics | n.. | Serial number: DCPS94 |
| Scissors | Sigma Aldrich | S3146-1EA | or similar |
| Sedazine | AST Farma | n.a. | 2% |
| SonoVue microbubbles | Bracco | n.a. | 8 µl/ml |
| Sterile water | Fresenius Kabi | n.a. | 1000 mL |
| Syringe | n.a. | n.a. | various syringes can be used |
| Temgesic | Indivior UK limitd | n.a. | 0.3 mg/ml |
| Transducer | Precision Acoustics | n.a. | 1 MHz |
| Tweezers | Sigma Aldrich | F4142-1EA | or similar |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | 01-02 | Aquasonic 100 |
| Vidisic gel | Bausch + Lomb | n.a. | 10 g |
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