Summary
La barrera hematoencefálica (BBB) se puede interrumpir temporalmente con ultrasonido enfocado mediado por microburbujas (FUS). Aquí, describimos un protocolo paso a paso para la apertura de BBB de alto rendimiento in vivo utilizando un sistema FUS modular accesible para expertos que no son de ultrasonido.
Abstract
La barrera hematoencefálica (BBB) ha sido un obstáculo importante para el tratamiento de diversas enfermedades cerebrales. Las células endoteliales, conectadas por uniones estrechas, forman una barrera fisiológica que impide que moléculas grandes (>500 Da) entren en el tejido cerebral. El ultrasonido enfocado mediado por microburbujas (FUS) se puede utilizar para inducir una apertura local transitoria de BBB, permitiendo que fármacos más grandes entren en el parénquima cerebral.
Además de los dispositivos clínicos a gran escala para la traducción clínica, la investigación preclínica para la evaluación de la respuesta a la terapia de los candidatos a fármacos requiere configuraciones de ultrasonido de animales pequeños dedicados para la apertura de BBB dirigida. Preferiblemente, estos sistemas permiten flujos de trabajo de alto rendimiento con alta precisión espacial, así como monitoreo de cavitación integrado, al tiempo que siguen siendo rentables tanto en la inversión inicial como en los costos de funcionamiento.
Aquí, presentamos un sistema FUS de animales pequeños estereotáctico guiado por bioluminiscencia y rayos X que se basa en componentes disponibles comercialmente y cumple con los requisitos mencionados anteriormente. Se ha hecho especial hincapié en un alto grado de automatización que facilita los desafíos que suelen encontrarse en los estudios preclínicos de alto volumen de evaluación de fármacos. Ejemplos de estos desafíos son la necesidad de estandarización para garantizar la reproducibilidad de los datos, reducir la variabilidad dentro del grupo, reducir el tamaño de la muestra y, por lo tanto, cumplir con los requisitos éticos y disminuir la carga de trabajo innecesaria. El sistema BBB propuesto se ha validado en el alcance de los ensayos de administración de fármacos facilitados por la apertura de BBB en modelos de xenoinjerto derivados de pacientes de glioblastoma multiforme y glioma difuso de línea media.
Introduction
La barrera hematoencefálica (BBB) es un obstáculo importante para la entrega de fármacos en el parénquima cerebral. La mayoría de los fármacos terapéuticos que se han desarrollado no cruzan el BBB debido a sus parámetros fisicoquímicos (por ejemplo, lipofilia, peso molecular, aceptores de enlaces de hidrógeno y donantes) o no se retienen debido a su afinidad por los transportadores de eflujo en el cerebro1,2. El pequeño grupo de fármacos que pueden atravesar el BBB son típicamente pequeñas moléculas lipofílicas, que sólo son eficaces en un número limitado de enfermedades cerebrales1,2. Como consecuencia, para la mayoría de las enfermedades cerebrales, las opciones de tratamiento farmacológico son limitadas y se necesitan nuevas estrategias de administración de fármacos3,4.
El ultrasonido terapéutico es una técnica emergente que se puede utilizar para diferentes aplicaciones neurológicas como la interrupción de BBB (BBBD), la neuromodulación y la ablación4,5,6,7. Para lograr una apertura de BBB con un emisor de ultrasonido extracorpóreo a través del cráneo, el ultrasonido enfocado (FUS) se combina con microburbujas. Fus mediada por microburbujas resulta en un aumento de la biodisponibilidad de los fármacos en el parénquima cerebral5,8,9. En presencia de ondas sonoras, las microburbujas comienzan a oscilar iniciando la transcitosis y la interrupción de las uniones estrechas entre las células endoteliales del BBB, permitiendo el transporte paracelular de moléculas más grandes10. Estudios previos confirmaron la correlación entre la intensidad de la emisión acústica y el impacto biológico en la apertura BBB11,12,13,14. Fus en combinación con microburbujas ya se ha utilizado en ensayos clínicos para el tratamiento del glioblastoma utilizando temozolomida o doxorrubicina liposomal como agente quimioterapéutico, o para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica5,9,15,16.
Puesto que el ultrasonido medió los resultados de la abertura de BBB en las posibilidades enteramente nuevas para la farmacoterapia, la investigación preclínica para la traducción clínica es necesaria evaluar la respuesta de la terapia de candidatos seleccionados de la droga. Esto normalmente requiere un flujo de trabajo de alto rendimiento con alta precisión espacial y preferiblemente una detección de cavitación integrada para la supervisión de la apertura BBB dirigida con una alta reproducibilidad. Si es posible, estos sistemas deben ser rentables tanto en la inversión inicial como en los costos de funcionamiento para ser escalables de acuerdo con el tamaño del estudio. La mayoría de los sistemas fus preclínicos se combinan con mri para la imagen-dirección y la planificación del tratamiento15,17,18,19. Aunque la RMN proporciona información detallada sobre la anatomía y el volumen del tumor, es una técnica costosa, que generalmente es realizada por operadores capacitados /calificados. Además, la RMN de alta resolución puede no estar siempre disponible para los investigadores en instalaciones preclínicas y requiere largos tiempos de exploración por animal, lo que la hace menos adecuada para estudios farmacológicos de alto rendimiento. Cabe destacar que, para la investigación preclínica en el campo de la neurooncología, en particular los modelos tumorales infiltrativos, la posibilidad de visualizar y atacar el tumor es esencial para el éxito del tratamiento20. Actualmente, este requisito sólo se cumple por RMN o por tumores transducidos con una fotoproteína, lo que permite la visualización con imágenes de bioluminiscencia (BLI) en combinación con la administración del sustrato fotoproteico.
Los sistemas FUS guiados por RMN a menudo utilizan un baño de agua para asegurar la propagación de ondas de ultrasonido para aplicaciones transcraneales, mediante el cual la cabeza del animal está parcialmente sumergida en el agua, los llamados sistemas ''bottom-up''15,17,18. Si bien estos diseños funcionan generalmente bien en estudios con animales más pequeños, son un compromiso entre los tiempos de preparación de los animales, la portabilidad y los estándares higiénicos realistas y mantenibles durante el uso. Como alternativa a la RMN, otros métodos de guía para la navegación estereotáctica abarcan el uso de un atlas anatómico de roedores21,22, 23,avistamiento visual asistido por puntero láser24,dispositivo de escaneo mecánico asistido por agujero de alfiler25o BLI26. La mayoría de estos diseños son sistemas "de arriba hacia abajo" en los que el transductor se coloca en la parte superior de la cabeza del animal, con el animal en una posición natural. El flujo de trabajo ''de arriba hacia abajo'' consiste en un baño de agua22,25,26 o un cono lleno de agua21,24. La ventaja de usar un transductor dentro de un cono cerrado es la huella más compacta, el menor tiempo de configuración y las posibilidades de descontaminación directa que simplifican todo el flujo de trabajo.
La interacción del campo acústico con las microburbujas depende de la presión y va desde oscilaciones de baja amplitud (denominadas cavitación estable) hasta colapso transitorio de burbujas (denominada cavitación inercial)27,28. Existe un consenso establecido de que la ECOGRAFÍA-BBBD requiere una presión acústica muy por encima del umbral de cavitación estable para lograr una BBBD exitosa, pero por debajo del umbral de cavitación inercial, que generalmente se asocia con daño vascular/neuronal29. La forma más común de monitoreo y control es el análisis de la señal acústica (retro)dispersada utilizando la detección pasiva de cavitación (PCD), como sugieren McDannold et al.12. Pcd se basa en el análisis de los espectros de Fourier de señales de emisión de microburbujas, en el que la fuerza y la apariencia de los sellos de cavitación estables (armónicos, subharmonics y ultraharmonics) y los marcadores de cavitación inercial (respuesta de banda ancha) se pueden medir en tiempo real.
Un análisis pcd de "talla única" para un control preciso de la presión es complicado debido a la polidispersidad de la formulación de microburbujas (la amplitud de la oscilación depende fuertemente del diámetro de la burbuja), las diferencias en las propiedades de la cáscara de la burbuja entre las marcas y la oscilación acústica, que depende fuertemente de la frecuencia y la presión30,31,32. Como consecuencia, se han sugerido muchos protocolos diferentes de detección de PCD, que se han adaptado a combinaciones particulares de todos estos parámetros y se han utilizado en varios escenarios de aplicación (que van desde la experimentación in vitro sobre protocolos de pequeños animales hasta PCD para uso clínico) para la detección de cavitación robusta e incluso para el control de retroalimentación retroactiva de la presión11,14,30,31,32,33,34,35. El protocolo PCD empleado en el alcance de este estudio se deriva directamente de McDannold et al.12 y monitorea la emisión armónica para la presencia de cavitación estable y ruido de banda ancha para la detección de cavitación inercial.
Hemos desarrollado un sistema de FUS de neuronavegación guiada por imágenes para la apertura transitoria del BBB para aumentar la entrega de fármacos en el parénquima cerebral. El sistema se basa en componentes disponibles comercialmente y se puede adaptar fácilmente a varias modalidades de imágenes diferentes, dependiendo de las técnicas de imagen disponibles en la instalación animal. Dado que requerimos un flujo de trabajo de alto rendimiento, hemos optado por utilizar rayos X y BLI para la orientación por imágenes y la planificación del tratamiento. Las células tumorales transducidas con una fotoproteína (por ejemplo, luciferasa) son adecuadas para la obtención de imágenesBLI 20. Después de la administración del sustrato de fotoproteínas, las células tumorales pueden ser monitoreadas in vivo y el crecimiento y la ubicación del tumor se pueden determinar20,36. BLI es una modalidad de imagen de bajo costo, permite seguir el crecimiento del tumor a lo largo del tiempo, tiene tiempos de exploración rápidos y se correlaciona bien con el crecimiento tumoral medido con MRI36,37. Hemos optado por sustituir el baño de agua por un cono lleno de agua unido al transductor para permitir flexibilidad para mover libremente la plataforma sobre la que está montado el roedor8,24. El diseño se basa en una plataforma desmontable equipada con la integración de (I) plataforma estereotáctica de animales pequeños (II) marcadores fiduciales con rayos X y compatibilidad de imágenes ópticas (III) máscara de anestesia desmontable rápida, y (IV) sistema integrado de calentamiento de animales regulados por temperatura. Después de la inducción inicial de la anestesia, el animal se monta en una posición precisa en la plataforma donde permanece durante todo el procedimiento. En consecuencia, toda la plataforma pasa por todas las estaciones del flujo de trabajo de toda la intervención, manteniendo un posicionamiento preciso y reproducible y anestesia sostenida. El software de control permite la detección automática de los marcadores fiduciales y registra automáticamente todo tipo de imágenes y modalidades de imagen (es decir, micro-CT, rayos X, BLI e imágenes de fluorescencia) en el marco de referencia de la plataforma estereotáctica. Con la ayuda de un procedimiento de calibración automática, la distancia focal del transductor de ultrasonido se conoce con precisión dentro, lo que permite la fusión automática de la planificación intervencionista, la entrega acústica y el análisis de imágenes de seguimiento. Como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2,esta configuración proporciona un alto grado de flexibilidad para diseñar flujos de trabajo experimentales dedicados y permite el manejo intercalado del animal en diferentes estaciones, lo que a su vez facilita los experimentos de alto rendimiento. Hemos utilizado esta técnica para la entrega acertada de la droga en xenografts del ratón de la glioma de alto grado tal como glioma difuso del midline.
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Protocol
Todos los experimentos in vivo fueron aprobados por el comité ético holandés (número de permiso de licencia AVD114002017841) y el Organismo de Bienestar Animal de la Vrije Universiteit Amsterdam, Países Bajos. Los investigadores fueron entrenados en los fundamentos del sistema FUS con el fin de minimizar las molestias de los animales.
1. Sistema de ultrasonido enfocado
NOTA: La configuración descrita es un sistema de interrupción BBB construido en casa basado en componentes disponibles comercialmente e incluye un cono hecho a medida impreso en 3D y una plataforma estereotáctica desmontable. El sistema está diseñado de forma modular, lo que facilita las modificaciones según el equipamiento disponible y el uso específico. El protocolo describe el procedimiento para el sonoporation de un área más grande en la región del pontine del cerebro del ratón. Al ajustar la ubicación objetivo, se podrían atacar diferentes partes del cerebro. En este estudio se utilizó un transductor monoelemento de 1 MHz con una distancia focal de 75 mm, una apertura de 60 mm y un área focal de 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM de presión pico). El plano focal del transductor se coloca a través del cráneo del animal en el plano horizontal que se cruza con las barras de los oídos.
- Seleccione un transductor apropiado para la apertura de BBB en roedores.
NOTA: Sobre la base de las propiedades de las microburbujas y la frecuencia empleada, los ajustes acústicos, en particular el índice mecánico (MI), están sujetos a cambios13,38. - Coloque el transductor en el cono impreso en 3D.
- Emplear una membrana de mylar acústicamente transparente en el extremo inferior del cono para lograr el acoplamiento acústico de la ruta de propagación del haz, y llenar el cono con agua desgastada.
- Monte el transductor por encima del animal en una etapa lineal motorizada como se muestra en la Figura 1 permitiendo el posicionamiento vertical automático del transductor.
- Diseñar una plataforma estereotáctica desmontable basada en los requerimientos del estudio, que incluya calentamiento regulado por temperatura, mordeduras y barras auriculares, anestesia y marcadores fiduciales multimodales, como se muestra en las Figuras 1 y 2. El montaje de la plataforma estereotáctica consiste en un sistema de etapa lineal 2D, que permite el posicionamiento automático preciso (< 0,1 mm) del animal bajo la viga.
- Conecte el transductor a la cadena de emisión acústica que se muestra en la Figura 1 que consiste en un transductor, un generador de funciones y un amplificador de potencia.
- Diseñe una tubería de procesamiento de imágenes para detectar los marcadores fiduciales multimodales que permiten la focalización precisa de la sonoporación del área cerebral de interés y la recopilación de los datos de cavitación detectados por el hidrófono de la aguja.
- Calibrar el sistema y determinar el punto de enfoque del transductor en correspondencia con el posicionamiento vertical del animal en la plataforma estereotáctica.
2. Preparación animal
NOTA: El siguiente protocolo se especifica para ratones, pero se puede adaptar para ratas. Para estos experimentos se utilizaron ratones desnudos atímicos femeninos Foxn1-/- (6-8 semanas de edad).
- Deje que el animal se aclimate durante al menos una semana en la instalación animal y pesar al animal regularmente.
- Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) mediante inyección subcutánea (s.c.) 30 min antes del tratamiento con FUS para iniciar el tratamiento analgésico.
- Anestesiar al animal con isoflurano al 3%, 2 L/minO2 y verificar que el animal esté profundamente anestesiado. Mantenga a los animales anestesiados durante todo el procedimiento y controle la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca para ajustar la concentración de isoflurano según sea necesario.
- Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad de los ojos y evitar posibles lesiones.
- Retire el vello en la parte superior de la cabeza con una maquinilla de afeitar y crema depilatoria y lave después con agua para eliminar cualquier residuo y evitar la irritación de la piel.
- Para experimentos con modelos de tumores BLI, inyecte 150 μL de D-luciferina (30 mg/mL) intraperitoneal (i.p.) con una jeringa de insulina de 29 G para la guía de imágenes de BLI.
- Inserte un catéter de 26-30 G en la vena de la cola y enjuague el catéter y la vena con un pequeño volumen de solución de heparina (5 UI/mL). Llene el catéter con una solución de heparina para evitar la coagulación de la sangre.
NOTA: Se observa un buen cateterismo cuando hay un reflujo de sangre en el catéter. Evite las burbujas de aire en el catéter para prevenir los émbolos. Para evitar una presión de inyección excesiva, asegúrese de que la longitud del catéter sea lo más corta posible. - Coloque al animal en la plataforma estereotáctica regulada por temperatura para evitar la hipotermia.
NOTA: La hipotermia reduce la circulación sanguínea, lo que puede afectar la inyección/circulación de microburbujas y la farmacocinética de los fármacos39. - Inmovilizar y fijar la cabeza del animal en la plataforma estereotáctica usando barras para los oídos y una barra de mordida. Fijar el cuerpo con una correa y pegar la cola del animal a la plataforma.
3. Ultrasonido enfocado guiado por imágenes in vivo
NOTA: Para este protocolo se utilizó un transductor monoelemento de 1 MHz con un pulso de ráfaga de tono con una duración de 10 ms, un MI de 0,4 y una frecuencia de repetición de pulsos de 1,6 Hz con 40 ciclos para 240 s. El protocolo está optimizado para microburbujas estabilizadas por fosfolípidos que contienen hexafluoruro de azufre (SF6)como gas inocuo, por lo que el diámetro medio de la burbuja es de 2,5 μm y más del 90% de las burbujas son inferiores a 8 μm.
- Coloque la plataforma estereotáctica con el animal montado en la modalidad de imagen (porejemplo, BLI o rayos X) y tome imágenes del animal.
- Utilice los marcadores fiduciales multimodales en combinación con la tubería de procesamiento de imágenes para marcar la posición del animal de acuerdo con el punto de enfoque del transductor.
- Determinar el área objetivo colocando un contorno cerebral sobre la imagen de rayos X adquirida o utilizando imágenes BLI para determinar el centro del tumor (Figura 2). La posición de partes específicas del cerebro se especifican en el Paxinos Brain Atlas40 utilizando las marcas del cráneo bregma y lambda como puntos de referencia. Por ejemplo el puente de Varolio se encuentra x=-1.0, y=-0.8 y z=-4.5 de lambda.
- Proteja las fosas nasales y la boca del animal con cinta adhesiva para evitar que el gel de ultrasonido interfiera con la respiración.
- Aplique gel de ultrasonido en la parte superior de la cabeza del animal.
- Retraer la piel del cuello de los animales, lubricar el hidrófono de la aguja con gel de ultrasonido y colocar el hidrófono de la aguja en las inmediaciones del hueso occipital.
- Guíe el transductor a la posición correcta utilizando la tubería de procesamiento de imágenes y el punto de enfoque.
- Aplique la configuración preconfigurada a todos los dispositivos conectados y diríjase a la región cerebral de interés.
NOTA: Dependiendo de la pregunta de investigación, las regiones tumorales o cerebrales pueden ser sonoporadas como un único punto focal o como forma volumétrica, como se muestra en la Figura 2. - Active las microburbujas según lo descrito por el fabricante. Inyecte un bolo de 120 μL (5,4 μg) de microburbujas.
- Enjuague el catéter de la vena de la cola con solución salina para verificar la apertura del catéter.
- Inyecte las microburbujas e inicie la insonación.
- Registre la cavitación de microburbujas con el hidrófono de la aguja.
- Administrar un agente de contraste intravascular o fármaco después de la sonoporación. La dosis, el momento y la planificación dependen del propósito del estudio y del fármaco.
NOTA: El azul de Evans es un agente de color común para evaluar la apertura de BBB41. - Supervise al animal hasta el punto de tiempo predeterminado o antes del punto final humano.
4. Análisis de cavitación de microburbujas
NOTA: Aquí se describe el procedimiento aplicado, quees adecuado para la experimentación in vivo para microburbujas de sf 6-fosfolípidos con un diámetro promedio de 2,5 μm (80% de las burbujas por debajo de 8 μm) excitado con un pulso de tono de ráfaga de 10 ms de duración a una frecuencia de 1 MHz, como se sugirió originalmente por McDannold et al.12.
- Fourier-transforme la señal PCD grabada del dominio del tiempo en el dominio de la frecuencia.
- Integrar la potencia espectral resultante para la detección de cavitación estable alrededor del2º y3º armónico (± 50 kHz), como se muestra en la Figura 3 (caja verde a 2 y 3 MHz).
- Integrar la potencia espectral para la detección de cavitación inercial, entre la frecuencia principal, el2º,3º armónico, el1º y2º ultraarmónico y el primer sub-armónico (± 150 kHz), como se muestra en la Figura 3 (cajas rojas).
- Integrar la potencia espectral alrededor de la frecuencia principal (1 MHz ± 50 kHz) para la normalización de ambas señales PCD previamente obtenidas.
NOTA: La señal PCD, para experimentos in vivo de microburbujas de fosfolípidos SF6a 1 MHz, no muestra ultraarmónicos o subarmónicos antes de que se establezca la cavitación inercial, como se muestra en la Figura 3.
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Representative Results
El sistema FUS descrito(Figura 1 y Figura 2)y el flujo de trabajo asociado se han utilizado en más de 100 animales y han producido datos reproducibles en ratones sanos y osos. Sobre la base de la cavitación registrada y la densidad espectral en los armónicos en el momento pico de la inyección en bolo de microburbujas, la potencia espectral de cada frecuencia se puede calcular utilizando el análisis de Fourier como se explica en el paso 4 del Protocolo. Basado en el protocolo acústico (1 MHz, 10 ms de duración del pulso) con un IM de 0,4 en combinación con microburbujas, el espectro de potencia integrado normalizado en los armónicos2º y3º normalizó el espectro de potencia integrado de la frecuencia de excitación observada en la Figura 3. Esto proporcionó un medio muy sensible y confiable de detección de cavitación estable, en comparación con ninguna detección de subharmonics cuando no se inyectaron microburbujas o la observación de cavitación inercial cuando se aplicó un IM de 0,6. En caso de cavitación inercial, se detectó un aumento del piso de ruido de banda ancha de hasta 25 dB, así como la aparición de ultra armónicos y subharmonics. A pesar de que una presión acústica de un IM de 0,4 y 0,6 no resultó en ningún daño macroscópico, el daño microscópico se evidenció histológicamente en un IM de 0,6, como se muestra en la Figura 4. Otro aumento de la amplitud de la presión hasta un MI de 0,8 dio lugar a una hemorragia de cerebro macroscópica de recipientes más grandes y a una lisis diseminada del tejido con la extravasación de eritrocitos. Los hallazgos histológicos correspondieron a los datos acústicos del sensor de cavitación pasiva, como se muestra en la Figura 3,confirmando las propiedades dañinas de la cavitación inercial del tejido cerebral. Como consecuencia, se eligió un IM de 0,4 como amplitud de presión segura que proporcionaba una apertura BBB muy reproducible, a la vez que proporcionaba un margen seguro al régimen de cavitación inercial, como se observaba antes de11.
El azul intravenoso de Evans fue inyectado para validar la abertura del BBB en la región del pontine. La fuerte unión a la albúmina del azul de Evans conduce a una molécula grande de más de 66 kDa42. A nivel del puente de Varolio y en parte del cerebelo, se observó extravasación de albúmina conjugada azul de Evans en el ratón tratado con FUS y microburbujas en contraste con el ratón sin microburbujas(Figura 5). Esto enfatiza la focalización precisa de la región de interés basada en la navegación estereotáctica guiada por imágenes con el sistema FUS de construcción interna y el protocolo descrito.
Figura 1: Configuración de ultrasonido enfocado.
(A)Representación esquemática de la configuración de ultrasonido focalizado. (B) Imagen de la configuración de ultrasonido enfocado. El sistema consiste en un transductor montado de arriba hacia abajo en una etapa lineal 1D sobre una segunda etapa 2D para el posicionamiento 3D automático. El transductor está construido en un cono de viga lleno de agua, cerrado en la parte inferior con una membrana mylar acústicamente transparente, que conduce el sonido al cráneo del animal. El transductor está conectado a un amplificador de potencia, que a su vez está conectado a un generador de forma de onda arbitraria (AWG) para la generación de señales. Para la detección de cavitación se utiliza un hidrófono desmontable en combinación con un amplificador de voltaje de bajo ruido. El hidrófono se coloca en las proximidades directas del hueso occipital. El hidrófono externo tiene una superficie activa de 2 mm y está acoplado acústicamente con gel de ultrasonido. Tanto la señal de alto voltaje del pulso de excitación como la señal de cavitación grabada son digitalizadas por un osciloscopio estándar de 200 MHz y retransmitidas a una computadora de control (no mostrada) para el procesamiento sobre la marcha y el control en tiempo real. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Flujo de trabajo de ultrasonido enfocado.
El flujo de trabajo propuesto del sistema de ultrasonido enfocado comienza con(A)el posicionamiento inicial del animal en una plataforma estereotáctica desmontable, tenga en cuenta la aplicación del gel de acoplamiento acústico (post BLI / rayoS X aplicado). Simultáneamente, se pueden realizar imágenes multimodales para la focalización. (B)Al principio, las imágenes de rayos X son una posibilidad, mientras que una región de interés puede ser dirigida con la ayuda de un contorno del cerebro (que a su vez se hace referencia al atlas cerebral del ratón40,adaptado al tamaño y la postura del cráneo). (C) Alternativamente, una imagen de BLI de un tumor difuso transfectado de luciferasa de glioma de la línea media superpuesto en una proyección de intensidad máxima de rayos X se puede aplicar para la orientación. (D) Posteriormente, la plataforma estereotáctica se monta con el animal en posición de terapia con hidrófono y transductor unidos. El transductor conduce automáticamente en la posición de la terapia y sonica la trayectoria elegida después de la inyección en bolo. El sistema está optimizado para experimentos de alto rendimiento, mediante los cuales múltiples plataformas permiten el trabajo intercalado, como se muestra en la parte superior. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Monitorización de cavitación.
(A)Espectro de frecuencias de un experimento in vivo en ausencia de administración de microburbujas a un IM de 0,4 a 1 MHz.(B)Se muestra el espectro correspondiente en el bolo de cresta después de la inyección de microburbujas. Nótese el aumento de los armónicos superiores, que es indicativo para la cavitación estable de las microburbujas. (C)Espectro correspondiente observado a un IM superior de 0,6 en combinación con la inyección de microburbujas, dentro de la banda de transición al inicio de la cavitación inercial, dando lugar a un aumento del suelo de ruido hasta 25 dB y a la aparición de ultraarmónicos y subarmónicos. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4: Apertura de BBB e histología asociada.
(a)La cavitación estable usando un MI de 0,4 evidenció una parenquimia intacta del cerebro en macroscopy de la luz blanca y él manchó microscopia. (b)Después de un MI de 0,6 primeras muestras del daño tisular irreversible local de la parenquimia del cerebro está llegando a ser evidente en él datos histológicos manchados. (C)Para una presión mecánica aún mayor de MI 0,8, la hemorragia macroscópica es evidente, así como la lisis tisular generalizada del parénquima cerebral y la extravasación de eritrocitos debido a la micromorrea. El tono azul en la macroscopia de luz blanca es indicativo para la extravasación del agente de contraste intra-vascular co-inyectado azul de Evans que indica la apertura de BBB (ver Figura 5 para una vista sagital). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5: Validación de la apertura de BBB.
Demostración de apertura exitosa de BBB en el régimen de cavitación estable(B)en comparación con el control(A),sin microburbujas inyectadas. En este caso el azul de Evans se ha utilizado como agente de contraste intravascular. La fuerte unión a la albúmina del azul de Evans conduce a una molécula grande de más de 66 kDa. Como consecuencia, la evidencia de la extravasación azul de Evans es indicativa para el transporte paracelular a través del BBB debido a una apertura (parcial) de las uniones apretadas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
En este estudio, desarrollamos un sistema fus basado guiado imagen rentable para la interrupción transitoria de BBB para la entrega creciente de la droga en la parenquimia del cerebro. El sistema fue construido en gran parte con componentes disponibles comercialmente y en conjunto con rayos X y BLI. La modularidad del diseño propuesto permite el uso de varias modalidades de imágenes para la planificación y evaluación en flujos de trabajo de alto rendimiento. El sistema se puede combinar con modalidades de imágenes 3D de alta resolución más completas, por ejemplo, MRI de alta resolución o micro-CT, mientras que para la mayor parte del estudio se utilizan modalidades de imágenes 2D como rayos X 2D y / o BLI. Los rayos X 2D y/o BLI son considerablemente más rentables, así como ideales para estudios de alto volumen debido a sus respectivos tiempos de adquisición cortos. El transductor descrito aquí es muy adecuado para producir BBBD en áreas más grandes (en la escala de un cerebro de ratón) en partes más profundas del cerebro (número f de 1,25). Hemos utilizado el sistema para los tumores difusamente crecientes en la región pontina43,44. Para estas regiones un volumen más grande necesita ser sonoporated que abarca la región entera del tumor en el puente de Varolio. El sistema modular se puede ajustar fácilmente para otros tipos de tumores cerebrales en partes más supratentoriales del cerebro. Para decidir sobre el tipo del transductor uno debe tener en cuenta el número f, la longitud focal y la frecuencia.
El diseño general propone de tal modo dos refinamientos comparados a los diseños previamente sugeridos. (I) Con frecuencia se utiliza un baño de agua para la transmisión de ondas de ultrasonido de sistemas terapéuticos. Para aplicaciones transcraneales en animales pequeños este tipo de diseño da como resultado configuraciones más grandes e invertidas, por lo que el animal está parcialmente sumergido11,22,25. Si bien estos diseños generalmente funcionan muy bien en el ámbito de los estudios en animales más pequeños, son un compromiso con respecto a los tiempos de configuración, la portabilidad y los estándares higiénicos realistas y fáciles de mantener durante el uso. En particular, este último es de considerable importancia en los estudios de alcance que abarcan animales inmunocomprometidos y, por lo tanto, normas higiénicas estrictas. Como consecuencia, para diseñar un sistema con una huella más compacta, un tiempo de configuración más corto, posibilidades de descontaminación fáciles y una posición natural del animal durante todo el flujo de trabajo, se eligió un diseño "de arriba hacia abajo". (II) La segunda opción de diseño que difiere de varios diseños descritos anteriormente fue omitir la integración directa del sistema de administración acústica en un sistema de imágenes médicas como una resonancia magnética o un micro-CT15,17,18,19,45. Si bien los sistemas totalmente integrados son ideales para estudios farmacocinéticos longitudinales o investigaciones exploratorias en un número limitado de animales, tales configuraciones son generalmente menos adecuadas para estudios farmacológicos de alto volumen debido a una complejidad considerablemente mayor, altos costos de funcionamiento y necesidad de operadores capacitados / calificados. Además, tales sistemas se limitan generalmente a solamente una modalidad de la proyección de imagen. Como consecuencia, el diseño propuesto aquí se basa en una plataforma estereotáctica desmontable modular, que es compatible con varias modalidades de imagen (micro-CT, RESONANCIA MAGNÉTICA de animales pequeños, una variedad de cámaras de BLI / fluorescencia, estas con o sin imágenes de rayos X integradas) y proporciona también marcadores fiduciales multimodales para la fusión automática de todos los datos de imagen en un marco de referencia común para la planificación intervencionista y la apertura de BBB posterior al seguimiento.
Con respecto a las consideraciones prácticas, el punto más crítico de falla en el procedimiento es la estabilidad de las microburbujas debido a su vida útil limitada y su naturaleza frágil. Nos gustaría destacar que la siguiente discusión se refiere a las microburbujas estabilizadas por fosfolípidos y que contienen hexafluoruro de azufre (SF6)como un gas inocuo46,47,mientras que otras formulaciones de microburbujas generalmente mostrarán diferentes propiedades.
Sincronización antes de la inyección de microburbujas: La vida útil anunciada de las microburbujas disponibles en el comercio después de la rehidratación es de entre 3 y 4 horas. Si bien esto es adecuado para aplicaciones de ultrasonido de diagnóstico, debe tenerse en cuenta que durante todo este período las microburbujas pierden gas continuamente y, en consecuencia, el diámetro medio de la burbuja está sujeto a una deriva continua hacia abajo desde el tamaño promedio inicial de 2,5 μm. Para aplicaciones terapéuticas como la BBBD mediada por ultrasonido, esto implica imperativos de sincronización mucho más estrictos, ya que la amplitud de oscilación de la cavitación estable (a una frecuencia y presión dadas) y el umbral de inicio de la cavitación inercial también están, como consecuencia directa, sujetos a una deriva continua. En nuestra experiencia, hemos observado que las microburbujas se utilizan mejor dentro de los 30 minutos posteriores a la rehidratación con el fin de obtener resultados reproducibles, similares a los informes anteriores48.
Sincronización después de la inyección de microburbujas: En primates más grandes,las microburbujas sf 6-fosfolípidos disponibles en el mercado muestran una vida media de eliminación de plasma sanguíneo de aproximadamente 6 minutos y más del 80% del gas administrado se exhala a través de los pulmones después de sólo 11 minutos48. En pequeños mamíferos como ratones y ratas la vida media de eliminación de plasma sanguíneo de este tipo de microburbujas in vivo es con 90-120 segundos considerablemente más corta debido a la mayor frecuencia cardíaca20. Como consecuencia, la dinámica rápida de la concentración de microburbujas directamente después de la inyección en bolo y la eliminación rápida del plasma posterior combinada con la pérdida continua del volumen de gas de las burbujas impone estrictos requisitos de tiempo en el protocolo de sonicación / inyección para obtener resultados reproducibles dentro de la corta duración de 3-4 minutos después de la inyección. Los procedimientos más largos o los volúmenes más extensos de BBBD requieren preferiblemente una administración continua de microburbujas. Sin embargo, tal acercamiento es complicado por la flotabilidad de las burbujas en la jeringuilla y el alimentar-sistema y también introduce un volumen muerto considerablemente creciente por la tubería requerida de la infusión. En nuestra experiencia, la solución más simple de dividir el volumen total de inyección en 2 a 3 subdos dosis más pequeñas proporcionó resultados robustos y reproducibles.
Además, las microburbujas son muy sensibles a la presión y, por lo tanto, no se recomiendan altas presiones hidrostáticas durante la inyección. Se recomiendan agujas grandes (>19 G) para la transferencia de microburbujas en un tubo de plástico o para dibujar microburbujas con una jeringa49. Para i.v. inyección en ratones se recomiendan agujas 26-30 G; ya que las agujas más grandes son más difíciles de insertar en la vena de la cola. Se recomienda la aguja de 26 G ya que la presión hidrostática es menor con esta aguja. Sin embargo, en caso de difícil acceso venoso se recomienda la aguja de 30 G.
El cráneo del ratón es un atenuador importante de la amplitud de presión que reduce significativamente la amplitud de presión en el foco. La atenuación está determinada por la frecuencia del transductor y la densidad del medio que propaga la onda de ultrasonido. Frecuencias de ultrasonido más altas y altas densidades de tejido, como el hueso, resulta en una alta atenuación. La amplitud de presión es parcialmente absorbida por el hueso y cierta amplitud de presión se pierde por reflexión y dispersión50. En nuestros experimentos hemos determinado en cadáveres de ratón que la atenuación a 1 MHz es de 14,5 ± 1,3 dB/cm con un espesor medio del cráneo de 0,9 mm como se muestra antesde 21,50. El monitoreo de cavitación es muy recomendable ya que las microburbujas reflejan distintas emisiones acústicas durante la cavitación estable y la cavitación inercial. La emisión de banda ancha es una emisión acústica distinta para la cavitación inercial12. La monitorización en tiempo real permite detectar la cavitación inercial y reducir la amplitud de presión en consecuencia para evitar daños tisulares.
Informes anteriores describieron la influencia del tipo de anestesia en la permeabilidad BBB alcanzada11,31. Para la anestesia basada en isoflurano, se produce una vasodilatación poco después del inicio de la anestesia, que se asocia con una ligera reducción del flujo sanguíneo cerebral. Además, la anestesia durante duraciones prolongadas, en particular en ausencia de una estabilización de la temperatura, conduce a una frecuencia cardíaca reducida. Dado que ambos factores pueden conducir potencialmente a una mayor varianza de la concentración cerebral tanto de microburbujas como de fármacos co-administrados, es aconsejable un estricto protocolo de anestesia para lograr resultados reproducibles51. La anestesia con isoflurano al 1,5% v/v en oxígeno de 2 L/min durante 35 a 45 minutos no fue problemática, como aconsejan Constantinides et al.51. En contraste con McDannold et al. que mostraron que esta mezcla de gases en combinación con el tipo específico de sus microburbujas era problemática52,no hemos observado problemas notables con este tipo de microburbujas. Alternativamente, los animales pueden ser anestesiados con una mezcla de ketamina/xilazina, que no tiene efectos vasoactivos conocidos53.
En resumen, la técnica de BBB-abertura proyección de imagen-dirigida descrita aquí se ha utilizado para los estudios preclínicos de alto volumen de la evaluación de la droga que demostraron la eficacia del flujo de trabajo sugerido. De este modo, el sistema podría ser operado por personal no técnico después de una breve capacitación debido al alto grado de automatización. Esto en combinación con la simplicidad de la configuración dio como resultado un alto grado de estandarización, que a su vez asegura la reproducibilidad experimental, la reducción de la variabilidad dentro del grupo y, por lo tanto, permite reducir el tamaño de la muestra requerida.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por el KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma and High-grade Glioma). Damos las gracias a Ilya Skachkov y Charles Mougenot por sus aportaciones al desarrollo del sistema.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | Becton Dickinson | 309628 | Plastipak |
| 19 G needle | Terumo Agani | 8AN1938R1 | |
| 23 G needle | Terumo Agani | 8AN2316R1 | |
| 3M Transpore surgical tape | Science applied to life | 7000032707 | or similar |
| Arbitrary waveform generator | Siglent | n.a. | SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s |
| Automated stereotact | in-house built | n.a. | Stereotact with all elements were in-house built |
| Bruker In-Vivo Xtreme | Bruker | n.a. | Includes software |
| Buffered NaCl solution | B. Braun Melsungen AG | 220/12257974/110 | |
| Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK limitd | n.a. | 0.324 mg |
| Cage enrichment: paper-pulp smart home | Bio services | n.a. | |
| Carbon filter | Bickford | NC0111395 | Omnicon f/air |
| Ceramic spoon | n.a | n.a. | |
| Cotton swabs | n.a. | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Ethanol | VUmc pharmacy | n.a. | 70% |
| Evans Blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Fresenius NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | n.a. | NaCl 0.9 %, 1000 mL |
| Histoacryl | Braun Surgical | n.a. | Histoacryl 0.5 mL |
| Hydrophone | Precision Acoustics | n.a. | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 324825/324826 | 0.5 mL and 0.3 mL |
| Isoflurane | TEVA Pharmachemie BV | 8711218013196 | 250 mL |
| Ketamine | Alfasan | n.a. | 10 %, 10 mL |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | Envigo | 2918-11416M | |
| Neoflon catheter | Becton Dickinson | 391349 | 26 GA 0.6 x 19 mm |
| Oscilloscope | Keysight technologies | n.a. | InfiniiVision DSOX024A |
| Plastic tubes | Greiner bio-one | 210261 | 50 mL |
| Power amplifier | Electronics & Innovation Ltd | 210L | Model 210L |
| Preamplifier DC Coupler | Precision Acoustics | n.. | Serial number: DCPS94 |
| Scissors | Sigma Aldrich | S3146-1EA | or similar |
| Sedazine | AST Farma | n.a. | 2% |
| SonoVue microbubbles | Bracco | n.a. | 8 µl/ml |
| Sterile water | Fresenius Kabi | n.a. | 1000 mL |
| Syringe | n.a. | n.a. | various syringes can be used |
| Temgesic | Indivior UK limitd | n.a. | 0.3 mg/ml |
| Transducer | Precision Acoustics | n.a. | 1 MHz |
| Tweezers | Sigma Aldrich | F4142-1EA | or similar |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | 01-02 | Aquasonic 100 |
| Vidisic gel | Bausch + Lomb | n.a. | 10 g |
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