Summary
La barrière hémato-encéphalique (BHE) peut être temporairement perturbée par des ultrasons focalisés médiés par microbulles (FUS). Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour l’ouverture BHE à haut débit in vivo à l’aide d’un système FUS modulaire accessible aux experts non-ultrasons.
Abstract
La barrière hémato-encéphalique (BHE) a été un obstacle majeur pour le traitement de diverses maladies du cerveau. Les cellules endothéliales, reliées par des jonctions serrées, forment une barrière physiologique empêchant les grosses molécules (>500 Da) de pénétrer dans le tissu cérébral. L’ultrason focalisé médié par microbulles (FUS) peut être employé pour induire une ouverture locale transitoire de BBB, permettant aux drogues plus grandes d’entrer dans le parenchyme de cerveau.
En plus des dispositifs cliniques à grande échelle pour l’application clinique, la recherche préclinique pour l’évaluation de la réponse au traitement des candidats médicaments nécessite des configurations d’échographie dédiées aux petits animaux pour l’ouverture ciblée de la BHE. De préférence, ces systèmes permettent des flux de travail à haut débit avec une précision spatiale élevée ainsi qu’une surveillance intégrée de la cavitation, tout en étant rentables en termes d’investissement initial et de coûts d’exploitation.
Ici, nous présentons un système FUS stéréotaxique de petit animal guidé par bioluminescence et par rayons X qui est basé sur des composants disponibles dans le commerce et répond aux exigences susmentionnées. Un accent particulier a été mis sur un degré élevé d’automatisation facilitant les défis généralement rencontrés dans les études précliniques d’évaluation des médicaments à volume élevé. Des exemples de ces défis sont la nécessité d’une normalisation afin d’assurer la reproductibilité des données, de réduire la variabilité intragroupe, de réduire la taille de l’échantillon et, par conséquent, de se conformer aux exigences éthiques et de réduire la charge de travail inutile. Le système BHE proposé a été validé dans le cadre d’essais d’administration de médicaments facilités par ouverture de BBB sur des modèles de xénogreffe dérivés du patient de glioblastome multiforme et de gliome diffus de midline.
Introduction
La barrière hémato-encéphalique (BHE) est un obstacle majeur à l’administration de médicaments dans le parenchyme cérébral. La plupart des médicaments thérapeutiques qui ont été développés ne franchissent pas la BHE en raison de leurs paramètres physico-chimiques (par exemple, lipphilie, poids moléculaire, accepteurs de liaison hydrogène et donneurs) ou ne sont pas conservés en raison de leur affinité pour les transporteurs d’efflux dans le cerveau1,2. Le petit groupe de médicaments qui peuvent traverser la BHE sont généralement de petites molécules lipophiles, qui ne sont efficaces que dans un nombre limité de maladies du cerveau1,2. En conséquence, pour la majorité des maladies du cerveau, les options de traitement pharmacologique sont limitées et de nouvelles stratégies d’administration de médicaments sont nécessaires3,4.
L’échographie thérapeutique est une technique émergente qui peut être utilisée pour différentes applications neurologiques telles que la perturbation de la BHE (BBBD), la neuromodulation et l’ablation4,5,6,7. Afin d’obtenir une ouverture BBB avec un émetteur ultrasonoreal extracorporeal à travers le crâne, ultrasons focalisés (FUS) est combiné avec des microbulles. Fus microbulles-négociés entraîne une biodisponibilité accrue des médicaments dans le parenchyme cérébral5,8,9. En présence d’ondes sonores, les microbulles commencent à osciller en initiant la transcytose et la perturbation des jonctions serrées entre les cellules endothéliales de la BHE, permettant le transport paracellulaire de molécules plus grosses10. Des études antérieures ont confirmé la corrélation entre l’intensité de l’émission acoustique et l’impact biologique sur l’ouverture BBB11,12,13,14. FUS en association avec des microbulles a déjà été utilisé dans des essais cliniques pour le traitement du glioblastome en utilisant le témozolomide ou la doxorubicine liposomale comme agent chimiothérapeutique, ou pour le traitement de la maladie d’Alzheimer et de la sclérose latérale amyotrophique5,9,15,16.
Puisque l’ouverture de BBB négociée par ultrasons a comme conséquence des possibilités entièrement nouvelles pour la pharmacothérapie, la recherche préclinique pour l’application clinique est nécessaire pour évaluer la réponse de thérapie des candidats médicamenteux sélectionnés. Cela nécessite généralement un flux de travail à haut débit avec une précision spatiale élevée et de préférence une détection de cavitation intégrée pour la surveillance de l’ouverture BHE ciblée avec une reproductibilité élevée. Si possible, ces systèmes doivent être rentables en termes d’investissement initial et de coûts d’exploitation afin d’être évolutifs en fonction de la taille de l’étude. La plupart des systèmes FUS précliniques sont combinés avec l’IRM pour le guidage d’image et la planification du traitement15,17,18,19. Bien que l’IRM donne des informations détaillées sur l’anatomie et le volume de la tumeur, il s’agit d’une technique coûteuse, qui est généralement effectuée par des opérateurs formés / qualifiés. De plus, l’IRM à haute résolution n’est pas toujours disponible pour les chercheurs dans les installations précliniques et nécessite de longs temps de balayage par animal, ce qui la rend moins adaptée aux études pharmacologiques à haut débit. Il convient de noter que, pour la recherche préclinique dans le domaine de la neuro-oncologie, en particulier les modèles tumoraux infiltrants, la possibilité de visualiser et de cibler la tumeur est essentielle pour la réussite du traitement20. Actuellement, cette exigence n’est remplie que par IRM ou par des tumeurs transduites avec une photoprotéine, permettant la visualisation avec imagerie par bioluminescence (BLI) en combinaison avec l’administration du substrat photoprotéique.
Les systèmes FUS guidés par IRM utilisent souvent un bain-marie pour assurer la propagation des ondes ultrasonores pour les applications transcrâniennes, par lequel la tête de l’animal est partiellement immergée dans l’eau, les systèmes dits « ascendants »15,17,18. Bien que ces conceptions fonctionnent généralement bien dans les études sur les petits animaux, elles constituent un compromis entre les temps de préparation des animaux, la portabilité et les normes d’hygiène réalistes et maintenables pendant l’utilisation. Comme alternative à l’IRM, d’autres méthodes de guidage pour la navigation stéréotaxique englobent l’utilisation d’un atlas anatomique de rongeur21,22, 23,d’une observation visuelle assistée par pointeur laser24,d’un dispositif de balayage mécanique assisté par sténopé25,ou D’un BLI26. La plupart de ces conceptions sont des systèmes « top-down » dans lesquels le transducteur est placé sur le dessus de la tête de l’animal, avec l’animal dans une position naturelle. Le flux de travail « descendant » consiste soit en un bain-marie22,25,26, soit en un cône rempli d’eau21,24. L’avantage d’utiliser un transducteur à l’intérieur d’un cône fermé est l’encombrement plus compact, le temps de configuration plus court et les possibilités de décontamination simples simplifiant l’ensemble du flux de travail.
L’interaction du champ acoustique avec les microbulles dépend de la pression et va des oscillations de faible amplitude (appelées cavitation stable) à l’effondrement transitoire des bulles (appelé cavitation inertielle)27,28. Il existe un consensus établi selon lequel l’échographie-BBBD nécessite une pression acoustique bien supérieure au seuil de cavitation stable pour obtenir une BBBD réussie, mais inférieure au seuil de cavitation inertielle, qui est généralement associé à des dommages vasculaires / neuronaux29. La forme la plus courante de surveillance et de contrôle est l’analyse du signal acoustique (rétro-)dispersé à l’aide de la détection de cavitation passive (PCD), comme le suggèrent McDannold et al.12. PCD s’appuie sur l’analyse des spectres de Fourier des signaux d’émission de microbulles, dans lesquels la force et l’apparence des caractéristiques de cavitation stables (harmoniques, sous-harmoniques et ultraharmoniques) et des marqueurs de cavitation inertielle (réponse à large bande) peuvent être mesurées en temps réel.
Une analyse PCD « taille unique » pour un contrôle précis de la pression est compliquée en raison de la polydispersité de la formulation de microbulles (l’amplitude d’oscillation dépend fortement du diamètre de la bulle), des différences dans les propriétés de la coque de la bulle entre les marques et de l’oscillation acoustique, qui dépend fortement de la fréquence et de la pression30,31,32. En conséquence, de nombreux protocoles de détection pcd différents ont été suggérés, qui ont été adaptés à des combinaisons particulières de tous ces paramètres et ont été utilisés dans divers scénarios d’application (allant de l’expérimentation in vitro sur des protocoles de petits animaux à PCD pour un usage clinique) pour la détection de cavitation robuste et même pour le contrôle rétroactif de rétroaction de la pression11,14,30, 31,32,33,34,35. Le protocole PCD utilisé dans la portée de cette étude est dérivé directement de McDannold et al.12 et surveille l’émission harmonique pour la présence d’une cavitation stable et d’un bruit à large bande pour la détection de la cavitation inertielle.
Nous avons développé un système FUS de neuronavigation guidé par l’image pour l’ouverture transitoire de la BHE afin d’augmenter l’administration de médicaments dans le parenchyme cérébral. Le système est basé sur des composants disponibles dans le commerce et peut être facilement adapté à plusieurs modalités d’imagerie différentes, en fonction des techniques d’imagerie disponibles dans l’installation pour animaux. Étant donné que nous avons besoin d’un flux de travail à haut débit, nous avons choisi d’utiliser les rayons X et le BLI pour le guidage d’image et la planification du traitement. Les cellules tumorales transduites avec une photoprotéine (par exemple, luciférase) conviennent à l’imagerie BLI20. Après l’administration du substrat photoprotéique, les cellules tumorales peuvent être surveillées in vivo et la croissance et l’emplacement de la tumeur peuvent êtredéterminés 20,36. BLI est une modalité d’imagerie à faible coût, il permet de suivre la croissance tumorale au fil du temps, il a des temps de balayage rapides et il est bien corrélé avec la croissance tumorale mesurée par IRM36,37. Nous avons choisi de remplacer le bain-marie par un cône rempli d’eau fixé au transducteur pour permettre la flexibilité de déplacer librement la plate-forme sur laquelle le rongeur est monté8,24. La conception est basée sur une plate-forme détachable équipée de l’intégration (I) de la plate-forme stéréotaxique des petits animaux (II) marqueurs fiduciaux avec compatibilité aux rayons X et à l’image optique (III) masque d’anesthésie rapide-détachable, et (IV) système de chauffage animal à température réglée intégrée. Après l’induction initiale de l’anesthésie, l’animal est monté dans une position précise sur la plate-forme où il reste pendant toute la procédure. Par conséquent, l’ensemble de la plate-forme passe toutes les stations du flux de travail de l’ensemble de l’intervention, tout en maintenant un positionnement précis et reproductible et une anesthésie soutenue. Le logiciel de contrôle permet la détection automatique des marqueurs fiduciaux et enregistre automatiquement tous les types d’images et de modalités d’image (c’est-à-dire micro-CT, rayons X, BLI et imagerie par fluorescence) dans le cadre de référence de la plate-forme stéréotaxique. À l’aide d’une procédure d’étalonnage automatique, la distance focale du transducteur à ultrasons est précisément connue à l’intérieur, ce qui permet la fusion automatique de la planification interventionnelle, de la livraison acoustique et de l’analyse d’imagerie de suivi. Comme le montrent les figures 1 et 2,cette configuration offre un degré élevé de flexibilité pour concevoir des flux de travail expérimentaux dédiés et permet une manipulation entrelacée de l’animal à différentes stations, ce qui facilite les expériences à haut débit. Nous avons employé cette technique pour la livraison réussie de drogue dans les xénogreffes de souris du glioma à haute teneur tel que le glioma diffus de midline.
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Protocol
Toutes les expériences in vivo ont été approuvées par le comité d’éthique néerlandais (numéro de permis avd114002017841) et l’organisme de protection des animaux de la Vrije Universiteit Amsterdam, aux Pays-Bas. Les enquêteurs ont été formés aux bases du système FUS afin de minimiser l’inconfort des animaux.
1. Système d’ultrasons focalisés
REMARQUE: La configuration décrite est un système de perturbation BBB construit en interne basé sur des composants disponibles dans le commerce et comprend un cône sur mesure imprimé en 3D et une plate-forme stéréotaxique détachable. Le système est conçu modulaire, ce qui facilite les modifications en fonction de l’équipement disponible et de l’utilisation spécifique. Le protocole décrit la procédure pour la sonoporation d’une plus grande zone dans la région pontine du cerveau de souris. En ajustant l’emplacement de la cible, différentes parties du cerveau pourraient être ciblées. Dans cette étude, un transducteur mono-élément de 1 MHz avec une distance focale de 75 mm, une ouverture de 60 mm et une zone focale de 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM de pression de crête) a été utilisé. Le plan focal du transducteur est positionné à travers le crâne de l’animal dans le plan horizontal se croisant avec les barres d’oreille.
- Sélectionnez un transducteur approprié pour l’ouverture de la BHE chez les rongeurs.
NOTE: Sur la base des propriétés des microbulles et de la fréquence employée, les réglages acoustiques, en particulier l’indice mécanique (MI), sont sujets à changement13,38. - Placez le transducteur dans le cône imprimé en 3D.
- Utilisez une membrane mylar acoustiquement transparente à l’extrémité inférieure du cône pour obtenir un couplage acoustique du chemin de propagation du faisceau et remplissez le cône d’eau dégazée.
- Monter le transducteur au-dessus de l’animal sur un étage linéaire motorisé comme le montre la figure 1 permettant un positionnement vertical automatique du transducteur.
- Concevoir une plate-forme stéréotaxique détachable basée sur les exigences de l’étude, qui comprend le chauffage à température régulée, les barres de morsure et d’oreille, l’anesthésie et les marqueurs fiduciaux multimodaux, comme le montrent les figures 1 et 2. Le montage de la plate-forme stéréotaxique consiste en un système de scène linéaire 2D, qui permet un positionnement automatique précis (< 0,1 mm) de l’animal sous le faisceau.
- Connectez le transducteur à la chaîne d’émission acoustique représentée sur la figure 1 constituée d’un transducteur, d’un générateur de fonctions et d’un amplificateur de puissance.
- Concevoir un pipeline de traitement d’image pour détecter les marqueurs fiduciaux multi-modalité qui permet un ciblage précis de sonoporation de la zone d’intérêt du cerveau et la collecte des données de cavitation détectées par l’hydrophone de l’aiguille.
- Calibrer le système et déterminer le point de focalisation du transducteur en correspondance avec le positionnement vertical de l’animal sur la plate-forme stéréotaxique.
2. Préparation des animaux
REMARQUE: Le protocole suivant est spécifié pour les souris, mais peut être adapté pour les rats. Pour ces expériences femelles athymiques nues Foxn1-/- souris (6-8 semaines) ont été utilisés.
- Permettre à l’animal de s’acclimater pendant au moins une semaine dans l’installation pour animaux et peser l’animal régulièrement.
- Administrer de la buprénorphine (0,05 mg/kg) par injection sous-cutanée (s.c.) 30 min avant le traitement FUS pour commencer le traitement analgésique.
- Anesthésier l’animal avec 3% d’isoflurane, 2 L/minO2 et vérifier que l’animal est profondément anesthésié. Gardez les animaux anesthésiés pendant toute la procédure et surveillez la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque pour ajuster la concentration d’isoflurane au besoin.
- Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse oculaire et éviter d’éventuelles blessures.
- Retirez les cheveux sur le dessus de la tête avec un rasoir et une crème dépilatoire et lavez ensuite à l’eau pour éliminer les résidus afin d’éviter toute irritation de la peau.
- Pour les expériences avec des modèles de tumeurs BLI, injecter 150 μL de D-luciférine (30 mg/mL) intrapéritonéale (i.p.) avec une seringue à insuline de 29 G pour le guidage de l’image BLI.
- Insérez un cathéter de veine caudale de 26 à 30 G et rincez le cathéter et la veine avec un petit volume de solution d’héparine (5 UI/mL). Remplissez le cathéter avec une solution d’héparine pour éviter la coagulation du sang.
REMARQUE: Un bon cathétérisme est observé lorsqu’il y a un reflux de sang dans le cathéter. Évitez les bulles d’air dans le cathéter pour prévenir les embolies. Pour éviter une pression d’injection excessive, assurez-vous que la longueur du cathéter est aussi courte que possible. - Placez l’animal sur la plate-forme stéréotaxique à température réglée pour éviter l’hypothermie.
REMARQUE: L’hypothermie réduit la circulation sanguine, ce qui peut affecter l’injection / circulation des microbulles et la pharmacocinétique des médicaments39. - Immobilisez et fixez la tête de l’animal sur la plate-forme stéréotaxique à l’aide de barres d’oreille et d’une barre de morsure. Fixez le corps avec une sangle et collez la queue de l’animal sur la plate-forme.
3. Ultrasons focalisés guidés par l’image in vivo
REMARQUE: Pour ce protocole, un transducteur mono-élément de 1 MHz avec une impulsion de rafale de tonalité avec une durée de 10 ms, un MI de 0,4 et une fréquence de répétition d’impulsion de 1,6 Hz avec 40 cycles pendant 240 s a été utilisé. Le protocole est optimisé pour les microbulles stabilisées par des phospholipides contenant de l’hexafluorure de soufre(SF6)comme gaz inoffensif, dont le diamètre moyen des bulles est de 2,5 μm et plus de 90% des bulles sont inférieures à 8 μm.
- Placez la plate-forme stéréotaxique avec l’animal monté dans la modalité d’imagerie (p. ex. BLI ou rayons X) et prenez la ou les images de l’animal.
- Utilisez les marqueurs fiduciaux multimodaux en combinaison avec le pipeline de traitement d’image pour marquer la position de l’animal en fonction du point de focalisation du transducteur.
- Déterminer la zone cible en plaçant un contour du cerveau sur l’image radiographique acquise ou en utilisant des images BLI pour déterminer le centre de la tumeur(Figure 2). La position de parties spécifiques du cerveau est spécifiée dans l’Atlas cérébral Paxinos40 en utilisant les marques du crâne bregma et lambda comme points de référence. Par exemple, le pont est situé x=-1.0, y=-0.8 et z=-4.5 de lambda.
- Protégez les narines et la bouche de l’animal avec du ruban adhésif pour éviter que le gel à ultrasons n’interfère avec la respiration.
- Appliquez du gel à ultrasons sur le dessus de la tête de l’animal.
- Rétractez la peau du cou des animaux, lubrifiez l’hydrophone de l’aiguille avec du gel à ultrasons et placez l’hydrophone de l’aiguille à proximité directe de l’os occipital.
- Guidez le transducteur à la bonne position à l’aide du pipeline de traitement d’image et du point de mise au point.
- Appliquez les paramètres préconfigurés à tous les périphériques connectés et ciblez la région du cerveau qui vous intéresse.
REMARQUE: Selon la question de recherche, les régions tumorales ou cérébrales peuvent être sonoporated comme un point focal unique ou comme forme volumétrique, comme le montre la figure 2. - Activer les microbulles comme décrit par le fabricant. Injecter un bolus de 120 μL (5,4 μg) de microbulles.
- Rincer le cathéter de la veine caudale avec une solution saline pour vérifier l’ouverture du cathéter.
- Injectez les microbulles et commencez l’insonation.
- Enregistrer la cavitation de microbulles avec l’hydrophone à aiguille.
- Administrer un agent de contraste intravasculaire ou un médicament après sonoporation. La dose, le moment et la planification dépendent de l’objectif de l’étude et du médicament.
REMARQUE: Evans bleu est un agent de couleur commun pour évaluer l’ouverture BBB41. - Surveiller l’animal jusqu’au point de temps prédéterminé ou avant le paramètre sans cruauté.
4. Analyse de la cavitation des microbulles
REMARQUE: Ici, la procédure appliquée est décrite, quiconvient à l’expérimentation in vivo pour les microbulles de SF 6-phospholipides d’un diamètre moyen de 2,5 μm (80% des bulles inférieures à 8 μm) excitées avec une impulsion de rafale de 10 ms à une fréquence de 1 MHz, comme suggéré à l’origine par McDannold et al.12.
- Fourier-transformer le signal PCD enregistré du domaine temporel dans le domaine fréquentiel.
- Intégrer la puissance spectrale résultante pour une détection de cavitation stable autour de la 2ème et3ème harmonique (± 50 kHz), comme le montre la figure 3 (boîte verte à 2 et 3 MHz).
- Intégrer la puissance spectrale pour la détection de cavitation inertielle, entre la fréquence principale, la 2ème,la3ème harmonique, la 1ème et 2ème ultraharmonique et la première sous-harmonique (± 150 kHz), comme le montre la figure 3 (boîtes rouges).
- Intégrer la puissance spectrale autour de la fréquence principale (1 MHz ± 50 kHz) pour la normalisation des deux signaux PCD précédemment obtenus.
REMARQUE: Le signal PCD, pour les microbulles SF6-phospholipidesin vivo à 1 MHz, n’affiche pas d’ultraharmonie ou de sous-harmonie avant que la cavitation inertielle ne s’installe, comme le montre la figure 3.
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Representative Results
Le système FUS décrit(figure 1 et figure 2)et le flux de travail associé ont été utilisés chez plus de 100 animaux et ont produit des données reproductibles sur des souris saines et porteuses de tumeurs. Sur la base de la cavitation enregistrée et de la densité spectrale aux harmoniques au moment de crête de l’injection de bolus de microbulle, la puissance spectrale de chaque fréquence peut être calculée à l’aide de l’analyse de Fourier comme expliqué à l’étape 4 du Protocole. Basé sur le protocole acoustique (1 MHz, durée d’impulsion de 10 ms) avec un MI de 0,4 en combinaison avec des microbulles, le spectre de puissance intégré normalisé aux harmoniques 2nd et 3rd a normalisé le spectre de puissance intégré de la fréquence d’excitation observée sur la figure 3. Cela a fourni un moyen très sensible et fiable de détection de cavitation stable, par rapport à l’absence de détection de sous-harmoniques lorsqu’aucune microbullisation n’a été injectée ou à l’observation d’une cavitation inertielle lorsqu’un MI de 0,6 a été appliqué. En cas de cavitation inertielle, un plancher de bruit à large bande accru allant jusqu’à 25 dB a été détecté ainsi que l’apparition d’ultra-harmoniques et de sous-harmoniques. Bien qu’une pression acoustique d’un MI de 0,4 et 0,6 n’ait entraîné aucun dommage macroscopique, des dommages microscopiques ont été démontrés histologiquement à un MI de 0,6, comme le montre la figure 4. Une autre augmentation de l’amplitude de pression jusqu’à un MI de 0,8 a eu comme conséquence une hémorragie macroscopique de cerveau de plus grands navires et de lysis large-répandu de tissu avec l’extravasation des érythrocytes. Les résultats histologiques correspondaient aux données acoustiques du capteur de cavitation passive, comme le montre la figure 3,confirmant les propriétés dommageables de la cavitation inertielle du tissu cérébral. En conséquence, un MI de 0,4 a été choisi comme amplitude de pression sûre qui fournissait une ouverture BBB très reproductible, tout en fournissant une marge de sécurité au régime de cavitation inertielle, comme observé avant11.
Le bleu intraveineux d’Evans a été injecté pour valider l’ouverture de la BHE dans la région de pontine. La forte liaison à l’albumine du bleu d’Evans conduit à une grosse molécule de plus de 66 kDa42. Au niveau du pont et en partie du cervelet, une extravasation de l’albumine conjuguée bleue d’Evans a été observée chez la souris traitée au FUS et à des microbulles contrairement à la souris sans microbulles (Figure 5). Cela met l’accent sur le ciblage précis de la région d’intérêt basé sur la navigation stéréotaxique guidée par l’image avec le système FUS de construction interne et le protocole décrit.
Figure 1 : Configuration des ultrasons focalisés.
(A) Représentation schématique de l’ultrason focalisé mis en place. (B) Image de la configuration des ultrasons focalisés. Le système se compose d’un transducteur monté de haut en bas sur un étage linéaire 1D sur un deuxième étage 2D pour un positionnement 3D automatique. Le transducteur est construit dans un cône de faisceau rempli d’eau, fermé au fond avec une membrane mylar acoustiquement transparente, qui conduit le son au crâne de l’animal. Le transducteur est connecté à un amplificateur de puissance, qui est à son tour connecté à un générateur de forme d’onde arbitraire (AWG) pour la génération de signaux. Pour la détection de cavitation, un hydrophone détachable en combinaison avec un amplificateur de tension à faible bruit est utilisé. L’hydrophone est placé à proximité directe de l’os occipital. L’hydrophone externe a une surface active de 2 mm et est couplé acoustiquement avec du gel à ultrasons. Le signal haute tension de l’impulsion d’excitation ainsi que le signal de cavitation enregistré sont numérisés par un oscilloscope standard de 200 MHz et relayés à un ordinateur de contrôle (non représenté) pour le traitement à la volée et le contrôle en temps réel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Flux de travail des ultrasons focalisés.
Le flux de travail proposé du système d’échographie focalisée commence par(A)le positionnement initial de l’animal sur une plate-forme stéréotaxique détachable, notez l’application du gel de couplage acoustique (appliqué post BLI / rayons X). Simultanément, l’imagerie multimodale peut être effectuée pour le ciblage. (B) Au début, l’imagerie par rayons X est une possibilité, alors qu’une région d’intérêt peut être ciblée à l’aide d’un contour du cerveau (qui à son tour est référencé à l’atlas cérébral de la souris40, adapté à la taille et à la posture du crâne). (C) Alternativement, une image BLI d’une tumeur diffuse transfectée de glioma de midline de luciferase superposée sur une projection d’intensité maximale de rayon X peut être appliquée pour le ciblage. (D) Par la suite, la plate-forme stéréotaxique est montée avec l’animal en position thérapeutique avec hydrophone et transducteur attachés. Le transducteur entraîne automatiquement en position thérapeutique et sonique la trajectoire choisie après l’injection de bolus. Le système est optimisé pour les expériences à haut débit, dans lesquelles plusieurs plates-formes permettent un travail entrelacé, comme indiqué en haut. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Surveillance de la cavitation.
(A) Spectre de fréquences d’une expérience in vivo en l’absence d’administration de microbulles à un MI de 0,4 à 1 MHz. (B) On voit le spectre correspondant au bolus de crête après injection de microbulles. Notez l’augmentation des harmoniques plus élevées, ce qui est indicatif pour une cavitation stable des microbulles. (C) Spectre correspondant observé à un MI plus élevé de 0,6 en combinaison avec l’injection de microbulles, dans la bande de transition jusqu’au début de la cavitation inertielle, conduisant à une augmentation du bruit de fond jusqu’à 25 dB et à l’apparition d’ultraharmoniques et de sous-harmoniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 4 : Ouverture de la BHE et histologie associée.
(A) La cavitation stable utilisant un MI de 0,4 a démontré un parenchyme intact de cerveau dans la lumière blanche macroscopy et IL a souillé la microscopie. (B) Après un MI de 0,6 premiers signes de lésions tissulaires irréversibles locales du parenchyme cérébral devient apparent dans les données histologiques he souillées. (C) Pour une pression mécanique encore plus élevée de MI 0,8, une hémorragie macroscopique est apparente ainsi qu’une lyse tissulaire étendue du parenchyme cérébral et l’extravasation des érythrocytes due à une micro-hémorragie. La teinte bleue dans la macroscopie de lumière blanche est indicative de l’extravasation de l’agent de contraste intra-vasculaire co-injecté Evans bleu indiquant une ouverture BHE (voir la figure 5 pour une vue sagittale). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Validation de l’ouverture BBB.
Démonstration d’une ouverture BBB réussie dans le régime de cavitation stable(B)par rapport au contrôle(A),pas de microbulles injectées. Dans ce cas-ci, le bleu d’Evans a été utilisé comme agent de contraste intravasculaire. La forte liaison à l’albumine du bleu d’Evans conduit à une grosse molécule de plus de 66 kDa. En conséquence, les preuves de l’extravasation bleue d’Evans sont indicatives pour le transport paracellulaire à travers la BHE en raison d’une ouverture (partielle) des jonctions serrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, nous avons développé un système FUS basé sur une image guidée rentable pour la perturbation transitoire de la BHE pour une administration accrue de médicaments dans le parenchyme cérébral. Le système a été en grande partie construit avec des composants disponibles dans le commerce et en conjonction avec les rayons X et BLI. La modularité de la conception proposée permet l’utilisation de plusieurs modalités d’imagerie pour la planification et l’évaluation dans les flux de travail à haut débit. Le système peut être combiné avec des modalités d’imagerie 3D à haute résolution plus complètes, par exemple l’IRM à haute résolution ou la micro-TDM, tandis que pour la majeure partie de l’étude, des modalités d’imagerie 2D telles que les rayons X 2D et / ou le BLI sont utilisées. Les rayons X 2D et/ou le BLI sont tous deux considérablement plus rentables et idéaux pour les études à volume élevé en raison de leurs temps d’acquisition courts respectifs. Le transducteur décrit ici est bien adapté pour produire du BBBD dans des zones plus grandes (à l’échelle d’un cerveau de souris) dans des parties plus profondes du cerveau (nombre f de 1,25). Nous avons utilisé le système pour les tumeurs en croissance diffuse dans la région pontine43,44. Pour ces régions un plus grand volume doit être sonoporated qui englobe la région entière de tumeur dans le pont. Le système modulaire peut facilement être ajusté pour d’autres types de tumeurs cérébrales dans des parties plus supratentoriales du cerveau. Afin de décider du type de transducteur, il faut tenir compte du nombre f, de la distance focale et de la fréquence.
La conception globale propose ainsi deux améliorations par rapport aux conceptions suggérées précédemment. (I) Fréquemment, un bain-marie est utilisé pour la transmission par ondes ultrasonores des systèmes thérapeutiques. Pour les applications transcrânienne chez les petits animaux, ce type de conception se traduit par des configurations plus grandes et inversées, par lesquelles l’animal est partiellement submergé11,22,25. Bien que ces conceptions fonctionnent généralement très bien dans le cadre d’études sur les petits animaux, elles constituent un compromis en ce qui concerne les temps d’installation, la portabilité et les normes d’hygiène réalistes et maintenables pendant l’utilisation. En particulier, ce dernier est d’une importance considérable dans la portée des études englobant les animaux immunodéprimés et donc des normes d’hygiène strictes. En conséquence, afin de concevoir un système avec un encombrement plus compact, un temps de configuration plus court, des possibilités de décontamination faciles et une position naturelle de l’animal pendant tout le flux de travail, une conception « descendante » a été choisie. (II) Le deuxième choix de conception qui diffère de plusieurs conceptions précédemment décrites était d’omettre l’intégration directe du système d’administration acoustique dans un système d’imagerie médicale tel qu’une IRM ou un micro-CT15,17,18,19,45. Alors que les systèmes entièrement intégrés sont idéaux pour les études pharmacocinétiques longitudinales ou la recherche explorative sur un nombre limité d’animaux, de telles configurations sont généralement moins adaptées aux études pharmacologiques à volume élevé en raison de la complexité considérablement accrue, des coûts de fonctionnement élevés et du besoin d’opérateurs formés / qualifiés. En outre, de tels systèmes sont généralement limités à une seule modalité d’imagerie. En conséquence, la conception proposée ici s’appuie sur une plate-forme stéréotaxique modulaire détachable, qui est compatible avec plusieurs modalités d’imagerie (micro-CT, IRM pour petits animaux, une variété de caméras BLI / fluorescence, avec ou sans imagerie par rayons X intégrée) et fournit également des marqueurs fiduciaux multi-modalité pour la fusion automatique de toutes les données d’image dans un cadre de référence commun pour la planification interventionnelle et le suivi après l’ouverture BBB.
En ce qui concerne les considérations pratiques, le point d’échec le plus critique de la procédure est la stabilité des microbulles en raison de leur durée de vie limitée et de leur nature fragile. Nous tenons à souligner que la discussion qui suit concerne les microbulles stabilisées par des phospholipides et contenant de l’hexafluorure de soufre(SF6)comme gaz inoffensif46,47,alors que d’autres formulations de microbulles présenteront généralement des propriétés différentes.
Moment avant l’injection de microbulles: La durée de vie annoncée des microbulles disponibles dans le commerce après réhydratation est comprise entre 3 et 4 heures. Bien que cela convienne aux applications d’ultrasons diagnostiques, il convient de noter que pendant toute cette période, les microbulles perdent continuellement du gaz et que, par conséquent, le diamètre moyen de la bulle est soumis à une dérive continue vers le bas par rapport à la taille moyenne initiale de 2,5 μm. Pour les applications thérapeutiques telles que la BBBD médiée par ultrasons, cela implique des impératifs de synchronisation beaucoup plus stricts, car l’amplitude d’oscillation de la cavitation stable (à une fréquence et une pression données) et le seuil d’apparition de la cavitation inertielle sont en conséquence directe également soumis à une dérive continue. D’après notre expérience, nous avons observé qu’il est préférable d’utiliser les microbulles dans les 30 minutes suivant la réhydratation afin d’obtenir des résultats reproductibles, à l’instar des rapports précédents48.
Moment après l’injection de microbulles: Chez les grands primates, les microbulles sf6-phospholipidesdisponibles dans le commerce présentent une demi-vie d’élimination du plasma sanguin d’environ 6 minutes et plus de 80% du gaz administré est expiré via les poumons après seulement 11 minutes48. Chez les petits mammifères tels que les souris et les rats, la demi-vie d’élimination du plasma sanguin de ce type de microbulles in vivo est 90-120 secondes considérablement plus courte en raison de la fréquence cardiaque plus élevée20. En conséquence, la dynamique rapide de la concentration de microbulles directement après l’injection de bolus et l’élimination plasmatique ultérieure rapide combinée à la perte continue de volume de gaz des bulles impose des exigences de synchronisation strictes sur le protocole de sonication / injection afin d’obtenir des résultats reproductibles dans le court laps de temps de 3-4 minutes après l’injection. Des procédures plus longues ou des volumes plus importants de BBBD nécessitent de préférence une administration continue de microbulles. Cependant, une telle approche est compliquée par la flottabilité des bulles à la fois dans la seringue et le système d’alimentation et introduit également un volume mort considérablement accru par le tube de perfusion requis. D’après notre expérience, la solution plus simple consistant à diviser le volume total d’injection en 2 à 3 sous-doses plus petites a fourni des résultats robustes et reproductibles.
De plus, les microbulles sont très sensibles à la pression et des pressions hydrostatiques élevées lors de l’injection ne sont donc pas recommandées. De grandes aiguilles (>19 G) sont recommandées pour le transfert de microbulles dans un tube en plastique ou pour l’aspiration de microbulles avec une seringue49. Pour l’injection i.v. chez la souris 26-30 aiguilles G sont recommandées; puisque les aiguilles plus grosses sont plus difficiles à insérer dans la veine de la queue. L’aiguille de 26 G est recommandée car la pression hydrostatique est plus faible avec cette aiguille. Cependant, en cas d’accès veineux difficile, l’aiguille de 30 G est recommandée.
Le crâne de la souris est un atténuateur important de l’amplitude de la pression qui abaisse considérablement l’amplitude de la pression au foyer. L’atténuation est déterminée par la fréquence du transducteur et la densité du milieu que l’onde ultrasonore propage. Des fréquences ultrasonores plus élevées et des densités tissulaires élevées, comme les résultats osseux, entraînent une atténuation élevée. L’amplitude de pression est partiellement absorbée par l’os et une certaine amplitude de pression est perdue par réflexion et diffusion50. Dans nos expériences, nous avons déterminé dans les cadavres de souris que l’atténuation à 1 MHz est de 14,5 ± 1,3 dB / cm avec une épaisseur moyenne du crâne de 0,9 mm comme indiqué avant21,50. La surveillance de la cavitation est fortement recommandée car les microbulles reflètent des émissions acoustiques distinctes pendant la cavitation stable et la cavitation inertielle. L’émission à large bande est une émission acoustique distincte pour la cavitationinertielle 12. La surveillance en temps réel permet de détecter la cavitation inertielle et d’abaisser l’amplitude de la pression en conséquence pour éviter les lésions tissulaires.
Les rapports précédents ont décrit l’influence du type d’anesthésie sur la perméabilité BHE obtenue11,31. Pour l’anesthésie à base d’isoflurane, une vasodilatation se produit peu de temps après le déclenchement de l’anesthésie, ce qui est associé à une légère réduction du flux sanguin cérébral. Par ailleurs, l’anesthésie sur des durées prolongées, notamment en l’absence de stabilisation de la température, conduit à une baisse de la fréquence cardiaque. Étant donné que les deux facteurs peuvent potentiellement conduire à une plus grande variance de la concentration cérébrale des microbulles ou des médicaments co-administrés, un protocole d’anesthésie strict est conseillé pour obtenir des résultats reproductibles51. L’anesthésie avec 1,5% v/v d’isoflurane dans 2 L/min d’oxygène pendant 35 à 45 minutes n’était pas problématique, comme conseillé par Constantinides et al.51. Contrairement à McDannold et al. qui ont montré que ce mélange de gaz en combinaison avec le type spécifique de leurs microbulles était problématique52, nous n’avons pas observé de problèmes notables avec ce type de microbulles. Alternativement, les animaux peuvent être anesthésiés avec un mélange de kétamine / xylazine, qui n’a pas d’effets vasoactifs connus53.
En résumé, la technique d’ouverture BHE guidée par imagerie décrite ici a été utilisée pour les études précliniques d’évaluation des médicaments à volume élevé qui ont démontré l’efficacité du flux de travail suggéré. Le système pourrait ainsi être exploité par du personnel non technique après une courte formation en raison du degré élevé d’automatisation. Ceci, combiné à la simplicité de la configuration, a entraîné un degré élevé de normalisation, ce qui garantit la reproductibilité expérimentale, réduit la variabilité intra-groupe et permet ainsi de réduire la taille de l’échantillon requise.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a été financé par le KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma et High-grade Glioma). Nous remercions Ilya Skachkov et Charles Mougenot pour leur contribution au développement du système.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | Becton Dickinson | 309628 | Plastipak |
| 19 G needle | Terumo Agani | 8AN1938R1 | |
| 23 G needle | Terumo Agani | 8AN2316R1 | |
| 3M Transpore surgical tape | Science applied to life | 7000032707 | or similar |
| Arbitrary waveform generator | Siglent | n.a. | SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s |
| Automated stereotact | in-house built | n.a. | Stereotact with all elements were in-house built |
| Bruker In-Vivo Xtreme | Bruker | n.a. | Includes software |
| Buffered NaCl solution | B. Braun Melsungen AG | 220/12257974/110 | |
| Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK limitd | n.a. | 0.324 mg |
| Cage enrichment: paper-pulp smart home | Bio services | n.a. | |
| Carbon filter | Bickford | NC0111395 | Omnicon f/air |
| Ceramic spoon | n.a | n.a. | |
| Cotton swabs | n.a. | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Ethanol | VUmc pharmacy | n.a. | 70% |
| Evans Blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Fresenius NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | n.a. | NaCl 0.9 %, 1000 mL |
| Histoacryl | Braun Surgical | n.a. | Histoacryl 0.5 mL |
| Hydrophone | Precision Acoustics | n.a. | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 324825/324826 | 0.5 mL and 0.3 mL |
| Isoflurane | TEVA Pharmachemie BV | 8711218013196 | 250 mL |
| Ketamine | Alfasan | n.a. | 10 %, 10 mL |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | Envigo | 2918-11416M | |
| Neoflon catheter | Becton Dickinson | 391349 | 26 GA 0.6 x 19 mm |
| Oscilloscope | Keysight technologies | n.a. | InfiniiVision DSOX024A |
| Plastic tubes | Greiner bio-one | 210261 | 50 mL |
| Power amplifier | Electronics & Innovation Ltd | 210L | Model 210L |
| Preamplifier DC Coupler | Precision Acoustics | n.. | Serial number: DCPS94 |
| Scissors | Sigma Aldrich | S3146-1EA | or similar |
| Sedazine | AST Farma | n.a. | 2% |
| SonoVue microbubbles | Bracco | n.a. | 8 µl/ml |
| Sterile water | Fresenius Kabi | n.a. | 1000 mL |
| Syringe | n.a. | n.a. | various syringes can be used |
| Temgesic | Indivior UK limitd | n.a. | 0.3 mg/ml |
| Transducer | Precision Acoustics | n.a. | 1 MHz |
| Tweezers | Sigma Aldrich | F4142-1EA | or similar |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | 01-02 | Aquasonic 100 |
| Vidisic gel | Bausch + Lomb | n.a. | 10 g |
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