Summary
Геммоэнцербированный барьер (BBB) может быть временно нарушен с помощью микропузырька-опосредованного сфокусированного ультразвука (FUS). Здесь мы описываем пошаговые протоколы для высокой пропускной способности BBB открытия in vivo с использованием модульной системы FUS, доступной для экспертов, не являясь ультразвуком.
Abstract
Геммоемммм Эндотелиальные клетки, соединенные плотными соединениями, образуют физиологический барьер, препятствующий > молекул (>500 Da) в ткани мозга. Микропузырька опосредованное сфокусированное ультразвук (FUS) можно использовать для того чтобы навести преходящее местное отверстие BBB, позволяющ более большие снадобья войти parenchyma мозга.
В дополнение к крупномасштабным клиническим устройствам для клинического перевода, доклинические исследования для оценки реакции терапии кандидатов на препарат требует специальных малых животных ультразвуковых установок для целевого открытия BBB. Предпочтительно, чтобы эти системы позволяли использовать высокооборотные рабочие процессы как с высокой пространственной точностью, так и с комплексным мониторингом кавитации, при этом оставаясь экономически эффективными как с точки зрения первоначальных инвестиций, так и с точки зрения эксплуатационных расходов.
Здесь мы представляем биолюминесценцию и рентгеновская стереотаксическая система FUS для малых животных, которая основана на коммерчески доступных компонентах и соответствует вышеупомянутым требованиям. Особое внимание было уделено высокой степени автоматизации, облегчая проблемы, обычно встречающиеся в многотомных доклинических исследованиях по оценке лекарственных средств. Примерами этих проблем являются необходимость стандартизации для обеспечения воспроизводимости данных, уменьшения внутригрупповой изменчивости, уменьшения размера выборки и, таким образом, соблюдения этических требований и уменьшения ненужной рабочей нагрузки. Предлагаемая система BBB была проверена в рамках BBB открытия облегченные испытания доставки лекарств на пациента полученных ксенотрансплантатов модели глиобластомы мультиформной и диффузной средней линии глиомы.
Introduction
Гемовоэнцефалический барьер (BBB) является основным препятствием для доставки препарата в паренхиму мозга. Большинство терапевтических препаратов, которые были разработаны не пересекают BBB из-за их физико-химических параметров (например, липофилифия, молекулярный вес, водородные облигации принимает и доноров) или не сохраняются из-за их сродства к efflux транспортеров вголовном мозге 1,2. Небольшая группа препаратов, которые могут пересечь BBB, как правило, небольшие липофильные молекулы, которые эффективны только в ограниченном количествезаболеваний мозга 1,2. Как следствие, для большинства заболеваний головного мозга, фармакологические варианты лечения ограничены и новые стратегии доставкилекарств необходимы 3,4.
Терапевтическое УЗИ является новой техникой, которая может быть использована для различных неврологических приложений, таких как нарушение BBB (BBBD), нейромодуляция, иабляция4,5,6,7. Для достижения открытия BBB с экстракорпоратерным ультразвуковым излучателем через череп, сфокусированное УЗИ (FUS) сочетается с микропузырями. Микросовместимые FUS приводит к повышенной биодоступности препаратов в паренхимемозга 5,8,9. При наличии звуковых волн микропузырьки начинают колебаться, инициируя трансцитоз и нарушение плотных соединений между эндотелиальными клетками BBB, что позволяет параклеточной транспортировке больших молекул10. Предыдущие исследования подтвердили корреляцию между интенсивностью акустического излучения и биологическим воздействием на открытие BBB11,12,13,14. FUS в сочетании с микропузырями уже используется в клинических испытаниях для лечения глиобластомы с использованием темозоломида или липосомного доксорубицина в качестве химиотерапевтического агента, или для терапии болезни Альцгеймера и боковогоамиотрофического склероза 5,9,15,16.
Поскольку ультразвук опосредованное открытие BBB открывает совершенно новые возможности для фармакотерапии, для оценки реакции отдельных кандидатов на лекарственные препараты необходимы доклинические исследования клинического перевода. Это обычно требует высокой пропускной способности рабочего процесса с высокой пространственной точностью и предпочтительно комплексного обнаружения кавитации для мониторинга целевого открытия BBB с высокой воспроизводимостью. Если это возможно, эти системы должны быть экономически эффективными как в первоначальных инвестиций и эксплуатационных расходов, с тем чтобы быть масштабируемым в зависимости от размера исследования. Большинство доклинических систем FUS сочетаются с МРТ для изображения руководства ипланирования лечения 15,17,18,19. Хотя МРТ дает подробную информацию об анатомии опухоли и объеме, это дорогой метод, который обычно выполняется обученными / квалифицированными операторами. Кроме того, МРТ высокого разрешения не всегда может быть доступна для исследователей в доклинических учреждениях и требует длительного времени сканирования на животное, что делает его менее пригодным для высокопроверяющих фармакологических исследований. Примечательно, что для доклинических исследований в области нейроонкологии, в частности, инфильтративных опухолевых моделей, возможность визуализировать и нацелить опухоль имеет важное значение дляуспеха лечения 20. В настоящее время это требование выполняется только МРТ или опухолями, трансфокированными с помощью фотопротеина, что позволяет визуализировать биолюминесценцию изображения (BLI) в сочетании с администрированием подстрата фотопротеина.
СИСТЕМы МРТ-управляемые FUS часто используют водяную баню для обеспечения распространения ультразвуковой волны для транскраниальных применений, при которой голова животного частично погружается в воду, так называемые системы«снизу вверх» 15,17,18. Хотя эти проекты работают в целом хорошо в небольших исследований на животных, они являются компромиссом между временем подготовки животных, портативность и реально поддерживать гигиенические стандарты во время использования. В качестве альтернативы МРТ, другие методы руководства для стереотаксической навигации включают в себя использованиегрызунов анатомического атласа 21,22,23, лазерная указка помощьвизуального прицельной 24, пинхол-помощь механического сканирующего устройства25, или BLI26. Большинство из этих конструкций являются "сверху вниз" системы, в которых предуц находится на верхней части головы животного, с животным в естественном положении. Рабочий процесс 'top-down' состоит либо из водянойванны 22,25,26 илизаполненного водойконуса 21,24. Преимущество использования преобразоваваека внутри закрытого конуса является более компактный след, короче время установки и прямо вперед возможности обеззараживания упрощает весь рабочий процесс.
Взаимодействие акустического поля с микропузырями зависит от давления и колеблется от низкоамплитудных колебаний (называемых стабильной кавитацией) до переходного коллапса пузыря (именуемого инерциальной кавитацией)27,28. Существует установленный консенсус, что ультразвук-BBBD требует акустического давления значительно выше стабильного порога кавитации для достижения успешного BBBD, но ниже порога инерциальной кавитации, который обычно ассоциируется с сосудистыми / нейрональнымиповреждениями 29. Наиболее распространенной формой мониторинга и контроля является анализ (обратного) рассеянного акустического сигнала с использованием пассивного обнаружения кавитации (PCD), как это предлагается McDannold et al.12. PCD опирается на анализ спектров Fourier микропузырьковых сигналов выбросов, в котором сила и внешний вид стабильных признаков кавитации (гармоники, субгармоника и ультрагармоника) и инерционные маркеры кавитации (широкополосная реакция) могут быть измерены в режиме реального времени.
"Один размер подходит всем" PCD-анализ для точного контроля давления осложняется из-за полидисперсности формулировки microbubble (амплитуля колебаний сильно зависит от диаметра пузыря), различия в свойствах оболочки пузыря между брендами, и акустические колебания, которые сильно зависят отчастоты и давления 30,31,32. Как следствие, было предложено много различных протоколов обнаружения PCD, которые были адаптированы к конкретным комбинациям всех этих параметров и были использованы в различных сценариях применения (от экспериментов in vitro над протоколами малых животных до PCD для клинического использования) для надежного обнаружения кавитации и даже для обратнойсвязи давления 11,14,30,31,32,33,34,35. Протокол PCD, используемый в рамках данного исследования, получен непосредственно из McDannold et al.12 и отслеживает гармоническое излучение на наличие стабильной кавитации и широкополосного шума для обнаружения инерциальной кавитации.
Мы разработали систему нейронавигации FUS с изображением для временного открытия BBB для увеличения доставки препарата в паренхиму мозга. Система основана на коммерчески доступных компонентах и может быть легко адаптирована к нескольким различным методам визуализации, в зависимости от имеющихся методов визуализации в животном объекте. Поскольку нам требуется рабочий процесс с высокой пропускной способностью, мы решили использовать рентгеновские снимки и BLI для планирования изображений и лечения. Опухолевые клетки, трансдуцированные с помощью фотопротеина (например, люцифераза), подходят дляbli-изображения 20. После введения подстрата фотопротеина, опухолевые клетки могут контролироваться in vivo и рост опухоли и расположениеможет быть определено 20,36. BLI является недорогим методом визуализации, он позволяет следить за ростом опухоли с течением времени, он имеет быстрое время сканирования и хорошо коррелирует с ростом опухоли измеряется МРТ36,37. Мы решили заменить водяную баню заполненным водой конусом, прикрепленным к преобразоваю, чтобы гибкость позволила свободно перемещать платформу, на которойсмонтирован грызун 8,24. Конструкция основана на съемной платформе, оснащенной интеграцией (I) маловодной стереотаксической платформы (II) фидуциальных маркеров с рентгеновской и оптическо-образной совместимостью (III) быстросемещанной анестезии и (IV) интегрированной системой нагрева животных. После первоначальной индукции анестезии животное устанавливается в точном положении на платформе, где оно остается в течение всей процедуры. Следовательно, вся платформа проходит все станции рабочего процесса всего вмешательства, сохраняя при этом точное и воспроизводимое позиционирование и устойчивую анестезию. Программное обеспечение управления позволяет автоматически обнаруживать фидуциальные маркеры и автоматически регистрирует все типы изображений и модальностей изображения (т.е. микро-КТ, рентгеновские, BLI и флуоресценции изображения) в рамках справочной стереотаксической платформы. С помощью автоматической процедуры калибровки, фокусное расстояние ультразвукового превью точно известно внутри, что позволяет автоматическим слиянием интервенционного планирования, акустической доставки и последующего анализа изображений. Как показано на рисунке 1 и рисунке 2,эта установка обеспечивает высокую степень гибкости для разработки специальных экспериментальных рабочих процессов и позволяет переплетенной обработки животных на различных станциях, что в свою очередь облегчает высокую пропускную способность экспериментов. Мы использовали этот метод для успешной доставки лекарств в ксенотрансплантатах мыши высококачественной глиомы, таких как диффузная глиома средней линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты in vivo были одобрены голландским комитетом по этике (номер разрешения на лицензию AVD114002017841) и Органом защиты животных Vrije Universiteit Amsterdam, Нидерланды. Исследователи прошли подготовку по основам системы FUS, чтобы свести к минимуму дискомфорт животных.
1. Сфокусированная ультразвуковая система
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная установка представляет 1000 встроенных построен BBB системы нарушения на основе коммерчески доступных компонентов и включает в себя 3D-печать заказ конуса и съемные стереотаксической платформы. Система разработана модульная, которая облегчает модификации в зависимости от доступного оборудования и конкретного использования. Протокол описывает процедуру сонопорации большей площади в понтийской области мозга мыши. Регулируя целевое местоположение, различные части мозга могут быть направлены. В этом исследовании использовался моно-элементный преобразовайец 1 МГц с фокусным расстоянием 75 мм, диафрагмой 60 мм и фокусной областью 1,5 х 1,5 х 5 мм (FWHM пикового давления). Фокусная плоскость предуцера расположена через череп животного в горизонтальной плоскости, пересекающейся с ушными прутьями.
- Выберите подходящий предуц для открытия BBB у грызунов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на свойствах микропузырей и используемой частоте, акустические настройки, в частности механический индекс (MI), могутизменяться 13,38. - Поместите преобразоваваека в конус с 3D-печатью.
- Ивимите акустически прозрачную милярную мембрану в нижнем конце конуса для достижения акустической связи траектории распространения луча и заполните конус дегазатной водой.
- Намонтировать превлододер над животным на моторизованной линейной сцене, как показано на рисунке 1, позволяющем автоматическое вертикальное позиционирование предуцера.
- Разработать съемную стереотаксическую платформу, основанную на требованиях исследования, которая включает в себя температуру регулируется отопление, укус и ухо баров, анестезии и мульти-модальности фидуциальных маркеров, как показано на рисунке 1 и рисунок 2. Монтаж стереотаксической платформы состоит из 2D линейной сценической системы, которая позволяет точное автоматическое позиционирование (< 0,1 мм) животного под балкой.
- Подключите предуцера к акустической цепочке выбросов, показанной на рисунке 1, состоящем из предуцера, генератора функций и усилителя мощности.
- Разработайте конвейер обработки изображений для обнаружения многомерных фидуциальных маркеров, позволяющих точной сонопоратной ориентации области мозга, представляющих интерес, и сбора данных о кавитации, обнаруженных гидрофоном иглы.
- Калибруйте систему и определите точку фокусировки преврата в соответствии с вертикальным позиционированием животного на стереотаксической платформе.
2. Подготовка животных
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол указан для мышей, но может быть адаптирован для крыс. Для этих экспериментов использовались самки атимической обнаженной Фоксн1/- мыши (6-8 недель).
- Позвольте животному акклиматизироваться в течение по крайней мере одной недели в животном объекте и регулярно взвешивать животное.
- Администрирование бупренорфина (0,05 мг/кг) с помощью подкожной (s.c.) инъекции за 30 минут до лечения ФУС для начала обезболивающего лечения.
- Обезболить животное с 3% изофлюран, 2 л / мин O2 и проверить, что животное глубоко анестезии. Держите животных под наркозом в течение всей процедуры и контролировать частоту дыхания и частоту сердечных сокращений, чтобы скорректировать концентрацию изофлюрана по мере необходимости.
- Нанесите мазь глаза, чтобы предотвратить сухость глаз и избежать возможных травм.
- Удалите волосы на верхней части головы с бритвой и кремом для депиляля и мыть потом водой, чтобы удалить любые остатки, чтобы избежать раздражения кожи.
- Для экспериментов с моделями опухолей BLI ввисьте 150 л D-люциферина (30 мг/мл) внутриперитонеальный (i.p.) с 29 Г инсулиновым шприцем для изображения BLI-руководства.
- Вставьте катетер хвостовой вены 26-30 Г и промойте катетер и вену небольшим объемом гепарина (5 UI/mL). Заполните катетер раствором гепарина, чтобы избежать свертывания крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая катетеризация наблюдается, когда есть рефлюкс крови в катетер. Избегайте пузырьков воздуха в катетере, чтобы предотвратить эмболии. Чтобы избежать чрезмерного давления инъекций, убедитесь, что длина катетера как можно короче. - Поместите животное на регулируемой температурой стереотаксической платформе, чтобы избежать переохлаждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гипотермия снижает кровообращение, что может повлиять на инъекцию / циркуляцию микробублов и фармакокинетики препаратов39. - Обездвижить и зафиксировать голову животного на стереотаксической платформе с помощью ушных ушных ушов и укуса бар. Зафиксировать тело ремнем и приклеить хвост животного к платформе.
3. Виво изображения ориентированных сосредоточены ультразвука
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола был использован моно-элементный преобразоватор 1 МГц с тонус-всплеском импульса с продолжительностью 10 мс, MI 0,4 и частотой повторения импульса 1,6 Гц с 40 циклами для 240 с. Протокол оптимизирован для микропузырей, стабилизированных фосфолипидами, содержащими гексафторид серы (SF6) в качестве безобидного газа, в результате которого средний диаметр пузыря составляет 2,5 мкм, а более 90% пузырьков меньше 8 мкм.
- Поместите стереотаксическую платформу с установленным животным в условия изображения (например, BLI или рентген) и сделайте снимок (ы) животного.
- Используйте мульти-модальности фидуциальных маркеров в сочетании с изображением обработки трубопровода для отметки положения животного в соответствии с точкой фокуса предуктора.
- Определите целевую область, поместив контур мозга над приобретенным рентгеновским изображением или используя изображения BLI для определения центра опухоли(рисунок 2). Положение определенных частей мозга указано в Атласе мозга Paxinos40 с использованием отметины черепа брегмы и лямбды в качестве ориентиров. Например, понс расположен х-1,0, y-0.8 и z'-4.5 от lambda.
- Защита ноздрей и рта животного клейкой лентой, чтобы предотвратить ультразвуковой гель, мешающий дыханию.
- Нанесите ультразвуковой гель поверх головы животного.
- Убирают кожу шеи животных, смазывают гидрофон иглы ультразвуковым гелем и поставить гидрофон иглы в непосредственной близости от затылочной кости.
- Руководство предуцера в правильное положение с помощью конвейера обработки изображений и точки фокусировки.
- Примените заранее настроенные настройки ко всем прикрепленным устройствам и нацелиться на область мозга, представляющие интерес.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от исследовательского вопроса, опухоли или области мозга могут быть sonoporated как единый координационный центр или как объемная форма, как показано на рисунке 2. - Активировать микропузырьки, как описано производителем. Ввись один болюс из 120 МКЛ (5,4 мкг) микропузырька.
- Промыть катетер хвостовой вены солевым раствором, чтобы проверить открытие катетера.
- Введать микропузырьки и начать инсонацию.
- Запись кавитации микропузыря с помощью гидрофона иглы.
- Администрирование внутрисосудистого контрастного агента или препарата после сонопорации. Доза, сроки и планирование зависят от цели исследования и препарата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эванс синий является общим цвет агента для оценки BBB открытия41. - Мониторинг животного до заданной точки времени или до гуманной конечной точки.
4. Анализ кавитации микропузыря
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описана применяемая процедура, которая подходит для экспериментов in vivo для SF6-фосфолипидных микропузырьки со средним диаметром 2,5 мкм (80% пузырьков ниже 8 мкм), возбужденных с импульсом лопнушать тона 10 мс продолжительностью с частотой 1 МГц, как первоначально предполагалось McDannold et al.12.
- Фурье-трансформирует записанный сигнал PCD из домена времени в частотный домен.
- Интегрируйте полученную спектральную мощность для стабильного обнаружения кавитации вокруг2-й и 3-й гармонических (± 50 кГц), как показано на рисунке 3 (зеленая коробка на 2 и 3 МГц).
- Интегрируйте спектральную мощность для обнаружения инерциальной кавитации между основной частотой, 2-й, 3-й гармонической,1-йи 2-й ультрагармонической и первой субгармонической (± 150 кГц), как показано на рисунке 3 (красные коробки).
- Интегрируйте спектральную мощность вокруг принципиальной частоты (1 МГц ± 50 кГц) для нормализации обоих ранее полученных сигналов ПХД.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал PCD, для SF6-фосфолипид микропузырьки в эксперименты vivo на 1 МГц, не отображает ультрагармонику или субгармонику до инерциальной кавитации устанавливает, как показано на рисунке 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанная система FUS (рисунок1 и рисунок 2) и связанный с ней рабочий процесс были использованы в более чем 100 животных и производится воспроизводимые данные о здоровых и опухолевых мышей. Основываясь на записанной кавитации и спектральной плотности гармоник в пиковый момент инъекции microbubble bolus, спектральная мощность каждой частоты может быть рассчитана с помощью анализа Фурье, как это объясняется в шаге 4 Протокола. Основываясь на акустическом протоколе (1 МГц, 10 мс пульса) с МИ 0,4 в сочетании с микропузырями, нормализованный интегрированный спектр питания на2-м и 3-м гармоник нормализовал интегрированный спектр мощности частоты возбуждения наблюдается на рисунке 3. Это обеспечило очень чувствительное и надежное средство стабильного обнаружения кавитации, по сравнению с отсутствием обнаружения субгармоники при введении микропузырьков или наблюдении инерциальной кавитации при применении ИМ 0,6. В случае инерциальной кавитации был обнаружен повышенный широкопольный шумовой пол до 25 дБ, а также появление ультра-гармоник и субгармоники. Хотя акустическое давление МИ 0,4 и 0,6 привело к не макроскопическим повреждениям, микроскопические повреждения были продемонстрировано гистологически на MI 0,6, как показано на рисунке 4. Дальнейшее увеличение амплитуды давления до МИ 0,8 привело к макроскопическому кровоизлиянию в мозг крупных сосудов и широко распространенному лизу тканей с экстравазом эритроцитов. Гистологические находки соответствовали акустическим данным пассивного датчика кавитации, как показано на рисунке 3,подтверждающих повреждающие свойства инерциальной кавитации тканей головного мозга. Как следствие, MI 0.4 был выбран в качестве безопасной амплитуды давления, которая обеспечивала очень воспроизводимое открытие BBB, обеспечивая при этом безопасную маржу для инерционного режима кавитации, как это наблюдалосьдо 11.
Внутривенный Эванс синий был введен для проверки открытия BBB в понтийской области. Сильный альбумин-связывание Эванс синий приводит к большой молекулы более 66 kDa42. На уровне понс и частично мозжечка, экстравазия Эванс сине-спряженный альбумин наблюдался в мыши, обработанной FUS и microbubbles в отличие от мыши без microbubbles (Рисунок 5). Это подчеркивает точное таргетинга в регионе интересов на основе изображения руководствоваться стереотаксической навигации с помощью в доме построить FUS системы и описанного протокола.
Рисунок 1: Сфокусированная ультразвуковая установка.
(A)Схематическое представление сфокусированного ультразвукового установленного. (B)Изображение сфокусированной ультразвуковой установки. Система состоит из сверху вниз установлен предуцера на 1D линейной сцене над второй 2D этап для автоматического 3D позиционирования. Преобразовайка построена в заполненной водой балке-конусе, закрытой внизу акустически прозрачной мирярской мембраной, которая ведет звук к черепу животного. Предуц связан с усилителем мощности, который в свою очередь подключен к генератору произвольной формы волн (AWG) для генерации сигнала. Для обнаружения кавитации используется съемный гидрофон в сочетании с усилителем низкого шума напряжения. Гидрофон находится в непосредственной близости от затылочной кости. Внешний гидрофон имеет 2 мм активную поверхность и акустически соединен с ультразвуковым гелем. Как высоковольтный сигнал импульса возбуждения, так и записанный сигнал кавитации оцифровываются стандартным осциллоскопом 200 МГц и передаются на контрольный компьютер (не показан) для обработки на лету и управления в режиме реального времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Сфокусированный ультразвуковой рабочий процесс.
Предлагаемый рабочий процесс сфокусированной ультразвуковой системы начинаетсяс (A)первоначального позиционирования животного на съемной стереотаксической платформе, обратите внимание на применение акустического геля связи (прикладной пост BLI/X-ray). Одновременно для таргетинга можно проводить мультимодарную визуализацию. (B)Сначала рентгенография является возможность, в то время как область интереса может быть направлена с помощью контура мозга (который, в свою очередь, ссылается наатлас мозга мыши 40, адаптированы к размеру и осанке черепа). (C) Кроме того, BLI изображение люциферазы трансфицированных диффузных опухоли глиомы средней линии, наложенные на рентгеновской проекции максимальной интенсивности могут быть применены для ориентации. (D) Впоследствии, стереотаксическая платформа устанавливается с животным в терапевтическом положении как с гидрофоном и предуцатором прилагается. Предуц автоматически приводит в движение в терапевтом положении и sonicates выбранной траектории после инъекции болюса. Система оптимизирована для высокой пропускной способности экспериментов, в результате которых несколько платформ позволяют переплетенные работы, как показано на вершине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Мониторинг кавитации.
(A)Частотный спектр эксперимента in vivo при отсутствии микропузыря администратора при МИ 0,4 при 1 МГц.(B) Показан соответствующий спектр на пике болюса после инъекции микропузырей. Обратите внимание на увеличение высших гармоник, что свидетельствует о стабильной кавитации микропузырьки. (C)Соответствующий спектр наблюдается при более высоком ИМ 0,6 в сочетании с инъекцией микропузыря, в переходной полосе к началу инерциальной кавитации, что приводит к увеличению шумового пола до 25 дБ и появлению ультрагармоники и субгармоники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: BBB открытия и связанных с ним гистологии.
(A)Стабильная кавитация с использованием MI 0.4 свидетельствует о неповрежденной паренхиме мозга как в макроскопии белого света, так и в его окрашенной микроскопии. (B)После MI 0.6 первые признаки местного необратимого повреждения тканей мозга паренхима становится очевидным в HE окрашенных гистологических данных. (C) Для еще более высокого механического давления MI 0.8, макроскопическое кровоизлияние очевидно, а также широко распространенной ткани лиза головного мозга паренхимы и экстравазии эритроцитов из-за микро-кровоизлияния. Синий оттенок в макроскопии белого света свидетельствует о экстравазации совместного инъекционного внутрисосудистого контрастного агента Evans blue с указанием открытия BBB (см. рисунок 5 для сагиттал-вида). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Проверка открытия BBB.
Демонстрация успешного открытия BBB в стабильном режиме кавитации(B) по сравнению сконтролем (A),без вводимых микропузырьв. В этом случае Эванс синий был использован в качестве внутрисосудистого контрастного агента. Сильный альбумин-связывание Эванс синий приводит к большой молекулы более 66 kDa. Как следствие, доказательства Эванс синий экстравазации является показательным для параклеточного транспорта через BBB из-за (частичное) открытие жестких узлов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы разработали экономически эффективную систему FUS на основе изображения для временного нарушения BBB для увеличения доставки препарата в паренхиму мозга. Система была построена в основном с коммерчески доступными компонентами и в сочетании с рентгеновскими и BLI. Модульность предлагаемой конструкции позволяет использовать несколько способов визуализации для планирования и оценки в высокой пропускной способности рабочих процессов. Система может сочетаться с более всеобъемлющими модальности 3D-изображений с высоким разрешением, например МРТ высокого разрешения или микро-КТ, в то время как для большей части исследования используются 2D-изображения, такие как 2D-рентген и/или BLI. 2D рентген и/или BLI являются значительно более рентабельными, а также идеальными для высокотомных исследований из-за их короткого времени приобретения. Трансдуцатор, описанный здесь, хорошо подходит для производства BBBD в больших областях (по шкале мозга мыши) в более глубоких частях мозга (f число 1,25). Мы использовали систему для диффузно растущих опухолей в понтийскойобласти 43,44. Для этих регионов больший объем должен быть sonoporated, который охватывает всю область опухоли в понах. Модульная система может быть легко отрегулирована для других типов опухолей головного мозга в более надтенторных частях мозга. Для того, чтобы принять решение о типе предуцера следует учитывать F-число, фокусное расстояние и частоту.
Общий дизайн предлагает таким образом две уточнения по сравнению с ранее предложенных конструкций. i) Часто водяная ванна используется для ультразвуковой волновой передачи терапевтических систем. Для транскраниальных применений у мелких животных этот тип конструкции приводит к более крупным и перевернутым установкам, при которыхживотное частично погружается в воду 11,22,25. Хотя эти проекты работают в целом очень хорошо в области небольших исследований на животных, они являются компромиссом в отношении времени установки, портативность и реально поддерживать гигиенические стандарты во время использования. В частности, последнее имеет большое значение в исследованиях сферы охвата, охватывающих ослабленных иммунитетом животных и, следовательно, строгие гигиенические стандарты. Как следствие, для разработки системы с более компактным следом, более коротким временем установки, легкими возможностями обеззараживания и естественным положением животного в течение всего рабочего процесса была выбрана конструкция «сверху вниз». (II) Второй выбор дизайна, который отличается от нескольких ранее описанных конструкций было опустить прямую интеграцию акустической системы доставки в систему медицинской визуализации, такие как МРТ или микро-CT15,17,18,19,45. В то время как полностью интегрированные системы идеально подходят для продольных фармакокинетических исследований или исследований на ограниченном числе животных, такие установки, как правило, менее пригодны для высокотомных фармакологических исследований из-за значительно возросшей сложности, высоких эксплуатационных расходов и необходимости в обученных/квалифицированных операторах. Кроме того, такие системы, как правило, ограничиваются только одним способом визуализации. Как следствие, предлагаемая конструкция здесь опирается на модульную съемную стереотаксическую платформу, которая совместима с несколькими модальности изображения (микро-КТ, МРТ малых животных, различные bli/флуоресценции камер, эти с или без интегрированной рентгеновской визуализации) и обеспечивает также мульти-модальности фидуциальных маркеров для автоматического слияния всех данных изображения в общей структуре отсчета для как интервенционного планирования, так и последующего открытия.
Что касается практических соображений, то наиболее важным моментом неудачи в процедуре является стабильность микропузырька из-за их ограниченного срока службы и их хрупкого характера. Мы хотели бы подчеркнуть, что следующее обсуждение касается микропузырей, стабилизированных фосфолипидами и содержащих гексафторид серы (SF6)как безобидныйгаз 46,47, в то время как другие микропузырьки формулировки, как правило, отображают различные свойства.
Сроки перед инъекцией микропузыря: Объявленный срок службы коммерчески доступных микропузырь после регидратации составляет от 3 до 4 часов. Хотя это подходит для диагностических ультразвуковых применений, следует отметить, что в течение всего этого периода микропузырьки постоянно теряют газ и, следовательно, средний диаметр пузыря подвержен непрерывному нисходящему дрейфу от первоначального среднего размера в 2,5 мкм. Для терапевтических применений, таких как ультразвуковой BBBD, это подразумевает гораздо более строгие сроки-императивы, так как амплитуда колебаний стабильной кавитации (при данной частоте и давлении) и начало-порог инерциальной кавитации являются прямым следствием также подвержены непрерывному дрейфу. По нашему опыту, мы заметили, что microbubbles лучше всего использовать в течение 30 минут после регидратации для того, чтобы получить воспроизводимые результаты, аналогичныепредыдущим отчетам 48.
Сроки после инъекций микропузыря: У крупных приматов, коммерчески доступны SF6-фосфолипидные микробузы отображают крови плазмы ликвидации полуиссяка около 6 минут и более 80% вводимого газа выдыхается через легкие только после 11 минут48. У мелких млекопитающих, таких как мыши и крысы крови плазмы ликвидации период полурайла этого типа microbubbles in vivo с 90-120 секунд значительно короче из-за более высокой сердечнойскорости 20. Как следствие, быстрая динамика концентрации микропузыря непосредственно после инъекций болуса и быстрая последующая ликвидация плазмы в сочетании с непрерывной потерей объема газа пузырьков налагает строгие требования к срокам на протокол sonication/injection для получения воспроизводимых результатов в течение короткой продолжительности 3-4 минут после инъекции. Более длительные процедуры или более обширные объемы BBBD требуют предпочтительно непрерывного администрирования микропузырей. Однако такой подход осложняется плавучестью пузырьков как в шприце, так и в системе кормления, а также вводит значительно увеличенный мертвый объем за счет необходимых инфузионных труб. По нашему опыту, более простое решение разделения общего объема инъекций на 2-3 меньшие суб-дозы обеспечило надежные и воспроизводимые результаты.
Кроме того, микропузырьки очень чувствительны к давлению и высокое гидростатическое давление во время инъекций, следовательно, не рекомендуется. Большие иглы (>19 G) рекомендуется для переноса микропузырьки в пластиковую трубку или для окусывания микропузырямишприцем 49. Для инъекций i.v. у мышей рекомендуется 26-30 Г игл; так как большие иглы труднее вставить в хвостовую вену. 26 G игла рекомендуется, так как гидростатическое давление ниже с этой иглой. Однако, в случае трудного венозного доступа рекомендуется игла 30 G.
Череп мыши является важным смягчающим фактором амплитуды давления, что значительно снижает амплитуду давления в фокусе. Атенуация определяется частотой претендуцера и плотностью среды, распространяемой ультразвуковой волной. Более высокие частоты ультразвука и высокая плотность тканей, как кости приводит к высокой интенсивности. Амплитуда давления частично поглощается костью, а некоторая амплитуда давления теряется в результате отражения и рассеяния50. В наших экспериментах мы определили в трупах мыши, что затухание на 1 МГц составляет 14,5 ± 1,3 дБ/см при средней толщине черепа 0,9мм,как показанодо 21,50. Мониторинг кавитации настоятельно рекомендуется, так как микропузырьки отражают различные акустические выбросы во время стабильной кавитации и инерциальной кавитации. Широкополосный выброс является отчетливым акустическим излучением для инерциальной кавитации12. Мониторинг в режиме реального времени позволяет обнаружить инерциальную кавитацию и снизить амплитуду давления соответственно, чтобы избежать повреждения тканей.
Предыдущие доклады описали влияние типа анестезии на достигнутую проницаемость BBB11,31. При анестезии на основе изофлюрана вазодилатация происходит вскоре после начала анестезии, что связано с небольшим снижением мозгового кровотока. Кроме того, анестезия в течение длительного времени, в частности при отсутствии стабилизации температуры, приводит к снижению сердечного ритма. Поскольку оба фактора потенциально могут привести к большей дисперсии мозговой концентрации как микропузырьки или совместно управляемых препаратов, строгий протокол анестезии рекомендуется для достижения воспроизводимыхрезультатов 51. Анестезия с 1,5% в/в изофлюран в 2 л/мин кислорода в течение 35 до 45 минут не было проблематичным, как рекомендуется Константинидис идр. 51. В отличие от McDannold и др., которые показали, что эта газовая смесь в сочетании с конкретным типом их microbubblesбыло проблематично 52, мы не наблюдали примечательных проблем с этим типом microbubbles. Кроме того, животные могут быть обезболены смесью кетамина/ ксилазина, который не имеет известных вазоактивных эффектов53.
Таким образом, описанная здесь методика открытия BBB-изображения была использована для высокотомных доклинических исследований по оценке лекарственных препаратов, которые продемонстрировали эффективность предложенного рабочего процесса. Таким образом, эта система может эксплуатироваться не техническим персоналом после короткой подготовки в связи с высокой степенью автоматизации. Это в сочетании с простотой установки привело к высокой степени стандартизации, что, в свою очередь, обеспечивает экспериментальную воспроизводимость, снижает внутригрупповую изменчивость и тем самым позволяет уменьшить требуемый размер выборки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Этот проект финансировался KWF-STW (Доставка лекарств сонопорой в детстве диффузной внутренней понтийной глиомы и высококачественной Глиомы). Благодарим Илью Скачкова и Шарля Мугенота за вклад в развитие системы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | Becton Dickinson | 309628 | Plastipak |
| 19 G needle | Terumo Agani | 8AN1938R1 | |
| 23 G needle | Terumo Agani | 8AN2316R1 | |
| 3M Transpore surgical tape | Science applied to life | 7000032707 | or similar |
| Arbitrary waveform generator | Siglent | n.a. | SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s |
| Automated stereotact | in-house built | n.a. | Stereotact with all elements were in-house built |
| Bruker In-Vivo Xtreme | Bruker | n.a. | Includes software |
| Buffered NaCl solution | B. Braun Melsungen AG | 220/12257974/110 | |
| Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK limitd | n.a. | 0.324 mg |
| Cage enrichment: paper-pulp smart home | Bio services | n.a. | |
| Carbon filter | Bickford | NC0111395 | Omnicon f/air |
| Ceramic spoon | n.a | n.a. | |
| Cotton swabs | n.a. | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Ethanol | VUmc pharmacy | n.a. | 70% |
| Evans Blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Fresenius NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | n.a. | NaCl 0.9 %, 1000 mL |
| Histoacryl | Braun Surgical | n.a. | Histoacryl 0.5 mL |
| Hydrophone | Precision Acoustics | n.a. | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 324825/324826 | 0.5 mL and 0.3 mL |
| Isoflurane | TEVA Pharmachemie BV | 8711218013196 | 250 mL |
| Ketamine | Alfasan | n.a. | 10 %, 10 mL |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | Envigo | 2918-11416M | |
| Neoflon catheter | Becton Dickinson | 391349 | 26 GA 0.6 x 19 mm |
| Oscilloscope | Keysight technologies | n.a. | InfiniiVision DSOX024A |
| Plastic tubes | Greiner bio-one | 210261 | 50 mL |
| Power amplifier | Electronics & Innovation Ltd | 210L | Model 210L |
| Preamplifier DC Coupler | Precision Acoustics | n.. | Serial number: DCPS94 |
| Scissors | Sigma Aldrich | S3146-1EA | or similar |
| Sedazine | AST Farma | n.a. | 2% |
| SonoVue microbubbles | Bracco | n.a. | 8 µl/ml |
| Sterile water | Fresenius Kabi | n.a. | 1000 mL |
| Syringe | n.a. | n.a. | various syringes can be used |
| Temgesic | Indivior UK limitd | n.a. | 0.3 mg/ml |
| Transducer | Precision Acoustics | n.a. | 1 MHz |
| Tweezers | Sigma Aldrich | F4142-1EA | or similar |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | 01-02 | Aquasonic 100 |
| Vidisic gel | Bausch + Lomb | n.a. | 10 g |
References
- Lipinski, C. A. Lead- and drug-like compounds: the rule-of-five revolution. Drug Discovery Today: Technologies. 1 (4), 337-341 (2004).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
- Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
- Meng, Y., et al. Safety and efficacy of focused ultrasound induced blood-brain barrier opening, an integrative review of animal and human studies. Journal of Controlled Release. 309, 25-36 (2019).
- Darrow, D. P. Focused Ultrasound for Neuromodulation. Neurotherapeutics. 16 (1), 88-99 (2019).
- Zhou, Y. F. High intensity focused ultrasound in clinical tumor ablation. World Journal of Clinical Oncology. 2 (1), 8-27 (2011).
- O'Reilly, M. A., Hough, O., Hynynen, K. Blood-Brain Barrier Closure Time After Controlled Ultrasound-Induced Opening Is Independent of Opening Volume. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (3), 475-483 (2017).
- Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
- Dasgupta, A., et al. Ultrasound-mediated drug delivery to the brain: principles, progress and prospects. Drug Discovery Today: Technologies. 20, 41-48 (2016).
- O'Reilly, M. A., Waspe, A. C., Chopra, R., Hynynen, K. MRI-guided disruption of the blood-brain barrier using transcranial focused ultrasound in a rat model. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Physics in Medicine & Biology. 51 (4), 793 (2006).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound and circulating preformed microbubbles appears to be characterized by the mechanical index. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (5), 834-840 (2008).
- Sun, T., et al. Closed-loop control of targeted ultrasound drug delivery across the blood-brain/tumor barriers in a rat glioma model. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (48), 10281-10290 (2017).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Carpentier, A., et al. Clinical trial of blood-brain barrier disruption by pulsed ultrasound. Science Translational Medicine. 8 (343), 342 (2016).
- Chopra, R., Curiel, L., Staruch, R., Morrison, L., Hynynen, K. An MRI-compatible system for focused ultrasound experiments in small animal models. Medical Physics. 36 (5), 1867-1874 (2009).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood–brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
- Larrat, B., et al. MR-guided transcranial brain HIFU in small animal models. Physics in Medicine & Biology. 55 (2), 365 (2009).
- Contag, C. H., Jenkins, D., Contag, P. R., Negrin, R. S. Use of reporter genes for optical measurements of neoplastic disease in vivo. Neoplasia. 2 (1-2), New York, NY. 41 (2000).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 33 (1), 95-104 (2007).
- Bing, C., et al. Trans-cranial opening of the blood-brain barrier in targeted regions using astereotaxic brain atlas and focused ultrasound energy. Journal of Therapeutic Ultrasound. 2 (1), 13 (2014).
- Marquet, F., et al. Real-time, transcranial monitoring of safe blood-brain barrier opening in non-human primates. PloS One. 9 (2), (2014).
- Anastasiadis, P., et al. characterization and evaluation of a laser-guided focused ultrasound system for preclinical investigations. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 36 (2019).
- Liu, H. L., Pan, C. H., Ting, C. Y., Hsiao, M. J. Opening of the blood-brain barrier by low-frequency (28-kHz) ultrasound: a novel pinhole-assisted mechanical scanning device. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (2), 325-335 (2010).
- Zhu, L., et al. Focused ultrasound-enabled brain tumor liquid biopsy. Scientific Reports. 8 (1), 1-9 (2018).
- Bader, K. B., Holland, C. K. Gauging the likelihood of stable cavitation from ultrasound contrast agents. Physics in Medicine & Biology. 58 (1), 127 (2012).
- Neppiras, E. Acoustic cavitation series: part one: Acoustic cavitation: an introduction. Ultrasonics. 22 (1), 25-28 (1984).
- Aryal, M., Arvanitis, C. D., Alexander, P. M., McDannold, N. Ultrasound-mediated blood-brain barrier disruption for targeted drug delivery in the central nervous system. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 94-109 (2014).
- Tung, Y. S., Choi, J. J., Baseri, B., Konofagou, E. E. Identifying the inertial cavitation threshold and skull effects in a vessel phantom using focused ultrasound and microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (5), 840-852 (2010).
- Arvanitis, C. D., Livingstone, M. S., Vykhodtseva, N., McDannold, N. Controlled ultrasound-induced blood-brain barrier disruption using passive acoustic emissions monitoring. PloS One. 7 (9), (2012).
- Tsai, C. H., Zhang, J. W., Liao, Y. Y., Liu, H. L. Real-time monitoring of focused ultrasound blood-brain barrier opening via subharmonic acoustic emission detection: implementation of confocal dual-frequency piezoelectric transducers. Physics in Medicine & Biology. 61 (7), 2926 (2016).
- Chen, W. S., Brayman, A. A., Matula, T. J., Crum, L. A. Inertial cavitation dose and hemolysis produced in vitro with or without Optison. Ultrasound in Medicine & Biology. 29 (5), 725-737 (2003).
- Qiu, Y., et al. The correlation between acoustic cavitation and sonoporation involved in ultrasound-mediated DNA transfection with polyethylenimine (PEI) in vitro. Journal of Controlled Release. 145 (1), 40-48 (2010).
- Sun, T., Jia, N., Zhang, D., Xu, D. Ambient pressure dependence of the ultra-harmonic response from contrast microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 131 (6), 4358-4364 (2012).
- Rehemtulla, A., et al. Rapid and quantitative assessment of cancer treatment response using in vivo bioluminescence imaging. Neoplasia. 2 (6), 491-495 (2000).
- Puaux, A. L., et al. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. International Journal of Molecular Imaging. 2011, (2011).
- Wu, S. K., et al. Characterization of different microbubbles in assisting focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Scientific Reports. 7, 46689 (2017).
- van den Broek, M. P., Groenendaal, F., Egberts, A. C., Rademaker, C. M. Effects of hypothermia on pharmacokinetics and pharmacodynamics. Clinical Pharmacokinetics. 49 (5), 277-294 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. Paxinos and Franklin's the mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic press. (2019).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 385, 385 (2015).
- Yao, L., Xue, X., Yu, P., Ni, Y., Chen, F. Evans blue dye: a revisit of its applications in biomedicine. Contrast Media & Molecular Imaging. 2018, (2018).
- Caretti, V., et al. Monitoring of tumor growth and post-irradiation recurrence in a diffuse intrinsic pontine glioma mouse model. Brain Pathology. 21 (4), 441-451 (2011).
- Yoshimura, J., Onda, K., Tanaka, R., Takahashi, H. Clinicopathological study of diffuse type brainstem gliomas: analysis of 40 autopsy cases. Neurologia Medico-Chirurgica. 43 (8), 375-382 (2003).
- Yang, F. Y., et al. Micro-SPECT/CT-based pharmacokinetic analysis of 99mTc-diethylenetriaminepentaacetic acid in rats with blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound. Journal of Nuclear Medicine. 52 (3), 478-484 (2011).
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science, Engineering & Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Greis, C. Technology overview: SonoVue. European Radiology. 14, Bracco, Milan. 11-15 (2004).
- Schneider, M. Characteristics of sonovue. Echocardiography. 16, 743-746 (1999).
- Talu, E., Powell, R. L., Longo, M. L., Dayton, P. A. Needle size and injection rate impact microbubble contrast agent population. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (7), 1182-1185 (2008).
- Pinton, G., et al. Attenuation, scattering, and absorption of ultrasound in the skull bone. Medical Physics. 39 (1), 299-307 (2012).
- Constantinides, C., Mean, R., Janssen, B. J. Effects of isoflurane anesthesia on the cardiovascular function of the C57BL/6 mouse. ILAR journal/National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 52, 21 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The effects of oxygen on ultrasound-induced blood-brain barrier disruption in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
