Summary
الهدف من البروتوكول هو توفير طريقة لإنتاج الآفات العصبية غير الغازية في الدماغ. تستخدم الطريقة الموجات فوق الصوتية المركزة (MRgFUS) لفتح حاجز الدم في الدماغ بطريقة عابرة ومركزية ، من أجل توصيل سم عصبي متداول إلى بارينتشيما الدماغ.
Abstract
يمكن أن يكون التدخل الجراحي فعالاً جداً في علاج أنواع معينة من الأمراض العصبية المستعصية طبياً. هذا النهج مفيد بشكل خاص للاضطرابات التي تلعب فيها الدوائر العصبية القابلة للتحديد دورًا رئيسيًا ، مثل الصرع واضطرابات الحركة. الطرائق الجراحية المتاحة حاليا، على الرغم من فعاليتها، تنطوي عموما على إجراء جراحي الغازية، والتي يمكن أن تؤدي إلى إصابات جراحية للأنسجة غير المستهدفة. وبالتالي، سيكون من المفيد توسيع نطاق النهج الجراحية لتشمل تقنية غير الغازية والأعصاب على حد سواء.
هنا، يتم تقديم طريقة لإنتاج البؤري، آفات الخلايا العصبية في الدماغ بطريقة غير الغازية. يستخدم هذا النهج الموجات فوق الصوتية منخفضة الكثافة التركيز جنبا إلى جنب مع microbubbles عن طريق الوريد لفتح عابرة ومركزيا حاجز الدم الدماغ (BBB). ثم يتم استغلال فترة فتح BBB العابرة لتسليم سم عصبي مُدار بشكل منهجي إلى منطقة مستهدفة في الدماغ. حمض الكينولينيك العصبي (QA) هو عادة BBB-impermeable، ويتم التسامح بشكل جيد عندما تدار داخل الصفاق أو عن طريق الوريد. ومع ذلك، عندما تحصل على ضمان الجودة الوصول المباشر إلى أنسجة الدماغ، فهي سامة للخلايا العصبية. وقد استخدمت هذه الطريقة في الفئران والجرذان لاستهداف مناطق محددة في الدماغ. مباشرة بعد MRgFUS، يتم تأكيد نجاح فتح BBB باستخدام التصوير المرجح T1 المحسنة على النقيض. بعد الإجراء، والتصوير T2 يظهر إصابة تقتصر على المنطقة المستهدفة من الدماغ وفقدان الخلايا العصبية في المنطقة المستهدفة يمكن تأكيد بعد الوفاة باستخدام تقنيات النسيج. وتجدر الإشارة إلى أن الحيوانات التي يتم حقنها بالملوحة المالحة بدلاً من QA تثبت افتتاح BBB ، ولكن لا تظهر نقطة الإصابة أو فقدان الخلايا العصبية. هذه الطريقة، التي يطلق عليها دقيقة Intracerebral الجراحة الموجهة غير الغازية (PING) يمكن أن توفر نهجا غير الغازية لعلاج الاضطرابات العصبية المرتبطة بالاضطرابات في الدوائر العصبية.
Introduction
والغرض من هذه الطريقة هو توفير وسيلة لإنتاج الآفات العصبية غير الغازية في منطقة مستهدفة من الدماغ. والأساس المنطقي لتطوير مثل هذا النهج هو فصل الدوائر العصبية التي تسهم في الاضطرابات العصبية. على سبيل المثال، يمكن أن تكون الجراحة فعالة جدا في علاج بعض الاضطرابات العصبية المستعصية طبيا، مثل الصرع المقاوم للأدوية (DRE)1. ومع ذلك، كل من الطرائق الجراحية المتاحة تمتلك حدودا من حيث إنتاج أضرار جانبية غير مرغوب فيها للدماغ. يمكن أن تكون الجراحة التقليدية التي تُعاد الجراحة شديدة التوغل مع خطر النزيف والعدوى والجلطات الدموية والسكتة الدماغية والنوبات وتورم الدماغ وتلف الأعصاب2. وتشمل بدائل الجراحة التي هي طفيفة التوغل أو غير الغازية العلاج الحراري بالليزر الخلالي والجراحة الإشعاعية، والتي أثبتت أيضا أن تكون فعالة في قمع المضبوطات في DRE. في الآونة الأخيرة ، أظهرت الآفات الحرارية التي تنتجها الموجات فوق الصوتية عالية الكثافة (HIFU) وعدًا في الحد من النوبات. HIFU غير الغازية; ومع ذلك، يقتصر إطار العلاج في الوقت الراهن على مناطق أكثر مركزية من الدماغ بسبب خطر الإصابة الحرارية في الأنسجة غير المستهدفة الموجودة في محيط الجمجمة. على الرغم من هذه القيود، فوائد الجراحة غالبا ما تفوق المخاطر المحتملة. على سبيل المثال، على الرغم من أن الجراحة لDDE يمكن أن تنتج تلف الدماغ الجانبية، وآثارها المفيدة في قمع المضبوطات وتحسين نوعية الحياة عادة ما تسود على المخاطر الجراحية.
تم تطوير الطريقة الموصوفة هنا ، الجراحة الموجهة غير الغازية الدقيقة (PING) ، لغرض فصل الدوائر العصبية ، مع الحد من تلف الدماغ الجانبي. تستخدم هذه الطريقة الموجات فوق الصوتية منخفضة الكثافة تركز جنبا إلى جنب مع الحقن الوريدي من microbubbles لفتح BBB، من أجل تقديم سم عصبي. هذا النهج لا تنتج الآفات الحرارية للدماغ3,4,5,6,7, ويمكن استغلال فترة فتح BBB لتقديم مركبات BBB-impermeable إلى parenchyma الدماغ. افتتاح BBB عابر، ويمكن أن تنتج بطريقة مستهدفة باستخدام توجيه التصوير بالرنين المغناطيسي. في دراساتنا، وقد استخدمت فترة افتتاح BBB لتقديم neurotoxin تعميمها إلى منطقة مستهدفة من الدماغ parenchyma في الفئرانوالجرذان 8،9. حمض الكينولينيك هو سم عصبي جيد التحمل عندما تدار عن طريق الوريد10، intraarterially10، أو intraperitoneally8،9،11. ويرجع عدم وجود سمية QA إلى ضعف نفاذية BBB، والتي أفادت التقارير بأنها لا تذكر10. في المقابل، الحقن المباشر من QA في الدماغ parenchyma تنتج الآفات العصبية التي تجنب محاور المحاور المجاورة12،13. وهكذا، عندما تعميم ضمان الجودة مكاسب الوصول إلى parenchyma الدماغ في المنطقة المستهدفة من افتتاح BBB، يتم إنتاج الموت العصبي8،9. الطريقة الحالية تنتج بالتالي فقدان الخلايا العصبية التركيز بطريقة محددة الهدف وغير الغازية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت على جميع الأساليب المذكورة هنا من قبل جامعة فرجينيا لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها.
1- إعداد الكواشف
- في يوم الجراحة ، أعد 6.0 مل من حمض الكينولينيك القابل للحقن (QA). حل 450 ملغ من QA في 4.0 مل من 1.0 N NAOH. إضافة 0.6 مل من 10x PBS، وhH إلى 7.4، وجلب إلى حجم النهائي من 6.0 مل مع dH2O. تصفية من خلال 0.22 μm مرشح حقنة. الحل مستقر لمدة أسبوعين عند 4 درجة مئوية.
- إعداد تشتت مائي من microbubbles في المالحة العادية بواسطة سونيكيشن التحقيق من الغاز decafluorobutane واستقرار مع DSPC / PEG stearate قذيفة أحادية12.
- حجم microbubbles عن طريق التعويم في الجاذبية الطبيعية. تحديد تركيز microbubble والحجم عن طريق الاستشعار عن طريق electrozone باستخدام عداد Multisizer الثالث. وينبغي أن يكون تركيز microbubble وتوزيع الحجم 6 × 108/ مل و ~ 2 ميكرومتر (متوسط قطر الجسيمات)، على التوالي. تتم إزالة أكبر الفقاعات عن طريق استبعاد التعويم / فصل.
- بدلا من ذلك، شراء microbubbles المتاحة تجاريا.
2- إعداد الحيوانات
- تأقلم الحيوان (الفئران أو الفأر) لمدة 3 أيام بعد الولادة. استخدمت التجارب الموصوفة هنا فئران Sprague-Dawley (5-6 أسابيع من العمر) أو الفئران غير التكافؤية الداخلية (tish) (المستعمرة المحلية).
- منزل الحيوانات تحت ضوء 12 ساعة: دورة 12 ساعة الظلام.
- سجل الأوزان الحيوانية. هذه المعلومات مهمة طوال العملية.
- الحصول على صور MR المرجح T2 في اليوم السابق لإجراء فوس من أجل تأسيس صور خط الأساس قبل الجراحة. استخدم المعلمات التالية للتصوير T2: وقت التكرار/وقت الصدى [TR/TE] = 3000/138 مللي ثانية، 3 متوسطات، مجال الرؤية= 29 × 45 مم2،حجم المصفوفة = 125 × 192، سمك الشريحة = 0.23 مم.
- تخدير الحيوان مع ايزوفلوران (4٪ التعريفي، 2٪ الصيانة). تأكيد عمق كافية من التخدير باستخدام قرصة إصبع. تطبيق مرهم العيون على العينين.
- حلق فروة رأس الحيوان، وإزالة الشعر المتبقي مع كريم إزالة الشعر.
- استخدام القسطرة الوريدي الذيل لضخ microbubbles، عامل التباين، و QA. تتكون القسطرة من طول أنابيب PE10 مزودة بإبرة 30 G × 1/2 بوصة. ترك حقنة 1 مل مع الملح الملحية heparinized في خط، إلى أن تتم إزالتها وإعادة ربطها عندما يتم استخدام خط للضخ.
3. التصوير بالرنين المغناطيسي و PING الإجراءات
- إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي على وحدة 7 T MR مع قوة التدرج من 600 mT/m/ms(الشكل 1 والشكل 2). تنفيذ عمليات اقتناء التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام لفائف سطحية مدمجة في نظام FUS.
ملاحظة: نظام FUS المستخدم في التجارب يتكون من ثلاثة أجزاء: (ط) نظام صوتنة هو م-متوافق مع ما قبل التركيز، 8-عنصر مجموعة الحلقية، محول 1.5 ميغاهيرتز (نصف قطر كروية = 20 مم ± 2 مم، قطر نشط = 25 ملم (f-number = 0.8)، مع 80٪ الكهربائية والصوتية الكفاءة، والتي ترتبط مولد مجموعة على مراحل و RF السلطة مكبر للصوت؛ '2' مرحلة لتحديد المواقع مزودة بمحركات متوافقة مع MR لتحريك المحول في الاتجاه الأمامي الأمامي واتجاه المسارين؛ (iii) محطة عمل ثيرموجويد للتحكم في تسليم سونيكيشن، بما في ذلك التركيز الإلكتروني من خلال تعديل المرحلة لضبط العمق البؤري (الشكل 2). - ضع الحيوان المُجَنَّف على لفائف الزلاجة(الشكل 1)من نظام FUS المتوافق مع MR في الموضع المعرض. اشل الحيوان باستخدام شريط القاطع وأشرطة الأذن المدرجة في مهد الزلاجة.
- تطبيق هلام الصوتية إلى فروة الرأس بالماء تره. ضمان عدم وجود فقاعات، ووضع حاجز الغشاء من جزء تعميم المياه من تجميع محول فوق جمجمة الحيوان، وخفض تجميع محول بقدر الإمكان في اتجاه متوازي لوح مواز بالنسبة إلى لوحة الجمجمة. ضع الحجاب الحاجز للمحول بقوة ضد فروة رأس الحيوان الحليقة مباشرة فوق لوحة الجمجمة.
- إرفاق جهاز استشعار هوائي للجسم مع الشريط الجراحي، لرصد التنفس. ضع جهاز الاستشعار الهوائي على القفص الصدري السفلي الأيسر.
- نقل الجمعية الذراع FUS مع لفائف، زلاجة، والحيوان في وحدة التصوير بالرنين المغناطيسي 7T(الشكل 1).
- تشغيل تسلسل T2-الكشفية لتحديد الموقف المادي العام من تجميع محول نسبة إلى رأس الحيوان، وإجراء تعديلات الميكانيكية حسب الضرورة (الشكل 2). المعلمات للتصوير T2 هي: وقت التكرار / صدى الوقت [TR / TE] = 3000/138 مللي ثانية، 3 متوسطات، مجال الرؤية = 29 × 45 مم2،حجم المصفوفة = 125 × 192، سمك الشريحة = 0.23 ملم. لا يستخدم قياس الحرارة عادة في هذا البروتوكول.
- الحصول على صور T2 لتحسين تحديد موضع محول. على وجه التحديد، تحديد موقع محول وتحديد نقطة (ق) من سونيكيشن باستخدام وظيفة استهداف البرنامج. المعلمات للتصوير T2 هي: وقت التكرار / صدى الوقت [TR / TE] = 3000/138 مللي ثانية، 3 متوسطات، مجال الرؤية = 29 × 45 مم2،حجم المصفوفة = 125 × 192، سمك الشريحة = 0.23 ملم.
- فقط قبل sonication، حقن 300 ميكرولتر/كغ من microbubbles14 عبر الوريد الذيل.
- استخدام محول 1.5 ميغاهرتز لإنتاج سونيكيشنات (30 ms موجة الحزمة، 3٪ دورة واجب، 1 هرتز تردد التكرار، 240 مدة / سونيكيشن s.
- مباشرة بعد سونيكيشن، حقن gadodiamide عامل التباين عبر الوريد الذيل، ومن ثم تنفيذ T1-المرجح بالإضافة إلى مسح التباين لتأكيد فتح BBB ودقة الاستهداف. معلمات التصوير المرجح T1: TR/TE = 900/12 مللي ثانية، 2 متوسطات، مجال الرؤية = 24 × 30 مم2،حجم المصفوفة = 208 × 256، سمك الشريحة = 0.7 مم. عادةً ما يتم إجراء فحص T1 واحد.
- إزالة ذراع FUS ومزلاج من التصوير بالرنين المغناطيسي، ووضع الحيوان على وسادة التدفئة تعيين إلى 40 درجة مئوية، مع الحفاظ على 2٪ من التخدير isoflurane.
- بدءا من 30 دقيقة بعد سونيكيشن، واستخدام مضخة حقنة لبث QA (75 ملغ / مل حل الأسهم) عن طريق الوريد الذيل ل 1 ح بمعدل 16.8 ميكرولتر / دقيقة لتحقيق جرعة نهائية من 225 ملغم / كغ (q.s. إلى 1.0 مل ملحي).
- عندما يكون التسريب كاملاً، توقف عن التخدير، مع إبقاء الحيوان على وسادة التدفئة حتى حالة تأهب. ضع الحيوان في قفص و قم بإجراء فحوصات روتينية لنشاطه كل 15 دقيقة ، لعدة ساعات بعد الإجراء.
- إعادة الحيوان إلى فيفيريوم وتحقق كل 6 ح لليوم الأول للضيق أو النشاط غير المنتظم.
- يوم واحد بعد sonication، أداء التصوير MR T2 المرجح لتقييم أي أضرار في مجال سونيكيشن. المعلمات للتصوير T2: زمن التكرار/زمن الصدى [TR/TE] = 3,000/138 مللي ثانية, 3 متوسطات, مجال الرؤية = 29 × 45 مم2,حجم المصفوفة = 125 × 192, سمك الشريحة = 0.23 مم. يتم تقييم الصور لمناطق فرط التنهم لتحديد تلف الأنسجة المحتملة / الوذمة.
4. تحليل ما بعد الوفاة من فقدان الخلايا العصبية
- السماح لما بعد سونيكيشن، وفترة البقاء على قيد الحياة من 4-5 أيام لتقييم فقدان الخلايا العصبية مع فلورو اليشم هيستوكيميا.
- تخدير عميق الحيوان مع ايزوفلوران، والقتل الرحيم عن طريق ضخ داخل القلب مع 0.1 M الفوسفات العازلة (pH 7.4) تليها 4٪ شبهformaldehyde في عازلة الفوسفات.
- إزالة الدماغ من الجمجمة و بعد الإصلاح لمدة 2 أيام في 4٪ شبهformaldehyde.
- غمر الدماغ في السكروز 30٪ للتبريد، وقطع أقسام في سمك 20-30 ميكرومتر مع التبريد.
- جبل أقسام التبريد على الشرائح الجيلاتينية والهواء الجاف بين عشية وضحاها.
- ريحية الشرائح في الماء المقطر، ومن ثم الجفاف في الإيثانول متدرج تصاعدي. بعد الجفاف، شرائح إعادة الترطيب في الإيثانول المتدرج التنازلي.
- نقل الشرائح إلى محلول من 0.06٪ برمنجنات البوتاسيوم لمدة 15 دقيقة على شاكر المدارية.
- شطف الشرائح لمدة 1 دقيقة في الماء المقطر ونقلها إلى حل 0.001٪ من الفلورو اليشم B في 0.1٪ حمض الخليك. احتضان تحت التحريض لطيف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. شطف الشرائح ثلاث مرات لمدة 1 دقيقة في الماء المقطر.
- جفف الشرائح على شريحة أكثر دفئًا، وتكف في الزيلينات لمدة 3 دقائق، وأغطية باستخدام وسائط DPX المتزايدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا القسم تأثير PING على الخلايا العصبية الموجودة في خلل التنسج النيوcortical. خلل التنسج الأنسجة هي سمة مشتركة في أدمغة المرضى الذين يعانون من الصرع المقاوم للأدوية ، والإزالة الجراحية للخلل العضلي التشنجي يمكن أن توفر مراقبة ممتازة للنوبات15. ولذلك فإن تحديد تأثير PING على أنسجة الدماغ العسرة هو أولوية مهمة. تم اختيار نموذج الفئران من خلل التنسج القشري الوراثي ، الجرذ tish ، لدراسة هذه المسألة لأن الدماغ tish يعرض الأنسجة dysplastic (الفرقة تحت القشرية heterotopia) تقع تحت القشرة الجديدة وضعها عادة (الشكل 3). كلا من خلل التنسج والذروة الإفراط في القشرة العصبية التي هي وظيفية والمعرضة الاتصالية الجديدة المميزة17,18.
PING استهداف heterotopia من الدماغ الفئران tish كان فعالا في إنتاج فقدان الخلايا العصبية البؤري من الخلايا العصبية dysplastic(الشكل 3). T2-الصور المرجحة التي اتخذت يوم واحد بعد بينغ معرض مناطق من فرط في الtensity، بما يتفق مع تلف الأنسجة في المناطق المستهدفة من سونيكيشن. بعد تشريح الجثة التلوين باستخدام الفلورو اليشم بعد فترة البقاء على قيد الحياة بعد 5 أيام أظهر الخلايا العصبية المنحطة في مناطق T2-hyperintensity، مما يؤكد قدرة PING لإنتاج فقدان الخلايا العصبية في الأنسجة القشرية العسرة المستهدفة.
الشكل 1: الرنين المغناطيسي (MR) - زلاجات متوافقة و 7T MR المغناطيس. الملامح الرئيسية للزلاجة المستخدمة لوضع الحيوان في المغناطيس MR وتقديم سونيكيشن هي مبينة (A). يظهر الجمعية الزلاجة إدراجها في 7T MR المغناطيس (B). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: غرفة التحكم في التصوير بالرنين المغناطيسي (MR) والتصوير بالموجات فوق الصوتية المركزة (FUS). غرفة التحكم تتكون من محطتين رئيسيتين. المحطة التي يجلس فيها المحقق هي منطقة التخطيط لاستهداف FUS (A). المحطة الثانية هي منطقة التحكم لنظام التصوير بالرنين المغناطيسي(B). النافذة المقوى بالنحاس خلف محطة التصوير بالرنين المغناطيسي ينظر إلى غرفة السكن 7T المغناطيس. يعرض جهاز العرض في محطة FUS البرنامج الذي يتحكم في إرشادات ومعلمات صوتنة (C). هذا المثال يظهر سونيكيشن استهداف المخطط فوق صورة MR T2 المرجحة (D). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: PING تنتج فقدان الخلايا العصبية في القشرة الجديدة dysplastic من الدماغ الفئران tish. تم الحصول على صور MR T2 المرجحة(A, B)بعد يوم واحد من PING. القشرة [N] ، heterotopia [H] ، والبطينين الجانبي [LV] هي وصفت لغرض التوجه (A). ويمكن رؤية مناطق فرط التشنج [السهام البيضاء والصفراء] ، التي تدل على تلف الأنسجة ، في المناطق المستهدفة من التغاير على جانبي الدماغ (B). بعد الوفاة تلطيخ مع الفلورو اليشم(C -F). ويلاحظ الخلايا الخضراء الزاهية التي تمثل الخلايا العصبية المتحللة في المناطق المقابلة لمناطق فرط الtensity على كل من اليسار (C, E; السهام البيضاء) واليمين(D, F; الأسهم الصفراء) الجانبين من الدماغ. أشرطة مقياس: C، D = 1 مم؛ E, F = 0.5 ملم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تصميم طريقة PING لإنتاج آفات الخلايا العصبية غير الغازية المستهدفة. هذه الطريقة مستمدة من أساس قوي ومتزايد من البحوث في مجال تركيز الموجات فوق الصوتية3،4،5،6،7. وقد خلقت القدرة على توفير الوصول البؤري إلى مناطق محددة من parenchyma الدماغ عن طريق افتتاح عابر من BBB وسيلة لتقديم مجموعة واسعة من العوامل التي عادة لا يمكن الوصول إلى الدماغ. ويجري إلى حد كبير هذه الفرصة المتقدمة للتسليم المركزي للعوامل العلاجية التي تمتلك نفاذية BBB الفقراء. طريقة PING رافز نفس الفرصة بطريقة مختلفة من خلال تقديم سم عصبي، مع الهدف النهائي لتدمير الدوائر التي تسهم في الخلل العصبي. تمثل الدوائر العصبية الشاذة هدفًا فعالًا للتدخل الجراحي لتكدير تأثير بعض الاضطرابات العصبية2,15. الهدف على المدى الطويل لطريقة PING هو زيادة النهج المتاحة حاليا لفصل الدوائر التي تسهم في الخلل العصبي.
ومن شأن تصميم دراسة شاملة باستخدام طريقة PING أن يشمل مجموعات تحكم متعددة. وستشمل هذه الفئات ما يلي: (أ) مجموعة غير معالجة [لا يوجد وجود للصمامات المسلحة/لا توجد ضمانة ضمان الجودة]؛ (ب) مجموعة غير معالجة (محمّل من أجل ضمان الجودة). (ب) مجموعة تتحكم في الآثار المباشرة لـ FUS [FUS/No QA]؛ (ج) مجموعة تقيم الآثار المباشرة للوسم العصبي النظامي في حالة عدم وجود FUS [لا FUS/QA]. سيتم مقارنة النتائج في هذه المجموعات مع مجموعة PING الأساسية [FUS/QA].
تتطلب طريقة PING مهارات أساسية للتعامل مع الحيوانات الصغيرة. وتشمل هذه الحث وصيانة التخدير، ووضع خط الوريد الذيل، و الوريد إعطاء وكلاء متعددة في وضع وحدة التصوير بالرنين المغناطيسي، وضخ الوريد من المخدرات، ورعاية الحيوان خلال فترات المنطوق وما بعد الجراحة. كما أنه يتطلب القدرة على إجراء التسريب داخل القلب، وقطع الأنسجة، والتلطيخ الهسج الكيميائي، والتحليلات المجهرية. التدريب المؤسسي والموافقة من لجنة رعاية الحيوان واستخدامها، أو وكالة مماثلة، ضروري لعدة خطوات في البروتوكول.
استخدم البروتوكول الأولي لإجراء PING الحقن المتكرر داخل الصفاق من QA على مدى عدة أيام8,9. ولا يزال هذا النهج قابلا للتطبيق وفعّال. ومع ذلك، فإن البروتوكول الحالي عدّل مسار إدارة ضمان الجودة ومعدلها. على وجه الخصوص، كان تدار QA عن طريق الوريد خلال فترة 1 ح بعد sonication من التسريب. مرة أخرى، أي بروتوكول الإدارة فعالة. تم اعتماد فترة البقاء على قيد الحياة 4-5 اليوم المستخدمة في البروتوكول الحالي لتحسين استخدام طريقة الفلورو-اليشم للكشف عن الخلايا العصبية المتحللة. إذا كانت فترات البقاء على قيد الحياة أطول مطلوبة، ثم سيتم الإشارة إلى أساليب تلوين الأنسجة البديلة. أحد هذه النهج هو استخدام جسم مضاد خاص بالخلايا العصبية (على سبيل المثال ، مضاد NeuN) ، لإثبات الهistoistochemically حيث بقيت الخلايا العصبية الناجية بعد فترة البقاء على قيد الحياة بعد الصوتية الطولية. وسيكون من المفيد أيضاً التوصل إلى مجموعة متنوعة من النتائج، بالإضافة إلى التحليلات الهيكلية الحالية. على سبيل المثال، من شأن تقييمات ما بعد PING للنتائج الفسيولوجية الكهربائية والسلوكية أن تعزز بشكل كبير توصيف تأثير طريقة PING.
أحد المضاعفات المحتملة لإجراءات FUS هو أن درجات الحرارة يمكن أن ترتفع في محيط الجمجمة ، خاصة عند استهداف المناطق القشرية الموجودة بالقرب من الجمجمة. هذه المضاعفات حالياً تقيد نطاق المواقع (مغلف العلاج) القابلة للآفات الحرارية باستخدام FUS عالية الكثافة (HIFU). في سياق PING ، قد تمثل الزيادات الحرارية بالقرب من الجمجمة أيضًا قيودًا على التقنية. ومع ذلك، فإن انخفاض كثافة صوتنة المستخدمة مع PING يقلل من خطر الإصابة الحرارية، وينبغي توسيع المغلف العلاج بالمقارنة مع HIFU.
يمتلك أسلوب PING العديد من الميزات التي هي على حد سواء البنية التحتية المكثفة والتدريب المكثف. ويلزم وجود معدات للتصوير بالرنين المغناطيسي (FUS) ومنشأة للتصوير بالرنين المغناطيسي مجهزة للبحوث الحيوانية. ويمثل هذا استثماراً كبيراً في الواجهة الأمامية، من أجل توفير البنية الأساسية اللازمة للبحوث. ومع ذلك ، من المشجع أن نلاحظ أن عدد المواقع المجهزة بتكنولوجيا FUS يتوسع بسرعة لكل من المساعي البحثية والسريرية. وهكذا، ومع تزايد عدد المواقع المتاحة لأداء هذا العمل، ستزداد فرص إجراء التحقيقات في الموقع و/أو التعاون. ومن حيث التدريب، سيستفيد أي محقق يسعى إلى إجراء دراسات في مجال الإيدز من التدريب الذي تقوم به مجموعة بحثية من ذوي الخبرة في تجارب الـ FUS. على سبيل المثال، برنامج استهداف MRgFUS، في حين أن مباشرة نسبيا، يتم الحصول عليها بسهولة أكبر عندما نصح من قبل المحقق من ذوي الخبرة.
متعددة، وتوجد طرائق جراحية بديلة لإزالة الدوائر العصبية المضطربة. وتشمل هذه الجراحة resective، استئصال الليزر المجسم، الجراحة الإشعاعية، والموجات فوق الصوتية عالية الكثافة تركز، والعلاج الترددات الراديوية. كل من هذه النهج فعالة ويمكن أن تكون قيمة علاجية كبيرة لبعض الاضطرابات المستعصية طبيا. ومع ذلك، فإن هذه الطرائق الجراحية لها واحد أو أكثر من القيود المحددة: (أ) الإجراء الغازي، (ب) تأثير التآكل على النسيج المستهدف، (ج) الضرر الذي يلحق بالأنسجة المجاورة غير المستهدفة (مثل محاور المرور)، و(د) التأخر في تحقيق نتائج فعالة. وتتمثل المزايا الهامة لطريقة PING في أنها: (أ) غير غازية، (ب) ليست مُزَدِة، (ج) تحد من الآثار على الأنسجة غير المستهدفة المجاورة، و(د) ينبغي أن توفر نتائج سريعة.
هناك العديد من الاتجاهات المستقبلية المحتملة لطريقة PING ، بما في ذلك التطبيقات قبل السريرية والسريرية. فيما يتعلق بالتجارب على الحيوانات، توفر هذه الطريقة وسيلة لإنتاج آفات الخلايا العصبية البؤرية في النماذج قبل الكلينيكية للأمراض العصبية. على سبيل المثال، استخدمنا هذا النهج مؤخرا لاختبار تأثير PING في نموذج القوارض من الصرع الحوفي19. العلاج مع PING خفض وتيرة المضبوطات المزمنة، عفوية في نموذج pilocarpine من الصرع الحوفي. قدمت هذه الدراسة أول دليل قبل الكلينيكي على المفهوم للفائدة PING في علاج اضطراب عصبي.
تم اختيار حمض الكوينلينيك لإجراء PING لسببين رئيسيين. أولاً، يشير الأدب الحالي11 إلى أن آفات جسم الخلايا العصبية يمكن إنتاجها أثناء تجنيب الأنسجة الأخرى غير المستهدفة، مثل محاور المرور. ثانياً، على الرغم من أنَّ ضمان الجودة هو سُمَّي عصبي عندما يُسلَّم مباشرةً إلى الدماغ، إلا أنه يُحتمل بشكل جيد عندما يُدار بشكل نظامي بسبب نفاذيته المحدودة من خلال BBB. ويمكن اعتبار السموم الأخرى التي يتم تحملها بشكل جيد بشكل هامشي، مثل الغلوتامات أحادية الصوديوم (MSG)، كبدائل لـ QA. ومن المزايا الرئيسية ل MSG أن هناك مؤلفات كبيرة بشأن استخدام هذا المركب من قبل البشر. وسيكون من الأهداف الهامة للبحوث المستقبلية تحديد خصوصية الإصابة التي تنتجها ضمانة الجودة أو غيرها من السموم العصبية التي تدار بشكل منهجي من حيث خصوصية الخلايا المحتملة. تطبيق آخر محتمل قبل الظهر لهذا النهج العام هو إدارة مركب متحمل بشكل هامشي يكون سامًا لأنواع الخلايا الأخرى في الدماغ، مثل الخلايا الدبقية. على سبيل المثال، يمكن أن يسمح الحقن المحيطي للسموم التي تؤثر على oligodendroglia بديمالينية التركيز في منطقة من المواد البيضاء. وهذا من شأنه أن يسمح بإلهام جزئي مستهدف لجزء من المسار المستهدف. وعلاوة على ذلك، قد يسمح هذا النهج من المنظورات على نحو متصور بإجراء تقييمات لإزالة الغموض المتسلسلة لنفس الموقع، وهو ما يمثل سمة مميزة للتصلب المتعدد الذي يؤدي إلى الانتكاس.
وفيما يتعلق بالتطبيقات المستقبلية المحتملة من PING في البشر، والاضطرابات العصبية التي تكون فيها الدوائر العصبية المضطربة هدفا يمكن أن تكون قابلة للعلاج مع PING. استنادا إلى النتائج الأولية لدينا قبل الإكلينيكية19، الصرع المقاوم للأدوية (DRE) هو مثال واعد للاضطراب الذي قد يستفيد من PING. يمكن أن يكون العلاج الجراحي لـ DRE مفيدًا للغاية ، ولكنه يظل أحد العلاجات الأكثر نقصًا التي تكون فعالة فعليًا لاضطراب عصبي كبير. ميزة PING في هذا الإعداد هو أن حجم المنطقة المستهدفة يمكن أن تكون مطابقة وتضخم باستخدام سونيكيشنات المسلسل في مواقع متعددة. وهذا من شأنه أن يسمح باستهداف أكثر دقة لأهداف غير منتظمة الشكل والحجم غير المنتظم في parenchyma الدماغ. العملية الانتقالية لPING ستشمل بالضرورة اختبار لسلامة الإدارة النظامية QA في الرئيسيات غير البشرية، وفي نهاية المطاف في البشر. عادة ما يتم مسح مستقلبات الكيرينين من الدم عن طريق الكلى والقضاء عليها عن طريق التبول20,21; ومع ذلك، لم يتم تقييم مصير ضمان الجودة عن طريق الحقن في هذا النموذج. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ في هذا السياق أن المستويات العالية من QA تدار بشكل نظامي هي جيدة التحمل في القوارض. الأهم من ذلك، فإن استخدام PING لا يمنع معيار الرعاية العلاج. كانت العلاجات واحدة أو متعددة PING لإثبات عدم فعاليتها في مريض معين، ثم إجراءات أخرى، مثل جراحة resective أو ablative، وسوف تظل خيارات قابلة للتطبيق. ومن المهم أيضا أن ندرك أن البيئة السريرية التي تظهر فيها PING تستعد بشكل مثالي للترجمة والتنفيذ22،23،24،25،26. 4 - وتزداد سرعة صقل طرائق التصوير الهيكلي والوظيفي، مما سيسمح على نحو أفضل بتحديد الهدف المناسب (الأهداف) الملائمة للتدخلات الدقيقة. أيضا، ليست هناك حاجة لتصميم، والبناء، أو الموافقة على جهاز طبي جديد لPING. إنّ الـ(1) مُوجّه من MR،، عالية الكثافة،هو بالفعل طريقة راسخة ومُعتمدة لإشارات متعددة، بما في ذلك التطبيقات العصبية. وكما ذكر سابقا، شهدت السنوات الأخيرة انتشار المواقع التي يكون فيها فوس بالفعل في الاستخدام السريري. معا، هذه المزايا تشير إلى مسار واعد من التنمية لPING لتطبيقات متعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
الكتاب الاعتراف رينيه جاك روي لدعمه الفني الممتاز في مجال التصوير بالرنين المغناطيسي. وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 NS102194 إلى KSL و R01 CA217953-01 إلى MW)، وصندوق تشيستر (KSL)، ومؤسسة الموجات فوق الصوتية المركزة (KSL وJW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T-ClinScan MRI System | Bruker Biospin, Ettinglen, Germany | MR Image Acquisition | |
| Acoustic Gel | Litho CLEAR | 11-601 | High Viscosity Accoustic Transmission Gel |
| DPX Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 13512 | Resin Based Cover Glass Mountant |
| Fluoro-Jade B | EDM Millipore | AG310 | High Affinity Stain For Degenerating Neurons |
| Fluovac anesthetic adsorber | Harvard Apparatus | 34-0388 | Organic Anaesthesia Scavenger |
| FUS System | Image Guided Therapy, Pessac, France | LabFUS | MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System |
| Gadodiamide | GE Healthcare AS, Oslo, Norway | Omniscan | MR Contrast Agent |
| Heparin | SAGENT | NDC2502140010 | Anti-Coagulant |
| Hypodermic needle 30G x 1/2 | Becton-Dickinson | 26027 | Tail Vein Catheterization |
| Insulin syringe 28G1/2 (1ml) | EXEL | 26027 | Administration of Injectables to Tail Vein Catheter |
| Isofluorane atomizer | SurgiVet | VCT302 | Anaesthesia Administration |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC1169567762 | Anaesthesia |
| KMnO4 | Sigma | 223468 | Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining |
| Microbubbles | Produced internally: A. Klibanov | 305106 | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Microbubbles (commercial source) | Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA | Definity microbubbles | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments | Model 1030 | Respiration Monitoring |
| Multisizer 3 Coulter counter | Beckman-Coulter, Hialeah, FL | Multisizer 3 | Used to Determine Average Size of Microbubbles |
| Optixcare EYE LUBE | CLC MEDICA, Ontario, Canada | 11611 | Corneal Protectant-Eye Lube |
| PE10 tubing | Becton-Dickinson | 427401 | Tail Vein Catheter Component |
| Quinolinic Acid | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | CAS 89-00-9 | Neurotoxin |
| Sprague-Dawley Rats | Taconic Biosciences | SD-M | Rat Model |
| Syringe Pump | Carnegie Medicin | CMA 100 | Controlled Delivery of Quinolinic Acid |
| Thermoguide Software | Image Guided Therapy, Pessac, France | Thermoguide | Drives Lab FUS System |
| Tish Rats | In-house colony | Rat Model | |
| Veet depilatory cream | Reckitt Benckiser | Removal of Scalp Hair |
References
- Wiebe, S., Eliasziw, M., Matijevic, S. I. Changes in quality of life in epilepsy: How large must they be to be real. Epilepsia. 42, 113-118 (2001).
- McClelland, S., Guo, H., Okuyemi, K. S. Population-based analysis of morbidity and mortality following surgery for intractable temporal lobe epilepsy in the United States. Archives of Neurology. 68, 725-729 (2011).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhotseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: histological findings in rabbits. Ultrasound in Medicine & Biology. 31, 1527-1537 (2005).
- Park, J., Zhang, Y., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A., McDannold, N. J. The kinetics of blood brain barrier permeability and targeted doxorubicin delivery into brain induced by focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 162 (1), 134-142 (2012).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in the presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30, 979-989 (2004).
- Vlachos, F., Tung, Y. S., Konofagou, E. E. Permeability assessment of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using dynamic contrast-enhanced MRI. Physics in Medicine and Biology. 55 (18), 5451-5466 (2010).
- Zhang, Y., et al. focal disconnection of brain circuitry using magnetic resonance-guided low-intensity focused ultrasound to deliver a Neurotoxin. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (9), 2261-2269 (2016).
- Zhang, Y., et al. Testing different combinations of acoustic pressure and doses of quinolinic acid to induce focal-neuron loss in mice using transcranial low-intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 45, 129-136 (2018).
- Foster, A. C., Miller, L. P., Oldendorf, W. H., Schwarcz, R. Studies on the disposition of quinolinic acid after intracerebral or systemic administration in the rat. Experimental Neurology. 84, 428-440 (1984).
- Beskid, M., Różycka, Z., Taraszewska, A. Quinolinic acid: effect on the nucleus arcuatus of the hypothalamus in the rat (ultrastructural evidence). Experimental and Toxicologic Pathology. 49, 477-481 (1997).
- Schwarcz, R., Köhler, C. Differential vulnerability of central neurons of the rat to quinolinic acid. Neuroscience Letters. 38, 85-90 (1983).
- Schwarcz, R., Whetsell, W. O., Mangano, R. M. Quinolinic acid: an endogenous metabolite that produces axon-sparing lesions in rat brain. Science. 219, New York, N.Y. 316-318 (1983).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Agari, T., et al. Successful treatment of epilepsy by resection of periventricular nodular heterotopia. Acta Medica Okayama. 66 (6), 487-492 (2012).
- Lee, K. S., et al. A genetic animal model of human neocortical heterotopia associated with seizures. The Journal of Neuroscience. 17 (16), 6236-6242 (1997).
- Schottler, F., Couture, D., Rao, A., Kahn, H., Lee, K. S. Subcortical connections of normotopic and heterotopic neurons in sensory and motor cortices of the tish mutant rat. The Journal of Comparative Neurology. 395 (1), 29-42 (1998).
- Schottler, F., et al. Normotopic and heterotopic cortical representations of mystacial vibrissae in rats with subcortical band heterotopia. Neuroscience. 108 (2), 217-235 (2001).
- Zhang, Y., et al. Effects of non-invasive, targeted, neuronal lesions on seizures in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Ultrasound in Medicine and Biology. 46, 1224-1234 (2020).
- Holmes, E. W. Determination of serum kynurenine and hepatic tryptophan dioxygenase activity by high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 518-525 (1988).
- Shibata, K., Ohno, T., Sano, M., Fukuwatari, T. The urinary ratio of 3-hydroxykynurenine/3-hydroxyanthranilic acid is an index of predicting the adverse effects of D-trytophan in rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminology. 60, 261-268 (2014).
- Aubry, J. -F., Tanter, M. MR-guided transcranial focused ultrasound. Therapeutic Ultrasound. , 97-111 (2016).
- Elias, W. J., et al. A Randomized trial of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 375, 730-739 (2016).
- Ghanouni, P., et al. Transcranial MR-guided focused ultrasound: a review of the technology and neuro applications. American Journal of Roentgenology. 205, 150-159 (2015).
- Martin, E., Jeanmonod, D., Morel, A., Zadicario, E., Werner, B. High-intensity focused ultrasound for noninvasive functional neurosurgery. Annals of Neurology. 66, 858-861 (2009).
- Monteith, S., et al. Transcranial magnetic resonance-guided focused ultrasound for temporal lobe epilepsy: a laboratory feasibility study. Journal of Neurosurgery. 12, 1-8 (2016).
