Summary
מטרת הפרוטוקול היא לספק שיטה לייצור נגעים עצביים לא פולשניים במוח. השיטה משתמשת אולטרסאונד ממוקד מונחה תהודה מגנטית (MRgFUS) כדי לפתוח את מחסום מוח הדם באופן ארעי ומוקד, על מנת לספק רעלן עצבי במחזור לפארנצ'ימה במוח.
Abstract
התערבות כירורגית יכולה להיות יעילה למדי לטיפול בסוגים מסוימים של מחלות נוירולוגיות בלתי הפיכות מבחינה רפואית. גישה זו שימושית במיוחד עבור הפרעות שבהן מעגלים עצביים הניתנים לזיהוי ממלא תפקיד מפתח, כגון אפילפסיה והפרעות תנועה. כיום זמין שיטות כירורגיות, בעוד יעיל, בדרך כלל כרוך הליך כירורגי פולשני, אשר יכול לגרום פגיעה כירורגית ברקמות שאינן היעד. כתוצאה מכך, זה יהיה בעל ערך כדי להרחיב את מגוון הגישות כירורגיות לכלול טכניקה שהיא גם לא פולשנית וגם neurotoxic.
כאן, שיטה מוצגת לייצור נגעים מוקד, עצביים במוח באופן לא פולשני. גישה זו מנצלת אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה יחד עם microbubbles תוך ורדי כדי לפתוח ארעי ומוקד את מחסום מוח הדם (BBB). התקופה של פתיחת BBB ארעי מנוצל לאחר מכן כדי לספק באופן מוקדי רעלן עצבי מנוהל באופן שיטתי לאזור מוח ממוקד. חומצה קווינולנית neurotoxin (QA) הוא בדרך כלל BBB-חסין, והוא נסבל היטב כאשר מנוהל תוך אפרטינולי או דרך ויריד. עם זאת, כאשר QA מקבל גישה ישירה רקמת המוח, זה רעיל לנוירונים. שיטה זו שימשה חולדות ועכברים כדי למקד אזורים ספציפיים במוח. מיד לאחר MRgFUS, פתיחה מוצלחת של BBB מאושר באמצעות ניגודיות משופרת T1 המשוקלל הדמיה. לאחר ההליך, T2 הדמיה מראה פציעה מוגבלת לאזור ממוקד של המוח ואובדן של נוירונים באזור ממוקד יכול להיות מאושר לאחר המוות ניצול טכניקות היסטולוגיות. במיוחד, בעלי חיים מוזרקים עם תמיסת מלח ולא QA להפגין פתיחת BBB, אבל נקודה לא להפגין פציעה או אובדן עצבי. שיטה זו, נוי מדויק תוך-erebral לא פולשנית ניתוח מודרך (PING) יכול לספק גישה לא פולשנית לטיפול בהפרעות נוירולוגיות הקשורות הפרעות במעגלים עצביים.
Introduction
מטרת שיטה זו היא לספק אמצעי לייצור נגעים עצביים לא פולשניים באזור ממוקד של המוח. הרציונל לפיתוח גישה כזו הוא לנתק מעגלים עצביים התורמים להפרעות נוירולוגיות. לדוגמה, ניתוח יכול להיות יעיל למדי בטיפול בהפרעות נוירולוגיות מסוימות מבחינה רפואית בלתי הפיכות, כגון אפילפסיה עמידים לתרופות (DRE)1. עם זאת, כל אחת מהן הדרכים הכירורגיות הזמינות יש מגבלות במונחים של ייצור נזק משני לא רצוי למוח. ניתוח resective מסורתי יכול להיות פולשני מאוד עם הסיכון לדימום, זיהום, קרישי דם, שבץ מוחי, התקפים, נפיחות של המוח, ונזק עצבי2. חלופות לניתוח resective כי הם פולשניים או לא פולשניים כוללים טיפול תרמי interstitial לייזר ורדיוכירורגיה, אשר גם הוכיחו להיות יעיל בדיכוי התקפים ב DRE. לאחרונה, נגעים תרמיים המיוצרים על ידי אולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה (HIFU) הראו הבטחה בהפחתת התקפים. HIFU הוא לא פולשני; עם זאת, חלון הטיפול שלה מוגבל כיום לאזורים מרכזיים יותר של המוח בשל הסיכון של פגיעה תרמית ברקמה שאינה מטרה הממוקמת בקרבת הגולגולת. למרות מגבלות כאלה, היתרונות של ניתוח לעתים קרובות עולים על הסיכונים הפוטנציאליים. לדוגמה, למרות ניתוח עבור DRE יכול לייצר נזק מוחי משני, השפעותיו המועילות בדיכוי התקפים ושיפור איכות החיים בדרך כלל גוברים על הסיכונים הכירורגיים.
השיטה המתוארת בזאת, ניתוח מונחה לא פולשני (PING) תוך-פולשנית מדויקת, פותחה לצורך ניתוק מעגלים עצביים, תוך הגבלת נזק מוחי משני. השיטה משתמשת בעוצמה נמוכה ממוקד אולטרסאונד בשילוב עם הזרקה תוך ורדי של microbubbles כדי לפתוח את BBB, על מנת לספק רעלן עצבי. גישה זו אינה מייצרת נגעיםתרמיים למוח 3,4,5,6,7, ואת תקופת פתיחת BBB ניתן לנצל כדי לספק תרכובות BBB-מושלם לפארנצ'ימה במוח. הפתיחה של BBB הוא ארעי, והוא יכול להיות מיוצר באופן ממוקד באמצעות הדרכת הדמיית תהודה מגנטית. במחקרים שלנו, התקופה של פתיחת BBB נוצלה כדי לספק רעלן עצבי במחזור לאזור ממוקד של parenchyma המוח בחולדות ועכברים8,,9. חומצה קווינולנית היא רעלן עצבי נסבל היטב כאשר מנוהלדרך ויריד 10, תוךאוארטירי 10,או תוך אפרטינולי,8,9,,11. חוסר רעילות QA נובע חדירות BBB עניים שלה, אשר דווח להיות זניח10. לעומת זאת, הזרקה ישירה של QA לתוך parenchyma במוח מייצרת נגעים עצביים החוסכים אקסוניםשכנים 12,,13. לכן, כאשר במחזור QA מקבל גישה parenchyma המוח באזור ממוקד של פתיחת BBB, מוות עצבי מיוצר8,9. השיטה הנוכחית מייצרת אפוא אובדן עצבי מוקדי באופן ממוקד ולא פולשני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת וירג'יניה.
1. הכנת ריאה
- ביום הניתוח, להכין 6.0 מ"ל של חומצה קווינולנית להזרקה (QA). להמיס 450 מ"ג של QA ב 4.0 מ"ל של 1.0 N NaOH. הוסף 0.6 מ"ל של PBS 10x, pH כדי 7.4, ולהביא לנפח הסופי של 6.0 מ"ל עם dH2O. לסנן דרך מסנן מזרק 0.22 μm. הפתרון יציב למשך שבועיים ב- 4 °C.
- להכין פיזור מים של microbubbles בתמיסת מלח רגילה על ידי sonication בדיקה מגז נטול קפאילואורובוטאן ולייצב עם מעטפת מונו-שכבתית stearate DSPC / PEG12.
- גודל microbubbles על ידי ציפה בכוח המשיכה נורמלי. לקבוע ריכוז וגודל microbubble על ידי חישת electrozone באמצעות מונה Multisizer III. ריכוז Microbubble והתפלגות גודל צריך להיות 6 x10 8/mL ו ~ 2 μm (קוטר חלקיקים ממוצע), בהתאמה. הבועות הגדולות ביותר מוסרות על ידי הדרת ציפה/הפרדה.
- לחלופין, לרכוש microbubbles זמין מסחרית.
2. הכנת בעלי חיים
- התאקלם בעל החיים (עכברוש או עכבר) במשך 3 ימים לאחר הלידה. הניסויים המתוארים כאן השתמשו חולדות ספראג-דאולי (5-6 שבועות של גיל) או טלנספלית פנימית הטרוטופיה (טיש) חולדות (מושבה מקומית).
- לשכון את בעלי החיים תחת אור של 12 שעות: מחזור חשוך של 12 שעות.
- להקליט את המשקולות של החיות. מידע זה חשוב לאורך כל ההליך.
- השג תמונות MR משוקללות T2 יום לפני הליך FUS כדי ליצור תמונות בסיסיות לפני הניתוח. השתמש בפרמטרים הבאים עבור הדמיית T2: זמן חזרה/זמן הד [TR/TE] =3,000/138 אלפיות השניה, 3 ממוצעים, שדה תצוגה = 29 x 45 מ"מ2, גודל מטריצה = 125 x 192, עובי פרוסה = 0.23 מ"מ.
- להנות את החיה עם isoflurane (4% אינדוקציה, 2% תחזוקה). אשר עומק הולם של הרדמה באמצעות צביטה בהוהן. מורח משחה אופטלמית על העיניים.
- לגלח את הקרקפת של החיה, ולהסיר את השיער הנותר עם קרם depilatory.
- השתמש בצנתר ורין זנב עבור אינפוזיה של microbubbles, סוכן ניגודיות, וQA. הצנתרים מורכבים מאורך של צינורות PE10 המצוידים במחט בגודל 30 גרם x 1/2 אינץ'. השאר מזרק 1 מ"ל עם תמיסת מלח עם הפרין בתור, כדי להסיר ולקובר מחדש כאשר הקו משמש לעירויים.
3. נהלי MRI ו-PING
- בצע את ה-MRI ביחידת MR 7 T עם חוזק הדרגתי של 600 mT/m/ms(איור 1 ואיור 2). בצע רכישות MRI באמצעות תסיל משטח המשולב במערכת FUS.
הערה: מערכת FUS המשמשת לניסויים מורכבת משלושה חלקים: (i) מערכת sonication היא MR תואם מראש ממוקד, מערך טבעתי של 8 אלמנטים, מתמר של 1.5 מגה-הרץ (רדיוס כדורי = 20 מ"מ ± 2 מ"מ, קוטר פעיל = 25 מ"מ (מספר f = 0.8), עם יעילות חשמלית-אקוסטית של 80% המחובר למחולל מערך בשלבים ולמעבר כוח RF; (2) שלב מיקום ממונע תואם MR כדי להזיז את מתמר בכיוון הקדמי-אחורי וכיוון בינוני-רוחבי; (iii) תחנת עבודה תרמוגיד כדי לשלוט באספקת sonication, כולל התמקדות אלקטרונית דרך אפנון שלב כדי להתאים את עומק המוקד (איור 2). - מקם את החיה המהדינה על מכלול מזחלות הבולבול (איור 1) של מערכת FUS תואמת MR במצב נוטה. לשתק את החיה באמצעות בר שן החותך ואוזניות מעורבים בערש המזחלת.
- למרוח ג'ל אקוסטי על הקרקפת הרטובה במים; כדי להבטיח שלא קיימות בועות, מקם את מחסום הממברנה של חלק מחזור המים של מכלול מתמר מעל גולגולת החיה, ולהוריד את מכלול מתמר ככל האפשר בכיוון מישור מקביל יחסית לצלחת הגולגולת. מניחים את הסרעפת של מתמר בחוזקה נגד הקרקפת המגולחת של החיה ישירות מעל צלחת הגולגולת.
- חבר חיישן פנאומטי לגוף עם סרט כירורגי, כדי לפקח על הנשימה. מקם את החיישן הפניאומטי בכלוב הצלעות השמאלי התחתון.
- הזז את מכלול זרוע FUS עם אסיל, מזחלת ובעלי חיים לתוך יחידת MRI 7T(איור 1).
- הפעל רצף T2-scout כדי לקבוע את המיקום הפיזי הכללי של מכלול מתמר ביחס לראשו של בעל החיים, ובצע התאמות מכניות כנדרש(איור 2). הפרמטרים עבור הדמיית T2 הם: זמן חזרה/זמן הד [TR/TE] = 3,000/138 אלפיות השנייה, 3 ממוצעים, שדה תצוגה = 29 x 45 מ"מ2, גודל מטריצה = 125 x 192, עובי פרוסה = 0.23 מ"מ. בדרך כלל לא נעשה שימוש בתרמומטריה בפרוטוקול זה.
- השג תמונות T2 כדי למקד את מיקום המתמר. בדיוק, להגדיר את מיקום מתמר ולציין את נקודות המוקד של sonication באמצעות פונקציית פילוח של התוכנה. הפרמטרים עבור הדמיית T2 הם: זמן חזרה/זמן הד [TR/TE] = 3,000/138 אלפיות השנייה, 3 ממוצעים, שדה תצוגה = 29 x 45 מ"מ2, גודל מטריצה = 125 x 192, עובי פרוסה = 0.23 מ"מ.
- רק לפני sonication, להזריק 300 μL / ק"ג של microbubbles14 דרך ווורוד הזנב.
- השתמש מתמר 1.5 MHz כדי לייצר sonications (30 ms גל מנות, 3% מחזור עבודה, 1 הרץ פרץ תדר חזרה, 240 s משך / sonication.
- מיד לאחר sonication, להזריק סוכן ניגוד gadodiamide דרך וריד הזנב, ולאחר מכן לבצע T1 משוקלל בתוספת סריקות ניגוד כדי לאשר את הפתיחה של BBB ואת הדיוק של פילוח. הפרמטרים עבור הדמיה משוקללת T1: TR/TE = 900/12 אלפיות השניה, 2 ממוצעים, שדה תצוגה = 24 x 30 מ"מ2, גודל מטריצה = 208 x 256, עובי פרוסה = 0.7 מ"מ. בדרך כלל, מתבצעת סריקת T1 אחת.
- הסר את זרוע ה-FUS והמזחלת מה-MRI, והניח את החיה על משטח חימום המוכן ל-40°C, תוך שמירה על הרדמה איזו-פלורנית של 2%.
- החל 30 דקות לאחר sonication, להשתמש במשאבת מזרק כדי להחזר QA (75 מ"ג / מ"ל פתרון מניות) דרך ויריד הזנב במשך 1 שעה בקצב של 16.8 μL/min כדי להשיג מינון סופי של 225 מ"ג / ק"ג (q.s. כדי 1.0 מ"ל תמיסת מלח).
- עם השלמת האינפוזיה, יש להפסיק את ההרדמה, ולשמור את החיה על משטח חימום עד להתראה. מניחים את החיה בכלוב ומחפשים בדיקות שגרתיות לפעילותה כל 15 דקות, במשך מספר שעות לאחר ההליך.
- מחזירים את החיה לוויבריום ובדקו כל 6 שעות ביום הראשון למצוקה או לפעילות לא סדירה.
- יום אחד לאחר sonication, לבצע T2 משוקלל MR הדמיה כדי להעריך את כל הנזקים בתחום sonication. הפרמטרים עבור הדמיית T2: זמן חזרה/זמן הד [TR/TE] = 3,000/138 אלפיות השניה, 3 ממוצעים, שדה תצוגה = 29 x 45 מ"מ2, גודל מטריצה = 125 x 192, עובי פרוסה = 0.23 מ"מ. תמונות מוערכות עבור אזורים של היפר-נטיות כדי לזהות נזק אפשרי לרקמות / בצקת.
4. ניתוח שלאחר המוות של אובדן עצבי
- לאפשר שלאחר sonication, תקופת הישרדות של 4-5 ימים להערכת אובדן עצבי עם היסטוכימיה Fluoro-Jade.
- להרדמה עמוקה של החיה עם isoflurane, ולהמתת דם באמצעות עירוי פנים-לב עם מאגר פוספט 0.1 M (pH 7.4) ואחריו 4% paraformaldehyde במאגר פוספט.
- מוציאים את המוח מהגולגולת ופוסט-פיקס במשך יומיים ב-4% פארפורמלדהיד.
- לטבול את המוח ב 30% סוכרוז עבור cryoprotection, ולחתוך קטעים בעובי של 20-30 μm עם cryostat.
- הר קריוסטה קטעים על מגלשות ג'לטין אוויר יבש בן לילה.
- לאחר מכן מתייבשים באתנולים מדורגים עולים. לאחר התייבשות, להתייבש שקופיות אתנול מדורג יורד.
- מעבירים שקופיות לפתרון של 0.06% אשלגן במשך 15 דקות על שייקר מסלולי.
- לשטוף שקופיות במשך 1 דקות במים מזוקקים ולהעביר לפתרון 0.001% של Fluoro-Jade B ב 0.1% חומצה אצטית. דגירה תחת תסיסה עדינה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף שקופיות שלוש פעמים במשך 1 דקות במים מזוקקים.
- יבש את השקופיות על מחמם שקופיות, השתוות בקסילן למשך 3 דקות, וכיסוי באמצעות מדיה להרכבה של DPX.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה מתאר את ההשפעה של PING על נוירונים הממוקמים דיספלזיה neocortical. דיספלזיה רקמות הן תכונה נפוצה במוחם של חולים עם אפילפסיה עמידים לתרופות, והסרה כירורגית של פיספלזיה התקף-גנית יכול לספק שליטה מצוינת שלהתקפים 15. הגדרת ההשפעה של PING על רקמת מוח dysplastic היא ולכן עדיפות חשובה. מודל חולדה של דיספלזיה קליפתית גנטית, חולדת טיש, נבחר לחקר בעיה זו כי המוח טיש מציג רקמה דיספלסטית (הטרוטופיה רצועה subcortical) ממוקם מתחת neocortex ממוקם בדרך כלל (איור 3)16. הן ההתעוות והן הניאו-קודקודה של תפוצת הנוי-קודס מכילים נוירוניםפונקציונליים ומציגים קישוריות ניאו-קליפטית אופיינית 17,18.
פינג מיקוד ההטרוטופיה של המוח חולדת טיש היה יעיל בייצור אובדן עצבי מוקד של נוירונים דיספלסטיים(איור 3). תמונות משוקללות T2 שצולמו יום אחד לאחר PING להציג אזורים של hyperintensity, עולה בקנה אחד עם נזק לרקמות באזורים ממוקדים של sonication. כתמים שלאחר המוות באמצעות Fluoro-Jade לאחר 5 ימים לאחר PING תקופת הישרדות הפגינו נוירונים ניוון באזורים של היפר-תחכום T2, אימות היכולת של PING לייצר אובדן עצבי ברקמה neocortical dysplastic ממוקד.
איור 1: מזחלת תואמת תהודה מגנטית (MR) ומגנט MR 7T. התכונות העיקריות של המזחלת המשמשות למיקום בעל החיים במגנט MR ולספק sonication מתוארים (A). מכלול המזחלת מוצג מוכנס לתוך מגנט MR 7T (B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: חדר בקרה עבור הדמיית תהודה מגנטית (MR) ואולטרסאונד ממוקד מונחה MR (FUS). חדר הבקרה כולל שתי תחנות עיקריות. התחנה שבה יושב החוקר היא אזור התכנון לצורך מיקוד FUS (A). התחנה השנייה היא אזור הבקרה של מערכת ה-MRI (B). החלון מחוזק נחושת מאחורי תחנת ה-MRI מסתכל לתוך החדר דיור מגנט 7T. הצג בתחנת FUS מציג את התוכנה השולטת בהדרכה ובפרמטרים של sonication (C). דוגמה זו מציגה sonication מיקוד סטריאטום על תמונת MR משוקלל T2 (D). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: פינג מייצר אובדן עצבי בneocortex dysplastic של מוח חולדת טיש. תמונות MR משוקללות T2 (A,B) הושגו יום אחד לאחר PING. הניאוקורטקס [N], ההטרוטופיה [H], והברום לרוחב [LV] מסומנים לצורך התמצאות (א). אזורים של היפר-נטיות [חצים לבנים וצהובים], המעידים על נזק לרקמות, ניתן לראות באזורים הממויקודים של ההטרוטופיה משני צידיהמוח (ב). כתמים שלאחר המוות עם פלואורו-ג'ייד(C-F). תאים ירוקים בהירים המייצגים נוירונים ניוונים נצפים באזורים המתאימים לאזורים של היפר-תחכום הן בצד שמאל(C,E; חציםלבנים) והן בצדי ימין(D,F; חצים צהובים) של המוח. סדרות קנה מידה: C,D = 1 מ"מ; E, F = 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת PING נועדה לייצר נגעים עצביים לא פולשניים, ממוקדים. השיטה נובעת בסיס חזק וגדל של מחקר בתחום של אולטרסאונד ממוקד3, 4,5,,6,7.4, היכולת לספק גישה מוקד לאזורים ספציפיים של parenchyma המוח באמצעות פתיחה ארעית של BBB יצר השדרה לספק מגוון רחב של סוכנים שבדרך כלל לא לקבל גישה למוח. הזדמנות זו היא בעיקר להיות מתקדם עבור המסירה המרכזית של סוכנים טיפוליים בעלי חחלת BBB עניים. שיטת PING ממנפת את אותה הזדמנות באופן שונה על ידי אספקת רעלן עצבי, במטרה הסופית להרוס מעגלים שתורמים לתפקוד נוירולוגי לקוי. מעגלים עצביים חריגים מייצגים מטרה יעילה להתערבות כירורגית כדי להשבית את ההשפעה של הפרעות נוירולוגיותמסוימות 2,,15. המטרה ארוכת הטווח של שיטת PING היא להגדיל את הגישות הזמינות כיום לניתוק מעגלים התורמים לתפקוד העצבי.
העיצוב של מחקר מקיף באמצעות שיטת PING ישלב קבוצות בקרה מרובות. קבוצות אלה יכללו: (א) קבוצה לא מטופלת [ללא FUS/ללא QA]; (ב) קבוצה השולטת על ההשפעות הישירות של FUS [FUS/No QA]; (ג) קבוצה המעריכה את ההשפעות הישירות של רעלן עצבי מערכתי בהיעדר FUS [ללא FUS/QA]. התוצאות בקבוצות אלה ישוו לקבוצה PING הראשית [FUS/QA].
שיטת PING דורשת כישורים בסיסיים לטיפול בבעלי חיים קטנים. אלה כוללים אינדוקציה ותחזוקה של הרדמה, מיקום של קו ויריק זנב, ניהול תוך ורדי של סוכנים מרובים בהגדרה של יחידת MRI, אינפוזיה תוך וורי של תרופה, וטיפול בבעלי חיים במהלך התקופות הניתוח ולאחר הניתוח. זה גם דורש את היכולת לבצע עירוי פנים-לב, מקטע רקמות, כתם היסטוכימי, וניתוחים מיקרוסקופיים. הכשרה מוסדית ואישור של ועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים, או סוכנות מקבילה, נחוצים לכמה מהצעדים בפרוטוקול.
הפרוטוקול הראשוני עבור הליך PING השתמש הזרקה תוך-אפריטונאלית חוזרת של QA על פני מספרימים 8,9. גישה זו עדיין בת קיימא ויעילה. עם זאת, הפרוטוקול הנוכחי שינה את הנתיב ואת הקצב של ניהול QA. בפרט, QA היה מנוהל דרך הוויתור במהלך 1 שעה לאחר sonication תקופה של אינפוזיה. שוב, כל פרוטוקול ניהול יעיל. תקופת ההישרדות של 4-5 ימים מנוצלת בפרוטוקול הנוכחי אומצה כדי לייעל את השימוש בשיטת Fluoro-Jade לזיהוי נוירונים מנוונים. אם נדרשות תקופות הישרדות ארוכות יותר, אז שיטות חלופיות הכתמת רקמות יהיה מצוין. גישה אחת כזו תהיה להשתמש בנוגדן ספציפי לנוירון (למשל, אנטי-נוימן), כדי להפגין אימונוהיסטוכימי שבו הנוירונים ששרדו נשארו לאחר תקופת הישרדות ממושכת יותר לאחר sonication. מגוון תוצאות, בנוסף לניתוחים המבניים הנוכחיים, יהיו שימושיים גם כן. לדוגמה, הערכות שלאחר PING של תוצאות אלקטרופיזיולוגיות והתנהגותיות יקדמו באופן משמעותי את אפיון ההשפעה של שיטת PING.
סיבוך פוטנציאלי אחד של הליכי FUS הוא כי הטמפרטורות יכול להיות גבוה בקרבת הגולגולת, במיוחד כאשר מיקוד אזורים קליפתיים הממוקמים ליד הגולגולת. סיבוך זה מגביל כיום את מגוון האתרים (מעטפת הטיפול) הניתנים לפליטה תרמית באמצעות FUS בעוצמה גבוהה (HIFU). בהקשר של PING, עליות תרמיות ליד הגולגולת עשויות לייצג גם מגבלה של הטכניקה. עם זאת, העוצמה הנמוכה של sonication בשימוש עם PING מפחית את הסיכון לפציעה תרמית, וצריך להרחיב את מעטפת הטיפול לעומת HIFU.
שיטת PING כוללת מספר תכונות עתירות תשתית ועתושות הכשרה. ציוד FUS תואם MRI ומתקן MRI המצויד לחקר בעלי חיים נדרשים. מדובר בהשקעה חזיתית ניכרת, על מנת לספק את תשתית המחקר הנחוצה. עם זאת, זה מעודד לציין כי מספר האתרים המצוידים בטכנולוגיית FUS מתרחב במהירות הן למחקר והן למאמצים קליניים. לפיכך, ככל שמספר האתרים הזמינים לביצוע עבודה כזו יגדל, יגדלו ההזדמנויות לחקירה באתר ו/או לחקירה שיתופית. במונחים של הכשרה, כל חוקר המבקש לבצע מחקרי FUS ירוויח מהכשרה על ידי קבוצת מחקר מנוסה בניסויים FUS. לדוגמה, תוכנת פילוח MRgFUS, אמנם פשוטה יחסית, נרכשת בקלות רבה יותר כאשר מומלץ על ידי חוקר מנוסה.
מספר רב של שיטות כירורגיות חלופיות קיימות להסרת מעגלים עצביים מופרעים. אלה כוללים ניתוח resective, אבלציה לייזר סטריאוטיפית, רדיוכירורגיה, אולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה, וטיפול בתדר רדיו. כל אחת מהגישות הללו יעילה, יכולה להיות בעל ערך טיפולי ניכר עבור הפרעות מסוימות מבחינה רפואית בלתי הפיכות. עם זאת, שיטות כירורגיות אלה יש מגבלות ספציפיות אחת או יותר: (א) הליך פולשני, (ב) השפעה pannecrotic על רקמת היעד, (ג) נזק לרקמות סמוכות, לא יעד (למשל, אקסונים של מעבר), ו (ד) עיכוב בהשגת תוצאות אפקטיביות. יתרונות משמעותיים של שיטת PING הם שזה: (א) הוא לא פולשני, (ב) אינו pannecrotic, (ג) מגביל השפעות על רקמת יעד סמוכה, ו -(ד) צריך לספק תוצאות מהירות.
ישנם מספר כיוונים עתידיים פוטנציאליים עבור שיטת PING, כולל יישומים פרה-קליניים וקליניים. ביחס לניסויים בבעלי חיים, השיטה מספקת אמצעי לייצור נגעים עצביים מוקדיים במודלים פרה-סרטיים של מחלות נוירולוגיות. לדוגמה, השתמשנו לאחרונה בגישה זו כדי לבדוק את ההשפעה של PING במודל מכרסמים של אפילפסיהלימבית 19. טיפול עם PING הפחית את התדירות של כרוני, התקפים ספונטניים במודל pilocarpine של אפילפסיה לימבית. מחקר זה סיפק את ההוכחה הראשונה, פרה-לקלינלית של מושג עבור השירות של PING בטיפול בהפרעה נוירולוגית.
חומצה קווינולנית נבחרה עבור הליך PING משתי סיבות עיקריות. ראשית, ספרותקיימת 11 מציין כי נגעים בגוף תא עצבי יכול להיות מיוצר תוך חסכות רקמה אחרת שאינה היעד, כגון אקסונים של מעבר. שנית, למרות QA הוא neurotoxic כאשר נמסר ישירות למוח, זה נסבל היטב כאשר מנוהל באופן שיטתי בגלל חירנות מוגבלת שלה דרך BBB. רעלים אחרים כי הם נסבלים היטב באופן היקפי, כגון מונוסודיום גלוטמט (MSG), יכול להיחשב כחלופות עבור QA. יתרון מרכזי של MSG יהיה כי קיימת ספרות משמעותית לגבי השימוש במתחם זה על ידי בני אדם. מטרה חשובה למחקר עתידי תהיה להגדיר את הספציפיות של פציעה המיוצרת על ידי QA או רעלנים עצביים אחרים המנוהלים באופן שיטתי במונחים של ספציפיות אפשרית מסוג תא. יישום פרה-לקלינלי פוטנציאלי נוסף לגישה כללית זו יהיה לנהל תרכובת נסבלת היקפית כי הוא רעיל לסוגי תאים אחרים בפנצ'ימה במוח, כגון תאי גליה. לדוגמה, הזרקה היקפית של רעלן המשפיע על oligodendroglia יכול לאפשר demyelination מוקד באזור של חומר לבן. זה יאפשר demyelination ממוקד של חלק ממסלול ממוקד. יתר על כן, הגישה עשויה לאפשר הערכות של demyelination סדרתי של אותו אתר, שהוא סימן ההיכר של טרשת נפוצה relapsing-remitting.
ביחס ליישומים העתידיים האפשריים של פינג בבני אדם, הפרעות נוירולוגיות שבהן מעגלים עצביים מופרעים הם מטרה יכולה להיות אפשרית לטיפול ב-PING. בהתבסס על הממצאים הקדם-נקטלייםהראשוניים שלנו 19, אפילפסיה עמידים לתרופות (DRE) היא דוגמה מבטיחה של הפרעה שעשויה להפיק תועלת PING. טיפול כירורגי של DRE יכול להיות מאוד מועיל, אבל נשאר אחד הטיפולים המנופחות ביותר כי הוא למעשה יעיל עבור הפרעה נוירולוגית גדולה. יתרון של PING בהגדרה זו הוא כי נפח של אזור היעד יכול להיות תואם ומוגדל על ידי ניצול sonications טורי באתרים מרובים. זה יאפשר מיקוד מדויק יותר של מטרות בצורה לא סדירה בגודל לא סדיר בפנצ'ימה במוח. תהליך התרגום עבור PING בהכרח יכלול בדיקות לבטיחות של ניהול מערכתי של QA בפרימטים לא אנושיים, ובסופו של דבר בבני אדם. מטבוליטים Kynurenine בדרך כלל פינה מהדם דרך הכליות ובוטל באמצעות מתןשתן 20,21; עם זאת, גורלו של QA מוזרק לא הוערך במודל זה. עם זאת, חשוב לציין בהקשר זה כי רמות גבוהות של QA מנוהל באופן שיטתי נסבלים היטב מכרסמים. חשוב לציין, השימוש ב-PING לא ימנע טיפול סטנדרטי. היו יחיד או טיפולי PING מרובים להוכיח לא יעיל בחולה נתון, אז הליכים אחרים, כגון ניתוח resective או פולשני, יישאר אפשרויות קיימא. חשוב גם להכיר בכך שהסביבה הקלינית שבה PING תצוץ היא יציבהבאופן אידיאלי לתרגום ויישום 22,23,24,25,26. אמצעי הדמיה מבניים ופונקציונליים הופכים במהירות מעודן יותר, אשר יאפשר טוב יותר זיהוי של יעדים מתאימים להתערבויות מדויקות. כמו כן, אין צורך בעיצוב, בנייה או אישור של מכשיר רפואי חדש עבור PING. FUS מונחה MR, בעוצמה גבוהה הוא כבר מודאליות מבוססת ומאושרת עבור אינדיקציות מרובות, כולל יישומים נוירולוגיים. ו, כאמור קודם לכן, השנים האחרונות היו עדים להתפשטות של אתרים שבהם FUS כבר נמצא בשימוש קליני. יחד, יתרונות אלה מציעים קורס מבטיח של פיתוח עבור PING עבור יישומים מרובים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מזהים את רנה ג'ק רוי על תמיכתו הטכנית המצוינת בתחום ה-MRI. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 NS102194 ל KSL ו R01 CA217953-01 ל-MW), קרן צ'סטר (KSL) וקרן אולטרסאונד ממוקדת (KSL ו-JW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T-ClinScan MRI System | Bruker Biospin, Ettinglen, Germany | MR Image Acquisition | |
| Acoustic Gel | Litho CLEAR | 11-601 | High Viscosity Accoustic Transmission Gel |
| DPX Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 13512 | Resin Based Cover Glass Mountant |
| Fluoro-Jade B | EDM Millipore | AG310 | High Affinity Stain For Degenerating Neurons |
| Fluovac anesthetic adsorber | Harvard Apparatus | 34-0388 | Organic Anaesthesia Scavenger |
| FUS System | Image Guided Therapy, Pessac, France | LabFUS | MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System |
| Gadodiamide | GE Healthcare AS, Oslo, Norway | Omniscan | MR Contrast Agent |
| Heparin | SAGENT | NDC2502140010 | Anti-Coagulant |
| Hypodermic needle 30G x 1/2 | Becton-Dickinson | 26027 | Tail Vein Catheterization |
| Insulin syringe 28G1/2 (1ml) | EXEL | 26027 | Administration of Injectables to Tail Vein Catheter |
| Isofluorane atomizer | SurgiVet | VCT302 | Anaesthesia Administration |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC1169567762 | Anaesthesia |
| KMnO4 | Sigma | 223468 | Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining |
| Microbubbles | Produced internally: A. Klibanov | 305106 | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Microbubbles (commercial source) | Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA | Definity microbubbles | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments | Model 1030 | Respiration Monitoring |
| Multisizer 3 Coulter counter | Beckman-Coulter, Hialeah, FL | Multisizer 3 | Used to Determine Average Size of Microbubbles |
| Optixcare EYE LUBE | CLC MEDICA, Ontario, Canada | 11611 | Corneal Protectant-Eye Lube |
| PE10 tubing | Becton-Dickinson | 427401 | Tail Vein Catheter Component |
| Quinolinic Acid | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | CAS 89-00-9 | Neurotoxin |
| Sprague-Dawley Rats | Taconic Biosciences | SD-M | Rat Model |
| Syringe Pump | Carnegie Medicin | CMA 100 | Controlled Delivery of Quinolinic Acid |
| Thermoguide Software | Image Guided Therapy, Pessac, France | Thermoguide | Drives Lab FUS System |
| Tish Rats | In-house colony | Rat Model | |
| Veet depilatory cream | Reckitt Benckiser | Removal of Scalp Hair |
References
- Wiebe, S., Eliasziw, M., Matijevic, S. I. Changes in quality of life in epilepsy: How large must they be to be real. Epilepsia. 42, 113-118 (2001).
- McClelland, S., Guo, H., Okuyemi, K. S. Population-based analysis of morbidity and mortality following surgery for intractable temporal lobe epilepsy in the United States. Archives of Neurology. 68, 725-729 (2011).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhotseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: histological findings in rabbits. Ultrasound in Medicine & Biology. 31, 1527-1537 (2005).
- Park, J., Zhang, Y., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A., McDannold, N. J. The kinetics of blood brain barrier permeability and targeted doxorubicin delivery into brain induced by focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 162 (1), 134-142 (2012).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in the presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30, 979-989 (2004).
- Vlachos, F., Tung, Y. S., Konofagou, E. E. Permeability assessment of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using dynamic contrast-enhanced MRI. Physics in Medicine and Biology. 55 (18), 5451-5466 (2010).
- Zhang, Y., et al. focal disconnection of brain circuitry using magnetic resonance-guided low-intensity focused ultrasound to deliver a Neurotoxin. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (9), 2261-2269 (2016).
- Zhang, Y., et al. Testing different combinations of acoustic pressure and doses of quinolinic acid to induce focal-neuron loss in mice using transcranial low-intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 45, 129-136 (2018).
- Foster, A. C., Miller, L. P., Oldendorf, W. H., Schwarcz, R. Studies on the disposition of quinolinic acid after intracerebral or systemic administration in the rat. Experimental Neurology. 84, 428-440 (1984).
- Beskid, M., Różycka, Z., Taraszewska, A. Quinolinic acid: effect on the nucleus arcuatus of the hypothalamus in the rat (ultrastructural evidence). Experimental and Toxicologic Pathology. 49, 477-481 (1997).
- Schwarcz, R., Köhler, C. Differential vulnerability of central neurons of the rat to quinolinic acid. Neuroscience Letters. 38, 85-90 (1983).
- Schwarcz, R., Whetsell, W. O., Mangano, R. M. Quinolinic acid: an endogenous metabolite that produces axon-sparing lesions in rat brain. Science. 219, New York, N.Y. 316-318 (1983).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Agari, T., et al. Successful treatment of epilepsy by resection of periventricular nodular heterotopia. Acta Medica Okayama. 66 (6), 487-492 (2012).
- Lee, K. S., et al. A genetic animal model of human neocortical heterotopia associated with seizures. The Journal of Neuroscience. 17 (16), 6236-6242 (1997).
- Schottler, F., Couture, D., Rao, A., Kahn, H., Lee, K. S. Subcortical connections of normotopic and heterotopic neurons in sensory and motor cortices of the tish mutant rat. The Journal of Comparative Neurology. 395 (1), 29-42 (1998).
- Schottler, F., et al. Normotopic and heterotopic cortical representations of mystacial vibrissae in rats with subcortical band heterotopia. Neuroscience. 108 (2), 217-235 (2001).
- Zhang, Y., et al. Effects of non-invasive, targeted, neuronal lesions on seizures in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Ultrasound in Medicine and Biology. 46, 1224-1234 (2020).
- Holmes, E. W. Determination of serum kynurenine and hepatic tryptophan dioxygenase activity by high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 518-525 (1988).
- Shibata, K., Ohno, T., Sano, M., Fukuwatari, T. The urinary ratio of 3-hydroxykynurenine/3-hydroxyanthranilic acid is an index of predicting the adverse effects of D-trytophan in rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminology. 60, 261-268 (2014).
- Aubry, J. -F., Tanter, M. MR-guided transcranial focused ultrasound. Therapeutic Ultrasound. , 97-111 (2016).
- Elias, W. J., et al. A Randomized trial of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 375, 730-739 (2016).
- Ghanouni, P., et al. Transcranial MR-guided focused ultrasound: a review of the technology and neuro applications. American Journal of Roentgenology. 205, 150-159 (2015).
- Martin, E., Jeanmonod, D., Morel, A., Zadicario, E., Werner, B. High-intensity focused ultrasound for noninvasive functional neurosurgery. Annals of Neurology. 66, 858-861 (2009).
- Monteith, S., et al. Transcranial magnetic resonance-guided focused ultrasound for temporal lobe epilepsy: a laboratory feasibility study. Journal of Neurosurgery. 12, 1-8 (2016).
