Summary
该协议的目标是提供一种在大脑中产生非侵入性神经元病变的方法。该方法利用磁共振引导聚焦超声（MRgFUS）以瞬态和焦焦的方式打开血脑屏障，为脑帕伦奇瘤提供循环神经毒素。
Abstract
手术干预可以相当有效地治疗某些类型的医学上难以解决的神经系统疾病。这种方法对于可识别神经元回路发挥关键作用的疾病特别有用，例如癫痫和运动障碍。目前可用的手术方式虽然有效，但通常涉及侵入性外科手术，这可能导致非目标组织的手术损伤。因此，扩大手术方法的范围，包括非侵入性和神经毒性技术，将是有价值的。
在这里，提出了一种方法，以非侵入性的方式产生大脑中的焦点，神经元病变。这种方法利用低强度聚焦超声和静脉注射微泡来暂时和聚焦地打开血脑屏障（BBB）。然后利用瞬态 BBB 开放期，将系统管理的神经毒素定向到目标大脑区域。神经毒素奎诺林酸 （QA） 通常是 BBB 不透水， 在内向或静脉注射时耐受性良好。然而，当QA获得直接访问脑组织，它是有毒的神经元。这种方法已被用于大鼠和小鼠的特定大脑区域。在 MRgFUS 之后，使用对比度增强型 T1 加权成像确认 BBB 的成功打开。程序后，T2成像显示损伤仅限于大脑的目标区域，并且利用组织学技术在死后可以确认目标区域神经元的丧失。值得注意的是，注射盐水而不是QA的动物确实表现出BBB的开放性，但点不表现出损伤或神经元损失。这种方法，即精确脑内非侵入性导导手术（PING），可为治疗神经回路障碍相关的神经系统疾病提供非侵入性方法。
Introduction
这种方法的目的是提供一种在大脑目标区域产生非侵入性神经元病变的方法。开发这种方法的理由是断开导致神经紊乱的神经元回路。例如，手术可以相当有效地治疗某些医学上难以解决的神经紊乱，如耐药癫痫（DRE）1。然而，每种可用的手术方式在对大脑产生不良的附带损害方面都有局限性。传统的切除手术可能具有高度侵入性，有出血、感染、血栓、中风、癫痫发作、脑肿胀和神经损伤的风险。微创或非侵入性手术的替代方案包括激光间散热治疗和放射外科，这也证明在抑制DRE癫痫发作方面是有效的。最近，高强度聚焦超声（HIFU）产生的热病变在减少癫痫发作方面显示出了希望。HIFU 是非侵入性的;然而，其治疗窗口目前仅限于大脑的更中心区域，因为头骨附近的非目标组织有热损伤的风险。尽管有这些限制，手术的好处往往大于潜在的风险。例如，虽然DRE手术可以产生附带的脑损伤，但它在抑制癫痫发作和提高生活质量方面通常优先于手术风险。
本文描述的方法，精确脑内非侵入性导导手术（PING），是为了断开神经回路，同时限制附带的脑损伤而开发的。该方法利用低强度聚焦超声与静脉注射微泡相结合打开BBB，以传递神经毒素。,这种方法不会产生热病变大脑3，4，5，6，7，4,5,6和BBB开放期，可以利用，以提供BBB不渗透化合物到大脑帕伦奇玛。37BBB 的开口是瞬态的，可以使用磁共振成像制导以有针对性的方式生产。在我们的研究中，BBB开放期已被利用来传递循环神经毒素到大鼠和小鼠脑帕伦奇玛的目标区域,8，9。奎诺林酸是一种神经毒素，在静脉注射10、静脉内10或内腹酮,8、9、11时耐受性良好。8QA毒性的缺乏是由于其不良的BBB渗透性，据报道，这是微不足道的10。相比之下，直接注射QA到脑帕伦奇玛产生神经元病变，使相邻的轴子12，13。12,因此，当循环QA获得进入BBB开放靶区的大脑帕伦奇马时，神经元死亡产生8,8，9。因此，目前的方法以精确针对性和非侵入性的方式产生焦点神经元损失。
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Protocol
此处描述的所有方法都已获得弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会的批准。
1. 试剂制备
- 手术当天，准备6.0 mL的可注射奎诺林酸（QA）。溶解 450 毫克 QA 在 4.0 mL 的 1.0 N NaOH.加入 0.6 mL 的 10x PBS，pH 到 7.4，并通过 0.22 μm 注射器过滤器将最终体积达到 6.0 mL，并带 dH2O. 过滤器。溶液在4°C下稳定2周。
- 通过探针从十氟丁烷气体中探出声子，在普通盐水中准备微泡水分散，并稳定使用 DSPC/PEG 硬酸盐单层壳体 12。
- 在正常重力下通过浮选调整微泡的大小。使用多色化器 III 计数器通过电区传感确定微泡浓度和尺寸。微泡浓度和大小分布应分别为6 x 108/mL和±2 μm（平均颗粒直径）。通过浮选排除/分离去除最大的气泡。
- 或者，购买市售的微泡。
2. 动物的准备
- 在分娩后3天内使动物（老鼠或老鼠）适应。这里描述的实验使用了斯普拉格-道利大鼠（5-6周大）或脑内结构异视（蒂什）大鼠（局部殖民地）。
- 在12小时的灯光下将动物饲养：12小时暗循环。
- 记录动物的重量。在整个过程中，此信息非常重要。
- 在 FUS 程序前一天获取 T2 加权 MR 图像，以便建立术前基线图像。使用以下参数进行 T2 成像：重复时间/回波时间 [TR/TE] [3，000/138 毫秒，3 平均值，视野=29 x 45 mm2，矩阵大小 = 125 x 192，切片厚度 = 0.23 mm。
- 用异氟烃麻醉动物（4%诱导，2%维护）。使用手趾捏，确认麻醉深度足够。在眼睛上涂抹眼科软膏。
- 剃掉动物的头皮，用脱毛霜去除剩余的头发。
- 使用尾静脉导管注入微泡、对比剂和 QA。导管由一根带 30 G x 1/2 英寸针的 PE10 管组成。将带肝素盐水的 1 mL 注射器放在线上，当输液时，要取出并重新连接。
3. MRI 和 PING 程序
- 在梯度强度为 600 mT/m/ms 的 7 T MR 装置上执行MRI（图 1 和图 2）。使用 FUS 系统中集成的表面线圈执行 MRI 采集。
注：用于实验的FUS系统由三部分组成：（一）声波系统是一个MR兼容的预聚焦8元环形阵列，1.5 MHz传感器（球面半径= 20毫米×2毫米，有源直径=25毫米（f-数字=0.8），具有80%的电声效率，连接到相控发电机阵列和射频功率放大器;（二） MR兼容电动定位阶段，将传感器向前-后部方向和侧向移动;（iii） 一个用于控制声波传递的 ThermoGuide 工作站，包括通过相位调制进行电子对焦以调整焦距深度（图 2）。 - 将麻醉动物放在 MR 兼容 FUS 系统的线圈雪橇组件上（图1），位于易发位置。使用雪橇底座中集成的切口杆和耳条固定动物。
- 将声学凝胶涂抹在湿水的头皮上;确保不存在气泡，将传感器组件的导流器部分的膜屏障放在动物头骨上方，并尽可能降低传感器组件相对于头骨板的平行平面方向。将传感器的隔膜牢固地放在动物剃光的头皮上，直接放在头骨板上。
- 用手术胶带将气动传感器连接到身体，以监测呼吸。将气动传感器放在左下肋保持架上。
- 将带线圈、雪橇和动物的 FUS 臂组件移入 7T MRI 单元（图 1）。
- 运行 T2-scout 序列以确定传感器组件相对于动物头部的一般物理位置，并必要时进行机械调整（图 2）。T2成像的参数是：重复时间/回波时间 [TR/TE] = 3，000/138 毫秒，3 个平均值，视场 = 29 x 45 mm2，矩阵大小 = 125 x 192，切片厚度 = 0.23 mm。此协议中通常不使用热测量。
- 获取 T2 图像以优化传感器定位。精确定义传感器位置，并使用软件的定位功能指定声波的聚焦点。T2成像的参数是：重复时间/回波时间 [TR/TE] = 3，000/138 毫秒，3 个平均值，视场 = 29 x 45 mm2，矩阵大小 = 125 x 192，切片厚度 = 0.23 mm。
- 就在声波化之前，通过尾静脉注射300μL/kg的微泡14。
- 使用 1.5 MHz 传感器产生声波（30 ms 波数据包、3% 占空比、1 Hz 突发重复频率、240 s 持续时间/声波）。
- 音色后立即通过尾静脉注射多酰胺对比剂，然后执行T1加权加对比度扫描，以确认BBB的开口和瞄准的准确性。T1 加权成像的参数：TR/TE = 900/12 毫秒，2 个平均值，视场 = 24 x 30 mm2，矩阵大小 = 208 x 256，切片厚度 = 0.7 mm。通常，执行单个 T1 扫描。
- 从 MRI 上取下 FUS 臂和雪橇，将动物放在设置为 40°C 的加热垫上，同时保持 2% 的异氟麻醉。
- 声波化后30分钟开始，使用注射器泵通过尾静脉注入QA（75mg/mL库存溶液），以16.8μL/min的速度注入QA（75mg/mL库存溶液），最终剂量达到225mg/kg（q.s.至1.0 mL盐水）。
- 当输液完成时，停止麻醉，将动物放在加热垫上直到警觉。将动物放在笼子里，并在手术后数小时每15分钟进行一次例行检查。
- 将动物返回动物，并在第一天每6小时检查一次，检查其是否遇险或活动不规则。
- 声波化后一天，执行 T2 加权 MR 成像，以评估声波化领域的任何损害。T2成像的参数：重复时间/回波时间 [TR/TE] = 3，000/138 毫秒，3 个平均值，视场 = 29 x 45 mm2，矩阵大小 = 125 x 192，切片厚度 = 0.23 mm。对图像进行高增度区域评估，以确定可能的组织损伤/水肿。
4. 神经元损失的验尸分析
- 允许一个后声波，生存期4-5天评估神经元损失与氟-玉组化学。
- 用异氟烷对动物进行深度麻醉，通过心内灌注用0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）进行安乐死，随后在磷酸盐缓冲液中对4%的甲醛进行安乐死。
- 从头骨上取出大脑，在4%的半成甲醛中修复2天。
- 将大脑浸入30%蔗糖中进行低温保护，用低温恒温器切割厚度为20~30μm的部分。
- 将低温恒温部分安装到明胶化滑梯上，并通宵晾干。
- 在蒸馏水中进行补水，然后在升序乙醇中脱水。脱水后，在降档乙醇中再水合一。
- 在轨道摇床上将滑轨转移到0.06%高锰酸钾溶液中15分钟。
- 在蒸馏水中冲洗1分钟，并转移到0.1%醋酸中氟-玉B溶液的0.001%。在室温下温和搅拌下孵育30分钟。用蒸馏水冲洗三次，1分钟。
- 将幻灯片加热器上的幻灯片干燥，用 xylenes 平衡 3 分钟，并使用 DPX 安装介质进行盖玻片。
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Representative Results
本节介绍 PING 对位于新皮质发育不良的神经元的影响。组织发育不良是耐药癫痫患者大脑中的一个常见特征，手术切除癫痫原生障碍可以很好的控制癫痫发作。因此，定义 PING 对再生性脑组织的影响是一个重要的优先事项。遗传皮质发育不良的老鼠模型，蒂什大鼠，被选择研究这个问题，因为蒂什大脑表现出发育不良组织（下皮质异视）位于一个正常定位的新皮质（图3）16。16发育不良和上层新皮质都含有功能神经元，并表现出典型的新皮质连接17，18。17,
PING针对蒂什大鼠大脑的异位性有效，可产生发育不良神经元的聚焦神经元损失（图3）。T2 加权图像在 PING 后一天拍摄的显示高敏性区域，与声波靶区组织损伤一致。在5天的PING后存活期后，使用氟-Jade进行死后染色，证明T2-超增区神经元退化，证实了PING在靶向消化不良肿瘤组织中产生神经元损失的能力。
图1：磁共振（MR）兼容雪橇和7T MR磁铁。雪橇用于在 MR 磁铁中定位动物和提供声波的主要特征被描述 （A）。雪橇组件插入到 7T MR 磁铁 （B） 中。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：磁共振（MR）成像和MRI引导聚焦超声（FUS）控制室。控制室由两个主要站组成。调查员坐的站是定位 FUS （ A ） 的规划区域。第二个站是 MRI 系统的控制区域 （B）。MRI 站后面的铜增强窗可以查看 7T 磁铁的外壳。FUS 站的监视器显示控制声波（C）的制导和参数的软件。此示例显示一个声波，指向叠加在 T2 加权 MR 图像（D）上的线状体。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：PING在蒂什大鼠大脑的可塑性肿瘤中产生神经元损失。T2加权的 MR 图像 （A，B） 是在 PING 后一天获得的.新皮质 [N]，异位体 [H] 和横向心室 [LV] 被标记为方向 （A） 。在大脑两侧异视的靶区（B）中可以看到超亮度区域[白色和黄色箭头]，表示组织损伤。用氟-玉（C+F）进行尸检染色。在大脑左侧（C，E;白色箭头）和右（D，F;黄色箭头）两侧的超亮度区域，观察到代表退化神经元的明亮的绿色细胞。比例线：C，D = 1 毫米;E， F = 0.5 毫米 。请点击这里查看这个数字的较大版本。
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Discussion
PING 方法旨在产生非侵入性、靶向性神经元病变。,该方法源于聚焦超声,,3、4、5、6、7领域研究基础6的牢固和日益增长。35通过BBB的短暂开放，提供对脑帕伦奇马特定区域的聚焦访问能力，为提供各种通常无法进入大脑的制剂创造了一条途径。这一机会在很大程度上是为中央提供治疗剂，具有较差的BBB渗透性。PING 方法通过提供神经毒素，以不同的方式利用相同的机会，最终目标是破坏导致神经功能障碍的电路。异常神经回路是手术干预的有效目标，可减轻某些神经系统疾病2，15,的影响。PING 方法的长期目标是增强目前可用于断开导致神经功能障碍的电路的方法。
使用 PING 方法进行综合研究的设计将包含多个控制组。这些群体将包括：（a） 未经处理的群体[无 FUS/无 QA];（b） 未经处理的群体[无 FUS/无 QA];（c） 未经处理的群体[无 FUS/无 QA];（d） 未经处理的群体[无 FUS/无（b） 控制FUS[FUS/无QA]直接影响的群体;（c） 在没有FUS[无FUS/QA]的情况下评估全身神经毒素的直接影响的小组。这些组中的结果将与主要 PING 组 [FUS/QA] 进行比较。
PING 方法需要处理小动物的基本技能。其中包括麻醉的诱导和维持、尾静脉线的放置、在MRI单元设置中静脉注射多种制剂、静脉注射药物，以及术后和术后的动物护理。它还需要能够执行心内灌注、组织分段、组织化学染色和微观分析。对于议定书中的几个步骤，需要接受动物护理和使用委员会或同等机构的机构培训和批准。
PING程序的初始协议利用重复性内丙酮注射QA在多天8，9。,9这种方法仍然可行和有效。但是，当前协议修改了 QA 管理的路线和速率。特别是，QA在输液后1小时静脉注射。同样，任一管理协议都有效。采用当前协议使用的4~5天生存期，以优化氟-玉法检测退化神经元的利用。如果需要更长的生存期，则将指示替代组织染色方法。其中一种方法是使用神经元特异性抗体（例如，抗新抗体），以免疫组织化学方式证明存活的神经元在声波后存活期越长之后仍然存在。除了目前的结构分析之外，各种结果也将是有益的。例如，对电生理和行为结果的 PING 后评估将显著提高 PING 方法的影响表征。
FUS 程序的一个潜在复杂性是，头骨附近的温度可能会升高，尤其是在瞄准位于头骨附近的皮质区域时。这种并发症目前限制使用高强度 FUS （HIFU） 的部位（治疗包络）的范围，以热病变。在 PING 环境中，头骨附近的热增加也可能代表该技术的限制。然而，与HIFU相比，PING使用的低声度降低了热损伤的风险，并且应该扩大治疗范围。
PING 方法具有基础设施密集型和培训密集型几个功能。需要与 MRI 兼容的 FUS 设备和配备用于动物研究的 MRI 设施。这是一项可观的前端投资，以便提供必要的研究基础设施。然而，令人鼓舞的是，配备FUS技术的场地数量正在迅速扩大，用于研究和临床工作。因此，随着开展此类工作的可用地点数量的增加，现场和/或协作调查的机会将增加。在培训方面，任何寻求进行FUS研究的调查员都将受益于在FUS实验中有经验的研究小组的培训。例如，MRgFUS 定位软件虽然相对简单，但在接受经验丰富的调查员建议时更容易获得。
存在多种替代手术方式，用于去除干扰性神经元电路。这些手术包括切除手术、立体定向激光消融、放射外科、高强度聚焦超声和射频治疗。这些方法都有效，对某些医学上难以解决的疾病具有相当大的治疗价值。然而，这些手术方式有一个或多个具体限制：（a） 侵入性手术，（b） 对目标组织的影响，（c） 对相邻的非目标组织的损害（例如，通过轴的轴）和（d） 延迟取得有效结果。PING 方法的显著优点是：（a） 非侵入性，（b） 不是泛结，（c） 限制对相邻非目标组织的影响，（d） 应提供快速结果。
PING 方法有几个潜在的未来方向，包括临床前和临床应用。在动物实验方面，该方法为在神经系统疾病的临床前模型中产生焦点神经元病变提供了一种手段。例如，我们最近用这种方法来测试PING在边缘性癫痫19的啮齿动物模型中的效果。使用 PING 治疗可降低边缘性癫痫皮罗卡平模型中慢性自发性癫痫发作的频率。本研究为PING在治疗神经系统疾病中的效用提供了第一个临床前的概念证明。
由于两个主要原因，选择奎诺林酸用于PING程序。首先，现有的文献11 表明，神经元细胞体病变可以产生，同时保留其他非目标组织，如通过轴。其次，虽然QA在直接传递到大脑时是一种神经毒性，但由于通过BBB的渗透性有限，因此在系统管理时，它受到良好的耐受性。其他在外围耐受性良好的毒素，如谷氨酸钠（MSG），可被视为QA的替代品。味精的一个关键优势是，有大量文献关于人类使用这种化合物。未来研究的一个重要目标是确定QA或其他系统管理的神经毒素在潜在细胞类型特异性方面产生的损伤的特异性。这种一般方法的另一个潜在的临床前应用是管理一种外周耐受化合物，该化合物对脑膜瘤中其他细胞类型（如胶质细胞）有毒。例如，对影响奥利戈德登德罗利亚的毒素进行外围注射，可以允许在白质区域进行焦化。这将允许有针对性地对目标路径的一部分进行脱皮。此外，这种方法可能允许对同一站点的连续脱毛进行评估，这是复发性多发性硬化症的标志。
关于PING未来在人类中可能的应用，神经紊乱，其中神经回路紊乱，可以治疗PING。根据我们最初的临床前发现19，耐药癫痫（DRE）是一个有希望的疾病的例子，可能受益于PING。DRE 的手术治疗可能非常有益，但仍是实际对主要神经系统疾病有效的最未充分利用的治疗方法之一。在此设置中，PING 的一个优点是，通过利用多个站点的串行声波，可以调整和放大目标区域的体积。这将允许更精确地瞄准大脑帕伦奇马中形状不规则和大小不规则的目标。PING 的转化过程必然涉及非人类灵长类动物（最终在人类中）对 QA 系统管理的安全性进行测试。基努仁代谢物通常通过肾脏从血液中清除，并通过排尿20，21,消除;然而，该模型尚未评估注入 QA 的命运。然而，重要的是要注意到，在这种情况下，高水平的系统管理的QA在啮齿动物中耐受良好。重要的是，使用PING并不排除护理标准治疗。如果单次或多次 PING 治疗在给定患者中证明无效，则其他程序（如复选或消融手术）仍将是可行的选择。同样重要的是要认识到，PING将会出现的临床环境是理想的准备翻译和实施22，23，24，25，26。22,23,24,25,26结构和功能成像模式正在迅速变得更加精细，这将更好地确定适当的目标，以便进行精确的干预。此外，无需为 PING 设计、建造或批准新的医疗设备。MR 引导、高强度 FUS 已经是多种适应症（包括神经学应用）的既定和认可模式。而且，如前所述，近年来，FUS已经用于临床的站点激增。这些优势共同为多个应用的 PING 提供了一条充满希望的发展道路。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者认可雷内·杰克·罗伊在核磁共振成像领域提供的出色技术支持。这项工作得到了国家卫生研究院（R01 NS102194至KSL和R01 CA217953-01至MW）、切斯特基金（KSL）和聚焦超声基金会（KSL和JW）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T-ClinScan MRI System | Bruker Biospin, Ettinglen, Germany | MR Image Acquisition | |
| Acoustic Gel | Litho CLEAR | 11-601 | High Viscosity Accoustic Transmission Gel |
| DPX Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 13512 | Resin Based Cover Glass Mountant |
| Fluoro-Jade B | EDM Millipore | AG310 | High Affinity Stain For Degenerating Neurons |
| Fluovac anesthetic adsorber | Harvard Apparatus | 34-0388 | Organic Anaesthesia Scavenger |
| FUS System | Image Guided Therapy, Pessac, France | LabFUS | MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System |
| Gadodiamide | GE Healthcare AS, Oslo, Norway | Omniscan | MR Contrast Agent |
| Heparin | SAGENT | NDC2502140010 | Anti-Coagulant |
| Hypodermic needle 30G x 1/2 | Becton-Dickinson | 26027 | Tail Vein Catheterization |
| Insulin syringe 28G1/2 (1ml) | EXEL | 26027 | Administration of Injectables to Tail Vein Catheter |
| Isofluorane atomizer | SurgiVet | VCT302 | Anaesthesia Administration |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC1169567762 | Anaesthesia |
| KMnO4 | Sigma | 223468 | Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining |
| Microbubbles | Produced internally: A. Klibanov | 305106 | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Microbubbles (commercial source) | Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA | Definity microbubbles | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments | Model 1030 | Respiration Monitoring |
| Multisizer 3 Coulter counter | Beckman-Coulter, Hialeah, FL | Multisizer 3 | Used to Determine Average Size of Microbubbles |
| Optixcare EYE LUBE | CLC MEDICA, Ontario, Canada | 11611 | Corneal Protectant-Eye Lube |
| PE10 tubing | Becton-Dickinson | 427401 | Tail Vein Catheter Component |
| Quinolinic Acid | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | CAS 89-00-9 | Neurotoxin |
| Sprague-Dawley Rats | Taconic Biosciences | SD-M | Rat Model |
| Syringe Pump | Carnegie Medicin | CMA 100 | Controlled Delivery of Quinolinic Acid |
| Thermoguide Software | Image Guided Therapy, Pessac, France | Thermoguide | Drives Lab FUS System |
| Tish Rats | In-house colony | Rat Model | |
| Veet depilatory cream | Reckitt Benckiser | Removal of Scalp Hair |
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