Summary
Het doel van het protocol is om een methode te bieden voor het produceren van niet-invasieve neuronale laesies in de hersenen. De methode maakt gebruik van Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) om de bloedhersenbarrière te openen op een voorbijgaande en brandpuntige manier, om een circulerend neurotoxine te leveren aan de hersenen parenchyma.
Abstract
Chirurgische ingreep kan heel effectief zijn voor de behandeling van bepaalde vormen van medisch hardnekkige neurologische ziekten. Deze aanpak is vooral handig voor aandoeningen waarbij identificeerbare neuronale circuits een belangrijke rol spelen, zoals epilepsie en bewegingsstoornissen. Momenteel beschikbare chirurgische modaliteiten, terwijl effectief, in het algemeen betrekking hebben op een invasieve chirurgische ingreep, die kan resulteren in chirurgische letsel aan niet-doelweefsels. Bijgevolg zou het van waarde zijn om het bereik van chirurgische benaderingen uit te breiden met een techniek die zowel niet-invasief als neurotoxisch is.
Hier wordt een methode gepresenteerd voor het produceren van focale, neuronale laesies in de hersenen op een niet-invasieve manier. Deze aanpak maakt gebruik van lage intensiteit gerichte echografie samen met intraveneuze microbellen om tijdelijk en brandpuntsgericht open de Bloedhersenbarrière (BBB). De periode van voorbijgaande BBB opening wordt vervolgens benut om focally leveren een systemisch toegediend neurotoxine aan een gerichte hersenen gebied. Het neurotoxine quinolinic zuur (QA) is normaal BBB-ondoordringbaar, en wordt goed verdragen wanneer toegediend intraperitoneally of intraveneus. Echter, wanneer QA krijgt directe toegang tot hersenweefsel, het is giftig voor de neuronen. Deze methode is gebruikt bij ratten en muizen om specifieke hersengebieden te richten. Onmiddellijk na MRgFUS wordt de succesvolle opening van de BBB bevestigd met behulp van contrastvergeopte T1-gewogen beeldvorming. Na de procedure, T2 beeldvorming toont letsel beperkt tot het beoogde gebied van de hersenen en het verlies van neuronen in het beoogde gebied kan worden bevestigd post-mortem met behulp van histologische technieken. Met name dieren geïnjecteerd met zout in plaats van QA tonen de opening van de BBB aan, maar de stip vertoont geen letsel of neuronaal verlies. Deze methode, genoemd Nauwkeurige Intracerbraral Niet-invasieve Geleide chirurgie (PING) kan een niet-invasieve benadering voor de behandeling van neurologische aandoeningen geassocieerd met verstoringen in neurale circuits.
Introduction
Het doel van deze methode is om een middel te bieden voor het produceren van niet-invasieve neuronale laesies in een gericht gebied van de hersenen. De reden voor het ontwikkelen van een dergelijke aanpak is het loskoppelen van neuronale circuits die bijdragen aan neurologische aandoeningen. Bijvoorbeeld, chirurgie kan heel effectief zijn bij de behandeling van bepaalde medisch hardnekkige neurologische aandoeningen, zoals resistente epilepsie (DRE)1. Echter, elk van de beschikbare chirurgische modaliteiten bezitten beperkingen in termen van het produceren van ongewenste bijkomende schade aan de hersenen. Traditionele resective chirurgie kan zeer invasief zijn met het risico van bloeden, infectie, bloedstolsels, beroerte, aanvallen, zwelling van de hersenen, en schade aan de zenuwen2. Alternatieven voor resectief chirurgie die minimaal invasief of niet-invasief zijn, zijn laserinterstitiële thermische therapie en radiochirurgie, die ook effectief zijn gebleken bij het onderdrukken van aanvallen bij DRE. Meer recent, thermische laesies geproduceerd door hoge intensiteit gerichte echografie (HIFU) hebben aangetoond belofte in het verminderen van aanvallen. HIFU is niet-invasief; echter, de behandeling venster is momenteel beperkt tot meer centrale gebieden van de hersenen als gevolg van het risico van thermische schade aan niet-doelweefsel gelegen in de buurt van de schedel. Ondanks dergelijke beperkingen wegen de voordelen van chirurgie vaak op tegen de potentiële risico's. Bijvoorbeeld, hoewel een operatie voor DRE kan produceren bijkomende hersenschade, de gunstige effecten in het onderdrukken van aanvallen en het verbeteren van de kwaliteit van leven meestal prevaleren boven de chirurgische risico's.
De hierin beschreven methode, Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING), werd ontwikkeld met het oog op het loskoppelen van neurale circuits, terwijl bijkomende hersenschade werd beperkt. De methode maakt gebruik van lage intensiteit gerichte echografie in combinatie met intraveneuze injectie van microbellen om de BBB te openen, om een neurotoxine te leveren. Deze aanpak produceert geen thermische laesies aan de hersenen3,,4,,5,,6,7, en de periode van BBB opening kan worden benut om BBB-ondoordringbare verbindingen te leveren aan de hersenen parenchyma. De opening van de BBB is van voorbijgaande aard en kan gericht worden geproduceerd met behulp van magnetische resonantiebeeldvormingsbegeleiding. In onze studies is de periode van BBB-opening gebruikt om een circulerend neurotoxine te leveren aan een gericht gebied van de hersenen parenchyma bij ratten en muizen8,9. Quinolinic acid is een neurotoxine dat goed wordt verdragen wanneer toegediend intraveneus10, intraarterially10, of intraperitoneally8,9,11. Het gebrek aan QA-toxiciteit is te wijten aan de slechte BBB-doorlaatbaarheid, waarvan is gemeld dat het verwaarloosbaar is10. In tegenstelling, directe injectie van QA in de hersenen parenchyma produceert neuronale laesies die sparen naburige axonen12,13. Dus, wanneer circulerende QA toegang krijgt tot de hersenen parenchyma in het beoogde gebied van BBB opening, neuronale dood wordt geproduceerd8,9. De huidige methode produceert dus focal neuronale verlies in een precies gerichte en niet-invasieve manier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Universiteit van Virginia Animal Care and Use Committee.
1. Bereiding van reagentia
- Bereid op de dag van de operatie 6,0 mL injecteerbaar kinolinzuur (QA) voor. Los 450 mg QA op in 4,0 mL van 1,0 N NaOH. Voeg 0,6 mL 10x PBS, pH tot 7,4 toe en breng tot een eindvolume van 6,0 mL met dH2O. Filter door 0,22 μm spuitfilter. De oplossing is stabiel gedurende 2 weken bij 4 °C.
- Bereid een waterige dispersie van microbellen in normale zoutoplossing door sonde sonicatie van decafluorobutaangas en stabiliseren met DSPC / PEG stearate monolayer shell12.
- Grootte microbellen door flotatie bij normale zwaartekracht. Bepaal de microbubble concentratie en grootte door electrozone sensing met behulp van Multisizer III teller. De microbubbleconcentratie en de grootteverdeling moeten respectievelijk 6 x 108/mL en ~2 μm (gemiddelde deeltjesdiameter) zijn. De grootste bellen worden verwijderd door flotatie uitsluiting / scheiding.
- U ook commercieel beschikbare microbellen aanschaffen.
2. Bereiding van dieren
- Acclimatiseren van het dier (rat of muis) gedurende 3 dagen na de bevalling. De hier beschreven experimenten gebruikten Sprague-Dawley ratten (5-6 weken oud) of telencephalic interne structurele heterotopie (tish) ratten (lokale kolonie).
- Huis de dieren onder een licht van 12 uur: 12 uur donkere cyclus.
- Leg de gewichten van de dieren vast. Deze informatie is belangrijk tijdens de hele procedure.
- Verkrijg T2-gewogen MR-afbeeldingen de dag voor de FUS-procedure om preoperatieve basislijnafbeeldingen vast te stellen. Gebruik de volgende parameters voor T2-beeldvorming: herhalingstijd/echotijd [TR/TE] =3.000/138 milliseconden, 3 gemiddelden, gezichtsveld=29 x 45 mm2, matrixgrootte = 125 x 192, plakdikte = 0,23 mm.
- Verdoven het dier met isoflurane (4% inductie, 2% onderhoud). Bevestig voldoende diepte van anesthesie met behulp van een teensnuifje. Breng een oogheelkundige zalf aan op de ogen.
- Scheer de hoofdhuid van het dier en verwijder het resterende haar met ontharingscrème.
- Gebruik een staartaderkatheter voor de infusie van microbellen, contrastmiddel en QA. De katheters bestaan uit een lengte van PE10 buizen voorzien van een 30 G x 1/2 inch naald. Laat een spuit van 1 mL met gehepariniseerde zoutoplossing in de rij staan, om te worden verwijderd en opnieuw bevestigd wanneer de lijn wordt gebruikt voor infusies.
3. MRI- en PING-procedures
- Voer de MRI uit op een 7 T MR-eenheid met een hellingssterkte van 600 mT/m/ms(figuur 1 en figuur 2). Voer MRI-acquisities uit met behulp van een oppervlaktespoel die in het FUS-systeem is verwerkt.
OPMERKING: Het FUS-systeem dat voor de experimenten wordt gebruikt, bestaat uit drie delen: i) het sonicatiesysteem is een MR-compatibele pre-focusede, 8-element ringvormige array, 1,5 MHz transducer (bolvormige radius = 20 mm ± 2 mm, actieve diameter = 25 mm (f-nummer = 0,8), met 80% elektrisch-akoestische efficiëntie, die is aangesloten op een gefaseerde arraygenerator en RF-eindversterker; ii) een MR-compatibel gemotoriseerd positioneringsstadium om de transducer in de richting van voorste achterste en medio-zijwaartse richting te verplaatsen; iii) een thermogidswerkstation om de levering van sonicatie te regelen, met inbegrip van elektronische scherpstelling door middel van fasemodulatie om de brandpuntsdiepte aan te passen (figuur 2). - Plaats het verdoofde dier op de spoelslee (figuur 1) van het MR-compatibele FUS-systeem in de gevoelige positie. Immobiliseer het dier met behulp van de snijtand en de oorbalken die in de wieg van de slee zijn verwerkt.
- Breng akoestische gel aan op de met water bevochtigde hoofdhuid; ervoor te zorgen dat er geen bellen bestaan, plaats de membraanbarrière van het watercirculatiegedeelte van de transducer-assemblage boven de schedel van het dier en verlaag de transducerassemblage zoveel mogelijk in een parallelle vlakke oriëntatie ten opzichte van de schedelplaat. Plaats het middenrif van de transducer stevig tegen de geschoren hoofdhuid van het dier direct over de schedelplaat.
- Bevestig een pneumatische sensor aan het lichaam met chirurgische tape, om de ademhaling te controleren. Plaats de pneumatische sensor op de linker onderste ribbenkast.
- Verplaats de FUS-armassemblage met spoel, slee en dier in de 7T MRI-unit(figuur 1).
- Voer een T2-scout sequentie uit om de algemene fysieke positie van de transducerassemblage ten opzichte van het hoofd van het dier te bepalen en maak zo nodig mechanische aanpassingen(figuur 2). De parameters voor T2 imaging zijn: herhalingstijd/echotijd [TR/TE] = 3.000/138 milliseconden, 3 gemiddelden, gezichtsveld = 29 x 45 mm2, matrixgrootte = 125 x 192, plakdikte = 0,23 mm. Thermometrie wordt meestal niet gebruikt in dit protocol.
- Verkrijg T2-afbeeldingen om de positionering van de transducer te verfijnen. Definieer precies de locatie van de transducer en geef het brandpunt(en) van sonicatie op met behulp van de targetingfunctie van de software. De parameters voor T2 imaging zijn: herhalingstijd/echotijd [TR/TE] = 3.000/138 milliseconden, 3 gemiddelden, gezichtsveld = 29 x 45 mm2, matrixgrootte = 125 x 192, plakdikte = 0,23 mm.
- Vlak voor de sonicatie, injecteer 300 μL/kg microbellen14 via de staartader.
- Gebruik een 1,5 MHz transducer om sonicaties te produceren (30 ms wave packet, 3% duty cycle, 1 Hz burst herhaling frequentie, 240 s duur / sonicatie.
- Onmiddellijk na sonicatie, injecteren gadodiamide contrastmiddel via de staart ader, en voer vervolgens T1-gewogen plus contrast scans om de opening van de BBB en de nauwkeurigheid van de targeting te bevestigen. De parameters voor T1-gewogen beeldvorming: TR/TE = 900/12 milliseconden, 2 gemiddelden, gezichtsveld = 24 x 30 mm2, matrixgrootte = 208 x 256, plakdikte = 0,7 mm. Meestal wordt een enkele T1-scan uitgevoerd.
- Verwijder de FUS arm en slee van de MRI, en plaats het dier op een verwarmingskussen ingesteld op 40 °C, met behoud van 2% isoflurane anesthesie.
- Vanaf 30 min na sonicatie gebruikt u een spuitpomp om QA (75 mg/mL voorraadoplossing) gedurende 1 h 1 h te bezielen met een snelheid van 16,8 μL/min om een uiteindelijke dosering van 225 mg/kg (q.s. tot 1,0 mL zoutoplossing) te bereiken.
- Wanneer de infusie is voltooid, stop dan met anesthesie en houd het dier op een verwarmingskussen tot ze alert zijn. Plaats het dier in een kooi en controleer routinematige controles voor zijn activiteit om de 15 minuten, gedurende enkele uren na de procedure.
- Breng het dier terug naar het vivarium en controleer elke 6 uur voor de eerste dag op nood of onregelmatige activiteit.
- Op een dag na de sonicatie, uit te voeren T2-gewogen MR beeldvorming om eventuele schade op het gebied van sonicatie te beoordelen. De parameters voor T2 imaging: herhalingstijd/echotijd [TR/TE] = 3.000/138 milliseconden, 3 gemiddelden, gezichtsveld = 29 x 45 mm2, matrixgrootte = 125 x 192, plakdikte = 0,23 mm. Beelden worden geëvalueerd op gebieden van hyperintensiteit om mogelijke weefselschade/oedeem te identificeren.
4. Postmortem analyse van neuronale verlies
- Sta een post-sonicatie, overlevingsperiode van 4-5 dagen voor het beoordelen van neuronale verlies met Fluoro-Jade histochemie.
- Verdoven het dier diep met isofluraan en euthanaseren via intracardiale perfusie met 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7.4) gevolgd door 4% paraformaldehyde in fosfaatbuffer.
- Verwijder de hersenen van de schedel en post-fix voor 2 dagen in 4% paraformaldehyde.
- Dompel de hersenen onder in 30% sacharose voor cryoprotectie en snijd secties met een dikte van 20-30 μm met een cryostat.
- Zet cryostat secties op gelatinegiseerde dia's en lucht-droog 's nachts.
- Rehydraat glijbanen in gedestilleerd water, en vervolgens uitdrogen in oplopende gesorteerde ethanol. Na uitdroging, rehydraat glijbanen in dalende gesorteerde ethanol.
- Breng dia's over naar een oplossing van 0,06% kaliumpermanganaat gedurende 15 minuten op een orbitale shaker.
- Spoel glijbanen gedurende 1 min in gedestilleerd water en breng over op een 0,001% oplossing van Fluoro-Jade B in 0,1% azijnzuur. Incubeer onder zachte agitatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Spoel glijbanen drie keer gedurende 1 min in gedestilleerd water.
- Droog de dia's op een diawarmer, equilibrate in xylenes gedurende 3 minuten en coverslip met behulp van DPX montagemedia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze sectie beschrijft het effect van PING op neuronen in een neocorticale dysplasie. Weefseldysplasieën zijn een gemeenschappelijk kenmerk in de hersenen van patiënten met resistente epilepsie, en chirurgische verwijdering van epileptische dysplasieën kan een uitstekende controle van aanvallen15. Het definiëren van het effect van PING op dysplastisch hersenweefsel is daarom een belangrijke prioriteit. Een rat model van genetische corticale dysplasie, de tish rat, werd geselecteerd voor het bestuderen van deze kwestie, omdat de tish hersenen vertoont dysplastisch weefsel (subcorticale band heterotopie) gelegen onder een normaal gepositioneerde neocortex (Figuur 3)16. Zowel de dysplasie als de bovenlyserende neocortex bevatten neuronen die functioneel zijn en vertonen karakteristieke neocorticale connectiviteit17,18.
PING gericht op de heterotopie van de tish rat hersenen was effectief in het produceren van focal neuronale verlies van de dysplastische neuronen (Figuur 3). T2-gewogen beelden genomen op een dag na-PING vertonen gebieden van hyperintensiteit, in overeenstemming met weefselschade in de beoogde gebieden van sonicatie. Post-mortem kleuring met fluoro-jade na een 5-daagse post-PING overlevingsperiode aangetoond degraderende neuronen in de gebieden van T2-hyperintensiteit, bevestiging van het vermogen van PING om neuronale verlies te produceren in de beoogde dysplastische neocorticale weefsel.
Figuur 1: Magnetische resonantie (MR)-compatibele slee en 7T MR magneet. De belangrijkste kenmerken van de slee die wordt gebruikt om het dier in de MR-magneet te plaatsen en sonicatie te leveren, worden afgebeeld (A). De sleemontage wordt in de 7T MR-magneet(B)weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Controlekamer voor Magnetic Resonance (MR) imaging en MR-guided Focused Ultrasound (FUS). De controlekamer bestaat uit twee primaire stations. Het station waar de onderzoeker zit is het planningsgebied voor het richten van FUS(A). Het tweede station is het controlegebied voor het MRI-systeem(B). Het koperversterkte raam achter het MRI-station kijkt in de ruimte met de 7T-magneet. De monitor op het FUS-station toont de software die de richtlijnen en parameters van sonicatie(C) regelt. Dit voorbeeld toont een sonicatie gericht op het striatum bovenop een T2-gewogen MR-afbeelding(D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: PING produceert neuronaal verlies in de dysplastische neocortex van de tish rat hersenen. T2-gewogen MR beelden (A,B) werden verkregen een dag na PING. De neocortex [N], heterotopie [H], en de laterale ventrikels [LV] zijn gelabeld voor oriëntatie (A). Gebieden van hyperintensiteit [witte en gele pijlen], indicatief voor weefselschade, kan worden gezien in de beoogde gebieden van de heterotopie aan beide zijden van de hersenen(B). Post-mortem kleuring met Fluoro-Jade(C-F). Heldere groene cellen die degraderende neuronen vertegenwoordigen worden waargenomen in de gebieden die overeenkomen met de gebieden van hyperintensiteit aan zowel de linkerzijde(C,E; witte pijlen) als de rechterkant(D,F; gele pijlen) zijden van de hersenen. Schaalbalken: C,D = 1 mm; E,F = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De PING-methode is ontworpen om niet-invasieve, gerichte neuronale laesies te produceren. De methode is afgeleid van een sterke en groeiende basis van onderzoek op het gebied van gerichteechografie 3,4,5,6,7. De mogelijkheid om focale toegang te bieden tot specifieke gebieden van de hersenen parenchyma via tijdelijke opening van de BBB heeft een weg gecreëerd voor het leveren van een breed scala van agenten die normaal gesproken geen toegang tot de hersenen zou krijgen. Deze kans wordt grotendeels gevorderd voor de centrale levering van therapeutische middelen die slechte BBB doorlaatbaarheid bezitten. De PING-methode maakt gebruik van dezelfde kans op een andere manier door het leveren van een neurotoxine, met het uiteindelijke doel van het vernietigen van circuits die bijdragen aan neurologische disfunctie. Afwijkende neurale circuits vormen een effectief doel voor chirurgische interventie om de impact van bepaalde neurologische aandoeningen te verzachten2,15. Het doel op lange termijn voor de PING-methode is het vergroten van de momenteel beschikbare benaderingen voor het loskoppelen van circuits die bijdragen aan neurale disfunctie.
Het ontwerp van een uitgebreide studie met behulp van de PING-methode zou meerdere controlegroepen bevatten. Deze groepen omvatten: a) een onbehandelde groep [Geen FUS/Geen QA]; b) een groep die de directe effecten van FUS controleert [FUS/No QA]; c) een groep die de directe effecten van systemisch neurotoxine bij afwezigheid van FUS [geen FUS/QA] beoordeelt. Resultaten in deze groepen worden vergeleken met de primaire PING-groep [FUS/QA].
De PING-methode vereist basisvaardigheden voor de omgang met kleine dieren. Deze omvatten de inductie en het onderhoud van anesthesie, plaatsing van een staartaderlijn, intraveneuze toediening van meerdere agenten in de instelling van een MRI-eenheid, intraveneuze infusie van een geneesmiddel en dierlijke verzorging tijdens de operatieve en postoperatieve periodes. Het vereist ook de mogelijkheid om intracardiale perfusie uit te voeren, weefselsectie, histochemische kleuring, en microscopische analyses. Institutionele opleiding en goedkeuring van een Comité voor dierverzorging en -gebruik, of een gelijkwaardig agentschap, is noodzakelijk voor een aantal van de stappen in het protocol.
Het oorspronkelijke protocol voor de PING-procedure maakte gebruik van herhaalde intraperitoneale injectie van QA over meerdere dagen8,9. Deze aanpak is nog steeds levensvatbaar en effectief. Het huidige protocol wijzigde echter de route en snelheid van QA-beheer. In het bijzonder werd QA intraveneus toegediend tijdens een 1 uur durende infusieperiode na de infusieperiode. Nogmaals, ofwel administratie protocol is effectief. De 4-5 dagen overlevingsperiode gebruikt in het huidige protocol werd aangenomen om het gebruik van de Fluoro-Jade methode voor het opsporen van degeneratieve neuronen te optimaliseren. Als langere overlevingsperioden nodig zijn, dan alternatieve weefsel kleuring methoden zou worden aangegeven. Een dergelijke benadering zou zijn om een neuron-specifieke antilichaam (bijvoorbeeld anti-NeuN) te gebruiken, om immunohistochemisch aan te tonen waar overlevende neuronen bleven na een langere overlevingsperiode na een sonische post-sonicatie. Naast de huidige structurele analyses zouden ook verschillende resultaten nuttig zijn. Bijvoorbeeld, post-PING beoordelingen van elektrofysiologische en gedragsmatige resultaten zou aanzienlijk bevorderen van de karakterisering van de impact van de PING-methode.
Een mogelijke complicatie van FUS-procedures is dat de temperaturen kunnen worden verhoogd in de buurt van de schedel, met name bij het richten van corticale gebieden in de buurt van de schedel. Deze complicatie beperkt momenteel het bereik van de sites (behandeling envelop) vatbaar voor thermische laesie met behulp van hoge intensiteit FUS (HIFU). In de context van PING kunnen thermische verhogingen in de buurt van de schedel ook een beperking van de techniek vertegenwoordigen. Echter, de lage intensiteit van sonicatie gebruikt met PING vermindert het risico van thermische schade, en moet de behandeling envelop uit te breiden in vergelijking met HIFU.
De PING-methode beschikt over verschillende functies die zowel infrastructuurintensief als trainingsintensief zijn. MRI-compatibele FUS-apparatuur en een MRI-faciliteit die is uitgerust voor dierlijk onderzoek zijn vereist. Dit is een aanzienlijke investering in de front-end om de noodzakelijke onderzoeksinfrastructuur te kunnen bieden. Het is echter bemoedigend op te merken dat het aantal sites uitgerust met FUS-technologie snel groeit voor zowel onderzoek als klinische inspanningen. Naarmate het aantal beschikbare sites voor het uitvoeren van dergelijke werkzaamheden toeneemt, zullen de mogelijkheden voor on-site en/of gezamenlijk onderzoek dus toenemen. In termen van opleiding, elke onderzoeker die fus-studies te ondernemen zou profiteren van de opleiding door een onderzoeksgroep ervaren in FUS experimenten. Bijvoorbeeld, de MRgFUS targeting software, terwijl relatief eenvoudig, is gemakkelijker te verwerven wanneer geadviseerd door een ervaren onderzoeker.
Meerdere, alternatieve chirurgische modaliteiten bestaan voor de verwijdering van verstoorde neuronale circuits. Deze omvatten resectief chirurgie, stereotactische laser ablatie, radiochirurgie, hoge intensiteit gerichte echografie, en radiofrequente behandeling. Elk van deze benaderingen is effectief en kan van aanzienlijke therapeutische waarde zijn voor bepaalde medisch hardnekkige aandoeningen. Deze chirurgische modaliteiten bezitten echter een of meer specifieke beperkingen: a) invasieve procedure, b) pannecrotische impact op doelweefsel, c) schade aan aangrenzend, niet-doelweefsel (bijvoorbeeld axonen van passage) en (d) vertraging bij het bereiken van effectieve resultaten. Belangrijke voordelen van de PING-methode zijn dat deze niet-invasief is, (b) geen pannecrotic is, c) de effecten op aangrenzend niet-doelweefsel beperkt en d) snelle resultaten moeten opleveren.
Er zijn verschillende potentiële toekomstige richtingen voor de PING-methode, waaronder zowel preklinische als klinische toepassingen. Met betrekking tot dierproeven biedt de methode een middel voor het produceren van focale neuronale laesies in preklinische modellen van neurologische aandoeningen. Zo hebben we onlangs deze aanpak gebruikt om het effect van PING te testen in een knaagdiermodel van limbische epilepsie19. Behandeling met PING verminderde de frequentie van chronische, spontane aanvallen in een pilocarpine model van limbische epilepsie. Deze studie leverde de eerste, preklinische proof of concept voor het nut van PING bij de behandeling van een neurologische aandoening.
Quinolinic zuur werd geselecteerd voor de PING-procedure om twee primaire redenen. Ten eerste, bestaande literatuur11 geeft aan dat neuronale cel lichaam laesies kunnen worden geproduceerd, terwijl het sparen van andere niet-doelweefsel, zoals axonen van passage. Ten tweede, hoewel QA is een neurotoxische wanneer rechtstreeks geleverd aan de hersenen, het is goed verdragen wanneer systemisch toegediend vanwege de beperkte doorlaatbaarheid via de BBB. De andere toxines die goed worden verdragen perifeer, zoals mononatrium glutamaat (MSG), kan worden beschouwd als alternatieven voor QA. Een belangrijk voordeel van MSG zou zijn dat er een wezenlijke literatuur betreffende het gebruik van deze samenstelling door mensen bestaat. Een belangrijk doel voor toekomstig onderzoek zal zijn om de specificiteit te definiëren van schade die door QA of andere systemisch toegediende neurotoxinen wordt veroorzaakt in termen van potentiële celtypespecificiteit. Een andere potentiële preklinische toepassing voor deze algemene aanpak zou zijn om een perifeer getolereerde verbinding die giftig is voor andere celtypen in de hersenen parenchyma, zoals gliacellen toedienen. Bijvoorbeeld, perifere injectie van een toxine dat oligodendroglia beïnvloedt kan focale demyelinatie in een gebied van witte stof mogelijk maken. Dit zou gerichte demyelinatie van een deel van een gericht traject mogelijk maken. Bovendien zou de aanpak het mogelijk kunnen maken om de seriële demyelinatie van dezelfde locatie te beoordelen, wat een kenmerk is van relapsing-remitting multiple sclerose.
Met betrekking tot de mogelijke toekomstige toepassingen van PING bij de mens, neurologische aandoeningen waarbij verstoorde neurale circuits zijn een doelwit voor behandeling met PING. Op basis van onze eerste preklinische bevindingen19, Resistente Epilepsie (DRE) is een veelbelovend voorbeeld van een aandoening die kunnen profiteren van PING. Chirurgische behandeling van DRE kan zeer gunstig zijn, maar blijft een van de meest onderbenutte behandelingen die eigenlijk effectief is voor een grote neurologische aandoening. Een voordeel van PING in deze instelling is dat het volume van het doelgebied kan worden aangepast en vergroot door gebruik te maken van seriële sonicaties op meerdere locaties. Dit zou het mogelijk maken nauwkeuriger richten van onregelmatig gevormde en onregelmatig formaat doelen in de hersenen parenchyma. Het translationele proces voor PING zou noodzakelijkerwijs het testen van de veiligheid van systemische toediening van QA bij niet-menselijke primaten, en uiteindelijk bij de mens inhouden. Kynurenine metabolieten worden meestal gewist uit het bloed door de nieren en geëlimineerd via urineren20,21; het lot van geïnjecteerde QA is echter niet in dit model beoordeeld. Niettemin is het belangrijk om in deze context op te merken dat hoge niveaus van systemisch toegediende QA goed worden verdragen bij knaagdieren. Belangrijk is dat het gebruik van PING de behandeling van de standaardzorg niet uitsluit. Waren enkele of meerdere PING-behandelingen om ineffectief te blijken bij een bepaalde patiënt, dan zouden andere procedures, zoals resecatieve of ablatieve chirurgie, levensvatbare opties blijven. Het is ook belangrijk te erkennen dat de klinische omgeving waarin PING zou ontstaan, ideaal is voor vertaling en implementatie22,23,24,25,26. Structurele en functionele beeldvormingsmodaliteiten worden snel verfijnder, waardoor de juiste streefwaarden voor nauwkeurige interventies beter kunnen worden vastgesteld. Ook is er geen noodzaak voor het ontwerp, de bouw, of goedkeuring van een nieuw medisch apparaat voor PING. MR-guided, high-intensity FUS is al een gevestigde en goedgekeurde modaliteit voor meerdere indicaties, waaronder neurologische toepassingen. En, zoals eerder vermeld, hebben de afgelopen jaren getuige geweest van een wildgroei van locaties waar FUS al klinisch in gebruik is. Samen suggereren deze voordelen een veelbelovende ontwikkeling voor PING voor meerdere toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Rene Jack Roy voor zijn uitstekende technische ondersteuning op het gebied van MRI. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (R01 NS102194 aan KSL en R01 CA217953-01 aan MW), het Chester Fund (KSL) en de Focused Ultrasound Foundation (KSL en JW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T-ClinScan MRI System | Bruker Biospin, Ettinglen, Germany | MR Image Acquisition | |
| Acoustic Gel | Litho CLEAR | 11-601 | High Viscosity Accoustic Transmission Gel |
| DPX Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 13512 | Resin Based Cover Glass Mountant |
| Fluoro-Jade B | EDM Millipore | AG310 | High Affinity Stain For Degenerating Neurons |
| Fluovac anesthetic adsorber | Harvard Apparatus | 34-0388 | Organic Anaesthesia Scavenger |
| FUS System | Image Guided Therapy, Pessac, France | LabFUS | MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System |
| Gadodiamide | GE Healthcare AS, Oslo, Norway | Omniscan | MR Contrast Agent |
| Heparin | SAGENT | NDC2502140010 | Anti-Coagulant |
| Hypodermic needle 30G x 1/2 | Becton-Dickinson | 26027 | Tail Vein Catheterization |
| Insulin syringe 28G1/2 (1ml) | EXEL | 26027 | Administration of Injectables to Tail Vein Catheter |
| Isofluorane atomizer | SurgiVet | VCT302 | Anaesthesia Administration |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC1169567762 | Anaesthesia |
| KMnO4 | Sigma | 223468 | Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining |
| Microbubbles | Produced internally: A. Klibanov | 305106 | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Microbubbles (commercial source) | Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA | Definity microbubbles | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments | Model 1030 | Respiration Monitoring |
| Multisizer 3 Coulter counter | Beckman-Coulter, Hialeah, FL | Multisizer 3 | Used to Determine Average Size of Microbubbles |
| Optixcare EYE LUBE | CLC MEDICA, Ontario, Canada | 11611 | Corneal Protectant-Eye Lube |
| PE10 tubing | Becton-Dickinson | 427401 | Tail Vein Catheter Component |
| Quinolinic Acid | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | CAS 89-00-9 | Neurotoxin |
| Sprague-Dawley Rats | Taconic Biosciences | SD-M | Rat Model |
| Syringe Pump | Carnegie Medicin | CMA 100 | Controlled Delivery of Quinolinic Acid |
| Thermoguide Software | Image Guided Therapy, Pessac, France | Thermoguide | Drives Lab FUS System |
| Tish Rats | In-house colony | Rat Model | |
| Veet depilatory cream | Reckitt Benckiser | Removal of Scalp Hair |
References
- Wiebe, S., Eliasziw, M., Matijevic, S. I. Changes in quality of life in epilepsy: How large must they be to be real. Epilepsia. 42, 113-118 (2001).
- McClelland, S., Guo, H., Okuyemi, K. S. Population-based analysis of morbidity and mortality following surgery for intractable temporal lobe epilepsy in the United States. Archives of Neurology. 68, 725-729 (2011).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhotseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: histological findings in rabbits. Ultrasound in Medicine & Biology. 31, 1527-1537 (2005).
- Park, J., Zhang, Y., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A., McDannold, N. J. The kinetics of blood brain barrier permeability and targeted doxorubicin delivery into brain induced by focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 162 (1), 134-142 (2012).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in the presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30, 979-989 (2004).
- Vlachos, F., Tung, Y. S., Konofagou, E. E. Permeability assessment of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using dynamic contrast-enhanced MRI. Physics in Medicine and Biology. 55 (18), 5451-5466 (2010).
- Zhang, Y., et al. focal disconnection of brain circuitry using magnetic resonance-guided low-intensity focused ultrasound to deliver a Neurotoxin. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (9), 2261-2269 (2016).
- Zhang, Y., et al. Testing different combinations of acoustic pressure and doses of quinolinic acid to induce focal-neuron loss in mice using transcranial low-intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 45, 129-136 (2018).
- Foster, A. C., Miller, L. P., Oldendorf, W. H., Schwarcz, R. Studies on the disposition of quinolinic acid after intracerebral or systemic administration in the rat. Experimental Neurology. 84, 428-440 (1984).
- Beskid, M., Różycka, Z., Taraszewska, A. Quinolinic acid: effect on the nucleus arcuatus of the hypothalamus in the rat (ultrastructural evidence). Experimental and Toxicologic Pathology. 49, 477-481 (1997).
- Schwarcz, R., Köhler, C. Differential vulnerability of central neurons of the rat to quinolinic acid. Neuroscience Letters. 38, 85-90 (1983).
- Schwarcz, R., Whetsell, W. O., Mangano, R. M. Quinolinic acid: an endogenous metabolite that produces axon-sparing lesions in rat brain. Science. 219, New York, N.Y. 316-318 (1983).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Agari, T., et al. Successful treatment of epilepsy by resection of periventricular nodular heterotopia. Acta Medica Okayama. 66 (6), 487-492 (2012).
- Lee, K. S., et al. A genetic animal model of human neocortical heterotopia associated with seizures. The Journal of Neuroscience. 17 (16), 6236-6242 (1997).
- Schottler, F., Couture, D., Rao, A., Kahn, H., Lee, K. S. Subcortical connections of normotopic and heterotopic neurons in sensory and motor cortices of the tish mutant rat. The Journal of Comparative Neurology. 395 (1), 29-42 (1998).
- Schottler, F., et al. Normotopic and heterotopic cortical representations of mystacial vibrissae in rats with subcortical band heterotopia. Neuroscience. 108 (2), 217-235 (2001).
- Zhang, Y., et al. Effects of non-invasive, targeted, neuronal lesions on seizures in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Ultrasound in Medicine and Biology. 46, 1224-1234 (2020).
- Holmes, E. W. Determination of serum kynurenine and hepatic tryptophan dioxygenase activity by high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 518-525 (1988).
- Shibata, K., Ohno, T., Sano, M., Fukuwatari, T. The urinary ratio of 3-hydroxykynurenine/3-hydroxyanthranilic acid is an index of predicting the adverse effects of D-trytophan in rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminology. 60, 261-268 (2014).
- Aubry, J. -F., Tanter, M. MR-guided transcranial focused ultrasound. Therapeutic Ultrasound. , 97-111 (2016).
- Elias, W. J., et al. A Randomized trial of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 375, 730-739 (2016).
- Ghanouni, P., et al. Transcranial MR-guided focused ultrasound: a review of the technology and neuro applications. American Journal of Roentgenology. 205, 150-159 (2015).
- Martin, E., Jeanmonod, D., Morel, A., Zadicario, E., Werner, B. High-intensity focused ultrasound for noninvasive functional neurosurgery. Annals of Neurology. 66, 858-861 (2009).
- Monteith, S., et al. Transcranial magnetic resonance-guided focused ultrasound for temporal lobe epilepsy: a laboratory feasibility study. Journal of Neurosurgery. 12, 1-8 (2016).
