Summary
Das Ziel des Protokolls ist es, eine Methode zur Produktion nicht-invasiver neuronaler Läsionen im Gehirn bereitzustellen. Die Methode nutzt Magnetresonanz-geführten fokussierten Ultraschall (MRgFUS), um die Bluthirn-Schranke in einer vorübergehenden und fokalen Weise zu öffnen, um ein zirkulierendes Neurotoxin an das Gehirn Parenchym zu liefern.
Abstract
Chirurgische Eingriffe können sehr effektiv für die Behandlung bestimmter Arten von medizinisch unlösbaren neurologischen Erkrankungen sein. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für Störungen, bei denen identifizierbare neuronale Schaltkreise eine Schlüsselrolle spielen, wie Epilepsie und Bewegungsstörungen. Derzeit verfügbare chirurgische Modalitäten, während wirksam, beinhalten in der Regel einen invasiven chirurgischen Eingriff, die zu chirurgischen Verletzungen an Nicht-Zielgewebe führen kann. Folglich wäre es von Wert, das Spektrum der chirurgischen Ansätze zu erweitern, um eine Technik, die sowohl nicht-invasiv als auch neurotoxisch ist.
Hier wird eine Methode zur nicht-invasiven Herstellung fokaler, neuronaler Läsionen im Gehirn vorgestellt. Dieser Ansatz nutzt schwachintensiven fokussierten Ultraschall zusammen mit intravenösen Mikroblasen, um die Bluthirnschranke (BBB) vorübergehend und fokal zu öffnen. Die Periode der transienten BBB-Öffnung wird dann genutzt, um ein systemisch verabreichtes Neurotoxin in einen gezielten Hirnbereich zu liefern. Das Neurotoxin Chinolinsäure (QS) ist normalerweise BBB-undurchlässig und gut verträglich, wenn es intraperitoneal oder intravenös verabreicht wird. Jedoch, Wenn QA erhält direkten Zugang zu Gehirngewebe, Es ist toxisch für die Neuronen. Diese Methode wurde bei Ratten und Mäusen verwendet, um bestimmte Hirnregionen anzusprechen. Unmittelbar nach MRgFUS wird eine erfolgreiche Eröffnung des BBB durch kontrastverstärkte T1-gewichtete Bildgebung bestätigt. Nach dem Eingriff zeigt die T2-Bildgebung Verletzungen, die auf den Zielbereich des Gehirns beschränkt sind, und der Verlust von Neuronen im Zielbereich kann post-mortem unter Verwendung histologischer Techniken bestätigt werden. Bemerkenswert ist, dass Tiere, die mit Kochsaline statt QA injiziert werden, die Öffnung des BBB zeigen, aber Punkt zeigen keine Verletzung oder neuronalen Verlust. Diese Methode, die als Precise Intracerebral Non-invasive Guided Surgery (PING) bezeichnet wird, könnte einen nicht-invasiven Ansatz zur Behandlung neurologischer Störungen im Zusammenhang mit Störungen in neuronalen Schaltkreisen bieten.
Introduction
Der Zweck dieser Methode ist es, ein Mittel zur Produktion von nicht-invasiven neuronalen Läsionen in einer gezielten Region des Gehirns zu bieten. Der Grund für die Entwicklung eines solchen Ansatzes ist die Trennung neuronaler Schaltkreise, die zu neurologischen Störungen beitragen. Zum Beispiel kann eine Operation bei der Behandlung bestimmter medizinisch unlösbarer neurologischer Erkrankungen, wie z. B. medikamentenresistenter Epilepsie (DRE)1 ,sehr effektiv sein. Jedoch, jede der verfügbaren chirurgischen Modalitäten besitzen Einschränkungen in Bezug auf die Produktion unerwünschte Kollateralschäden am Gehirn. Traditionelle resektive Chirurgie kann hochinvasiv mit dem Risiko von Blutungen, Infektionen, Blutgerinnseln, Schlaganfall, Krampfanfälle, Schwellung des Gehirns, und Nervenschäden2sein. Zu den alternativen zur resektiven Chirurgie, die minimalinvasiv oder nicht-invasiv sind, gehören die interstitielle Lasertherapie und die Radiochirurgie, die sich auch bei der Unterdrückung von Anfällen bei DRE als wirksam erwiesen haben. In jüngerer Zeit haben thermische Läsionen, die durch hochintensiven fokussierten Ultraschall (HIFU) erzeugt werden, vielversprechende Auswirkungen auf die Reduzierung von Anfällen gezeigt. HIFU ist nicht-invasiv; Allerdings ist sein Behandlungsfenster derzeit auf zentralere Bereiche des Gehirns beschränkt, da das Risiko einer thermischen Verletzung des Nichtzielgewebes in der Nähe des Schädels besteht. Trotz solcher Einschränkungen überwiegen die Vorteile einer Operation oft die potenziellen Risiken. Zum Beispiel, obwohl Chirurgie für DRE Kollateralschäden verursachen kann, seine positiven Auswirkungen bei der Unterdrückung von Anfällen und Verbesserung der Lebensqualität in der Regel über die chirurgischen Risiken.
Die hier beschriebene Methode, Precise Intracerebral Non-invasive Guided Surgery (PING), wurde zum Zweck der Trennung von neuronalen Schaltkreisen entwickelt, während Kollateralschäden im Gehirn begrenzt wurden. Die Methode nutzt niedrigintensive fokussierten Ultraschall kombiniert mit intravenöser Injektion von Mikroblasen, um die BBB zu öffnen, um ein Neurotoxin zu liefern. Dieser Ansatz produziert keine thermischen Läsionen an das Gehirn3,4,5,6,7, und die Periode der BBB-Öffnung kann genutzt werden, um BBB-undurchlässige Verbindungen an das Gehirn Parenchym zu liefern. Die Öffnung des BBB ist transient und kann gezielt mittels Magnetresonanztomographie-Führung erzeugt werden. In unseren Studien wurde die Zeit der BBB-Öffnung genutzt, um ein zirkulierendes Neurotoxin in einen gezielten Bereich des Gehirnparenchyms bei Ratten und Mäusen zu liefern8,9. Quinolinsäure ist ein Neurotoxin, das gut verträglich ist, wenn es intravenös verabreicht wird10, intraarterial10, oder intraperitoneally8,9,11. Der Mangel an QS-Toxizität ist auf seine schlechte BBB-Permeabilität zurückzuführen, die als vernachlässigbar10gemeldet wurde. Im Gegensatz dazu produziert die direkte Injektion von QA in das Gehirn Parenchym neuronale Läsionen, die benachbarte Axone12,13schonen. So, wenn zirkulierende QA erhält Zugang zum Gehirn Parenchym im Zielbereich der BBB-Öffnung, neuronalen Tod wird produziert8,9. Die vorliegende Methode erzeugt somit gezielt und nicht-invasiv einen fokalen neuronalen Verlust.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom University of Virginia Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Herstellung von Reagenzien
- Am Tag der Operation 6,0 ml injizierbare Chinolsäure (QS) zubereiten. 450 mg QA in 4,0 ml von 1,0 N NaOH auflösen. 0,6 ml 10x PBS, pH auf 7,4 geben und mit dH2O auf ein Endvolumen von 6,0 ml bringen. Filter durch 0,22 m Spritzenfilter. Die Lösung ist 2 Wochen lang bei 4 °C stabil.
- Bereiten Sie eine wässrige Dispersion von Mikroblasen in normaler Saline durch Sondenbeschallung aus Decafluorbutangas vor und stabilisieren Sie mit DSPC/PEG Stearat-Monolayer-Schale12.
- Größe Mikroblasen durch Flotation bei normaler Schwerkraft. Bestimmen Sie die Mikroblasenkonzentration und -größe durch Elektrozonenerfassung mit Multisizer III Zähler. Die Mikroblasenkonzentration und -größenverteilung sollte 6 x 108/ml bzw. 2 m (mittlerer Partikeldurchmesser) betragen. Die größten Blasen werden durch Flotationsausschluss/-trennung entfernt.
- Alternativ können Sie handelsübliche Mikrobubbles kaufen.
2. Zubereitung von Tieren
- Akklimatisieren Sie das Tier (Ratte oder Maus) für 3 Tage nach der Lieferung. Die hier beschriebenen Experimente verwendeten Sprague-Dawley-Ratten (5–6 Wochen) oder telenzephalische interne strukturelle Heterotopie (tish) Ratten (lokale Kolonie).
- Beherbergen Sie die Tiere unter einem 12-Stunden-Licht: 12 Stunden dunklen Zyklus.
- Zeichnen Sie die Gewichte der Tiere auf. Diese Informationen sind während des gesamten Verfahrens wichtig.
- Erhalten Sie T2-gewichtete MR-Bilder am Tag vor dem FUS-Verfahren, um präoperative Basisbilder zu erstellen. Verwenden Sie die folgenden Parameter für die T2-Bildgebung: Wiederholungszeit/Echozeit [TR/TE] =3.000/138 Millisekunden, 3 Mittelwerte, Sichtfeld=29 x 45 mm2, Matrixgröße = 125 x 192, Scheibendicke = 0,23 mm.
- Anästhesisieren Sie das Tier mit Isofluran (4% Induktion, 2% Wartung). Bestätigen Sie die ausreichende Tiefe der Anästhesie mit einer Zehenprise. Tragen Sie eine ophthalmologische Salbe auf die Augen auf.
- Rasieren Sie die Kopfhaut des Tieres, und entfernen Sie die restlichen Haare mit Enthaarungscreme.
- Verwenden Sie einen Schwanzvenenkatheter für die Infusion von Mikroblasen, Kontrastmittel und QUALITÄTS. Die Katheter bestehen aus einer Länge von PE10-Schläuchen, die mit einer 30 G x 1/2 Zoll Nadel ausgestattet sind. Lassen Sie eine 1 ml Spritze mit heparinisierter Saline in linie, entfernt und wieder befestigt werden, wenn die Linie für Infusionen verwendet wird.
3. MRT- und PING-Verfahren
- Führen Sie die MRT auf einer 7 T MR-Einheit mit einer Gradientenstärke von 600 mT/m/ms durch (Abbildung 1 und Abbildung 2). Führen Sie MRT-Erfassungen mit einer im FUS-System integrierten Oberflächenspule durch.
ANMERKUNG: Das für die Experimente verwendete FUS-System besteht aus drei Teilen: (i) das Beschallungssystem ist ein MR-kompatibles vorfokussiertes, 8-Elemente-Ringarray, 1,5 MHz-Wandler (Kugelradius = 20 mm x 2 mm, aktiver Durchmesser = 25 mm (f-Zahl = 0,8), mit 80 % elektrisch-akustischer Effizienz, der an einen Phasen-Array-Generator und einen HF-Verstärker angeschlossen ist; ii) eine MR-kompatible motorisierte Positionierstufe, um den Messumformer in vorder-posteriorer und medio-lateraler Richtung zu bewegen; iii) eine Thermoguide-Workstation zur Steuerung der Beschallung, einschließlich elektronischer Fokussierung durch Phasenmodulation zur Einstellung der Brenntiefe (Abbildung 2). - Legen Sie das anästhesierte Tier auf die Coilschlittenbaugruppe (Abbildung 1) des MR-kompatiblen FUS-Systems in der anfälligen Position. Immobilisieren Sie das Tier mit der Schneidezähne und Ohrstangen in der Wiege des Schlittens eingebaut.
- Tragen Sie akustisches Gel auf die wasserbenetzte Kopfhaut auf; Um sicherzustellen, dass keine Blasen vorhanden sind, legen Sie die Membranbarriere des Wasserkreislaufteils der Wandlergruppe über dem Schädel des Tieres und senken Sie die Wandlerbaugruppe so weit wie möglich in einer parallelen planaren Ausrichtung relativ zur Schädelplatte. Legen Sie das Zwerchfell des Wandlers fest gegen die rasierte Kopfhaut des Tieres direkt über die Schädelplatte.
- Befestigen Sie einen pneumatischen Sensor mit chirurgischem Klebeband am Körper, um die Atmung zu überwachen. Positionieren Sie den pneumatischen Sensor auf dem linken unteren Rippenkäfig.
- Bewegen Sie die FUS-Armbaugruppe mit Spule, Schlitten und Tier in die 7T-MRT-Einheit (Abbildung 1).
- Führen Sie eine T2-Scout-Sequenz aus, um die allgemeine physikalische Position der Wandlerbaugruppe relativ zum Kopf des Tieres zu bestimmen, und nehmen Sie bei Bedarf mechanische Anpassungen vor (Abbildung 2). Die Parameter für die T2-Bildgebung sind: Wiederholungszeit/Echozeit [TR/TE] = 3.000/138 Millisekunden, 3 Mittelwerte, Sichtfeld = 29 x 45 mm2, Matrixgröße = 125 x 192, Scheibendicke = 0,23 mm. Die Thermometrie wird in diesem Protokoll in der Regel nicht verwendet.
- Erhalten Sie T2-Bilder, um die Position des Messumformers zu verfeinern. Definieren Sie genau die Dreh- und Stelle des Messumformers und geben Sie den/die Brennpunkt der Beschallung mithilfe der Targeting-Funktion der Software an. Die Parameter für die T2-Bildgebung sind: Wiederholungszeit/Echozeit [TR/TE] = 3.000/138 Millisekunden, 3 Mittelwerte, Sichtfeld = 29 x 45 mm2, Matrixgröße = 125 x 192, Scheibendicke = 0,23 mm.
- Kurz vor der Beschallung 300 l/kg Mikroblasen14 über die Schwanzvene injizieren.
- Verwenden Sie einen 1,5 MHz-Wandler, um Beschallungen zu erzeugen (30 ms Wellenpaket, 3% Einschaltzyklus, 1 Hz Burst-Wiederholungsfrequenz, 240 s Dauer/Beschallung).
- Unmittelbar nach der Beschallung gadodiamid-Kontrastmittel über die Schwanzvene injizieren und dann T1-gewichtete Plus-Kontrast-Scans durchführen, um die Öffnung des BBB und die Genauigkeit des Targetings zu bestätigen. Die Parameter für die T1-gewichtete Bildgebung: TR/TE = 900/12 Millisekunden, 2 Mittelwerte, Sichtfeld = 24 x 30 mm2, Matrixgröße = 208 x 256, Scheibendicke = 0,7 mm. In der Regel wird ein einzelner T1-Scan durchgeführt.
- Entfernen Sie den FUS-Arm und schlitten aus der MRT, und legen Sie das Tier auf einem Heizkissen auf 40 °C eingestellt, während 2% Isoflurananästhesie.
- Ab 30 min nach der Beschallung verwenden Sie eine Spritzenpumpe, um QA (75 mg/ml-Stammlösung) über die Schwanzvene für 1 h mit einer Rate von 16,8 l/min zu infundieren, um eine Enddosis von 225 mg/kg (q.s. bis 1,0 ml Saline) zu erreichen.
- Wenn die Infusion abgeschlossen ist, beenden Sie die Anästhesie, halten Sie das Tier auf einem Heizkissen bis zur Alarmierung. Legen Sie das Tier in einen Käfig und führen Sie routinemäßige Kontrollen für seine Aktivität alle 15 min, für mehrere Stunden nach dem Eingriff.
- Bringen Sie das Tier ins Vivarium zurück und überprüfen Sie alle 6 Stunden für den ersten Tag auf Seenot oder unregelmäßige Aktivität.
- Führen Sie eines Tages nach der Beschallung t2-gewichtete MR-Bildgebung durch, um Schäden im Bereich der Beschallung zu bewerten. Die Parameter für die T2-Bildgebung: Wiederholungszeit/Echozeit [TR/TE] = 3.000/138 Millisekunden, 3 Mittelwerte, Sichtfeld = 29 x 45 mm2, Matrixgröße = 125 x 192, Scheibendicke = 0,23 mm. Bilder werden auf Bereiche mit Hyperintensität ausgewertet, um mögliche Gewebeschäden/Ödeme zu identifizieren.
4. Post-mortem-Analyse des neuronalen Verlustes
- Erlauben Sie eine Nachschallung, Überlebenszeitraum von 4-5 Tagen für die Beurteilung neuronalen Verluste mit Fluoro-Jade-Histochemie.
- Das Tier mit Isofluran tief animieren und über intrakardiale Perfusion mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) einschläfern, gefolgt von 4% Paraformaldehyd im Phosphatpuffer.
- Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und post-fix für 2 Tage in 4% Paraformaldehyd.
- Tauchen Sie das Gehirn in 30% Saccharose für Kryoschutz ein und schneiden Sie Abschnitte mit einer Dicke von 20–30 m mit einem Kryostat.
- Mount Kryostat Abschnitte auf gelatinierte Rutschen und lufttrocken über Nacht.
- Rehydrat gleitet in destilliertem Wasser und dehydriert dann in aufsteigenden Abgestuften Ethanolen. Nach der Dehydrierung gleitet das Rehydrat in absteigenden Ethanolen.
- Transfer-Dias auf eine Lösung von 0,06% Kaliumpermanganat für 15 min auf einem Orbital-Shaker.
- Spülen Sie für 1 min in destilliertem Wasser und übertragen Sie in eine 0,001%ige Lösung von Fluoro-Jade B in 0,1% Essigsäure. Unter sanfter Rührung 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen Sie dreimal für 1 min in destilliertem Wasser.
- Trocknen Sie die Dias auf einem Diawärmer, gleichufen Sie xylole für 3 min und decken Sie mit DPX-Montagemedien ab.
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Representative Results
Dieser Abschnitt beschreibt die Wirkung von PING auf Neuronen, die sich in einer neokortikalen Dysplasie befinden. Gewebedysplasie sind ein häufiges Merkmal im Gehirn von Patienten mit medikamentenresistenter Epilepsie, und chirurgische Entfernung von Anfalls-generogenen Dysplasien kann eine ausgezeichnete Kontrolle von Anfällenbieten 15. Die Definition der Wirkung von PING auf dysplastisches Hirngewebe ist daher eine wichtige Priorität. Ein Rattenmodell der genetischen kortikalen Dysplasie, die tish Ratte, wurde für die Untersuchung dieses Problems ausgewählt, weil das tish Gehirn dysplastisches Gewebe (subkortikale Bandheterotopie) unter einem normalerweise positionierten Neocortex(Abbildung 3)16zeigt. Sowohl die Dysplasie als auch der darüber liegende Neocortex enthalten Neuronen, die funktionell sind und eine charakteristische neokortikale Konnektivität aufweisen17,18.
PING, das auf die Heterotopie des Tish-Ratten-Gehirns abzielte, war wirksam bei der Produktion eines fokalen neuronalen Verlustes der dysplastischen Neuronen (Abbildung 3). T2-gewichtete Bilder, die einen Tag nach dem PING aufgenommen wurden, zeigen Bereiche der Hyperintensität, die mit Gewebeschäden in den Zielbereichen der Beschallung übereinstimmen. Post-mortem Färbung mit Fluor-Jade nach einer 5-tägigen Post-PING-Überlebensphase zeigte degenerierende Neuronen in den Bereichen der T2-Hyperintensität, was die Fähigkeit von PING bestätigt, neuronale Verluste im gezielten dysplastischen neokortikalen Gewebe zu produzieren.
Abbildung 1: Magnetresonanz (MR)-kompatibler Schlitten und 7T MR-Magnet. Die Hauptmerkmale des Schlittens, der verwendet wird, um das Tier im MR-Magneten zu positionieren und Beschallung zu liefern, sind dargestellt (A). Die Schlittenbaugruppe wird in den 7T MR-Magneten (B )eingesetzt angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Kontrollraum für Magnetresonanz (MR) Bildgebung und MR-geführter fokussierter Ultraschall (FUS). Der Kontrollraum besteht aus zwei Primärstationen. Die Station, an der der Ermittler sitzt, ist das Planungsgebiet für die Ausrichtung auf FUS (A). Die zweite Station ist der Kontrollbereich für das MRT-System (B). Das kupferverstärkte Fenster hinter der MRT-Station blickt in den Raum, in dem der 7T-Magnet untergebracht ist. Der Monitor an der FUS-Station zeigt die Software an, die die Führung und die Parameter der Beschallung steuert (C). Dieses Beispiel zeigt eine Beschallung, die auf das Striatum abzielt, das auf einem T2-gewichteten MR-Bild (D) überlagert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: PING produziert neuronalen Verlust im dysplastischen Neocortex des Tish-Ratten-Gehirns. T2-gewichtete MR-Bilder (A,B) wurden einen Tag nach PING erhalten. Die Neocortex [N], die Heterotopie [H] und die seitlichen Ventrikel [LV] sind für die Orientierung s. (A) gekennzeichnet. Bereiche der Hyperintensität [weiße und gelbe Pfeile], die auf Gewebeschäden hinweisen, können in den Zielbereichen der Heterotopie auf beiden Seiten des Gehirns gesehen werden (B). Post-mortem Färbung mit Fluoro-Jade(C-F). Helle grüne Zellen, die degenerierende Neuronen darstellen, werden in den Regionen beobachtet, die den Bereichen der Hyperintensität sowohl auf der linken (C,E; weißen Pfeile) als auch den rechten (D,F; gelben Pfeilen) Seiten des Gehirns entsprechen. Skalenbalken: C,D = 1 mm; E,F = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die PING-Methode wurde entwickelt, um nicht-invasive, gezielte neuronale Läsionen zu erzeugen. Die Methode leitet sich von einer starken und wachsenden Grundlage der Forschung auf dem Gebiet derfokussiertenUltraschall 3,4,5,6,7. Die Fähigkeit, durch vorübergehende Öffnung des BBB einen fokalen Zugang zu bestimmten Bereichen des Hirnparenchyms zu ermöglichen, hat eine Möglichkeit geschaffen, eine Vielzahl von Wirkstoffen zu liefern, die normalerweise keinen Zugang zum Gehirn erhalten würden. Diese Möglichkeit wird weitgehend für die zentrale Lieferung von therapeutischen Wirkstoffen, die schlechte BBB-Permeabilität besitzen, erweitert. Die PING-Methode nutzt die gleiche Chance auf eine andere Weise, indem sie ein Neurotoxin liefert, mit dem ultimativen Ziel, Schaltkreise zu zerstören, die zu neurologischer Dysfunktion beitragen. Aberrante neuronale Schaltung stellt ein wirksames Ziel für chirurgische Interventionen dar, um die Auswirkungen bestimmter neurologischer Erkrankungen zu dämpfen2,15. Das langfristige Ziel der PING-Methode besteht darin, die derzeit verfügbaren Ansätze zum Trennen von Schaltkreisen zu erweitern, die zu neuronaler Dysfunktion beitragen.
Der Entwurf einer umfassenden Studie mit der PING-Methode würde mehrere Kontrollgruppen umfassen. Zu diesen Gruppen gehören: (a) eine unbehandelte Gruppe [Keine FUS/Keine QA]; b) eine Gruppe, die die direkten Auswirkungen von FUS kontrolliert [FUS/No QA]; c) eine Gruppe, die die direkten Auswirkungen von systemischem Neurotoxin ohne FUS bewertet [Keine FUS/QS]. Die Ergebnisse in diesen Gruppen würden mit der primären PING-Gruppe [FUS/QA] verglichen.
Die PING-Methode erfordert Grundfertigkeiten für den Umgang mit Kleintieren. Dazu gehören die Induktion und Aufrechterhaltung der Anästhesie, die Platzierung einer Schwanzvenenlinie, die intravenöse Verabreichung mehrerer Wirkstoffe bei der Einstellung einer MRT-Einheit, die intravenöse Infusion eines Arzneimittels und die Tierpflege während der operativen und postoperativen Perioden. Es erfordert auch die Fähigkeit, intrakardiale Perfusion, Gewebeschnitt, histochemische Färbung, und mikroskopische Analysen durchzuführen. Für mehrere Schritte des Protokolls ist eine institutionelle Schulung und Genehmigung durch einen Ausschuss für Tierpflege und Verwendung oder eine gleichwertige Agentur erforderlich.
Das ursprüngliche Protokoll für das PING-Verfahren nutzte die repetitive intraperitoneale Injektion von QA über mehrere Tage8,9. Dieser Ansatz ist nach wie vor praktikabel und wirksam. Das aktuelle Protokoll änderte jedoch die Route und die Rate der QS-Verwaltung. Insbesondere wurde DIE QA während einer 1 h Nachbeschallungsphase der Infusion intravenös verabreicht. Auch hier ist beide Verwaltungsprotokolle wirksam. Die im aktuellen Protokoll verwendete 4-5-Tage-Überlebensphase wurde angenommen, um die Verwendung der Fluoro-Jade-Methode zum Nachweis degenerierender Neuronen zu optimieren. Wenn längere Überlebenszeiten erforderlich sind, dann würden alternative Gewebefärbungsmethoden angezeigt. Ein solcher Ansatz wäre die Verwendung eines neuronspezifischen Antikörpers (z. B. Anti-NeuN), um immunhistochemisch zu demonstrieren, wo überlebende Neuronen nach einer längeren Überlebensphase nach der Beschallung blieben. Neben den derzeitigen Strukturanalysen wäre auch eine Vielzahl von Ergebnissen von Nutzen. Beispielsweise würden post-PING-Bewertungen von elektrophysiologischen und Verhaltensergebnissen die Charakterisierung der Auswirkungen der PING-Methode erheblich voranbringen.
Eine mögliche Komplikation von FUS-Verfahren ist, dass die Temperaturen in der Nähe des Schädels erhöht werden könnten, insbesondere wenn es um kortikale Bereiche in der Nähe des Schädels geht. Diese Komplikation beschränkt derzeit den Bereich der Standorte (Behandlungshülle), die mit high intensity FUS (HIFU) auf thermische Läsionsmöglichkeiten beschränkt sind. Im Zusammenhang mit PING können thermische Erhöhungen in der Nähe des Schädels auch eine Einschränkung der Technik darstellen. Die geringe Intensität der Beschallung, die mit PING verwendet wird, verringert jedoch das Risiko von thermischen Verletzungen und sollte die Behandlungshülle im Vergleich zu HIFU erweitern.
Die PING-Methode verfügt über mehrere Funktionen, die sowohl infrastruktur- als auch trainingsintensiv sind. MRT-kompatible FUS-Geräte und eine für die Tierforschung ausgestattete MRT-Anlage sind erforderlich. Dies stellt eine beträchtliche Front-End-Investition dar, um die notwendige Forschungsinfrastruktur bereitzustellen. Es ist jedoch ermutigend festzustellen, dass die Zahl der Standorte, die mit FUS-Technologie ausgestattet sind, sowohl für die Forschung als auch für klinische Bemühungen rasch wächst. Mit zunehmender Anzahl der verfügbaren Standorte für solche Arbeiten werden die Möglichkeiten für Vor-Ort- und/oder kollaborative Untersuchungen zunehmen. Im Hinblick auf die Ausbildung würde jeder Prüfer, der FUS-Studien durchführen möchte, von der Ausbildung einer Forschungsgruppe profitieren, die Erfahrung im FUS-Experiment hat. Zum Beispiel, die MRgFUS Targeting-Software, obwohl relativ einfach, ist leichter erworben, wenn von einem erfahrenen Ermittler beraten.
Mehrere, alternative chirurgische Modalitäten existieren für die Entfernung von gestörten neuronalen Schaltkreisen. Dazu gehören resektive Chirurgie, stereotaktische Laserablation, Radiochirurgie, hochintensiver fokussierter Ultraschall und Hochfrequenzbehandlung. Jeder dieser Ansätze ist wirksam und kann für bestimmte medizinisch unlösbare Erkrankungen von erheblichem therapeutischem Wert sein. Diese chirurgischen Modalitäten besitzen jedoch eine oder mehrere spezifische Einschränkungen: (a) invasive Verfahren, b) pannektische Auswirkungen auf das Zielgewebe, (c) Schäden an angrenzendem, nicht zielgerichtetem Gewebe (z. B. Axone des Durchgangs) und (d) Verzögerung bei der Erzielung wirksamer Ergebnisse. Wesentliche Vorteile der PING-Methode sind, dass sie: (a) nicht-invasiv ist, b) nicht pannekrotisch ist, (c) die Auswirkungen auf benachbartes Nichtzielgewebe begrenzt und (d) schnelle Ergebnisse liefern sollte.
Es gibt mehrere mögliche zukünftige Richtungen für die PING-Methode, einschließlich präklinischer und klinischer Anwendungen. In Bezug auf Tierversuche bietet die Methode ein Mittel zur Herstellung fokaler neuronaler Läsionen in präklinischen Modellen neurologischer Erkrankungen. Zum Beispiel haben wir vor kurzem diesen Ansatz verwendet, um die Wirkung von PING in einem Nagetiermodell der limbischen Epilepsie zu testen19. Die Behandlung mit PING reduzierte die Häufigkeit chronischer, spontaner Anfälle in einem Pilokarinmodell der limbischen Epilepsie. Diese Studie lieferte den ersten präklinischen Proof-of-Concept für den Nutzen von PING bei der Behandlung einer neurologischen Erkrankung.
Quinolinsäure wurde aus zwei Hauptgründen für das PING-Verfahren ausgewählt. Erstens zeigt die vorhandene Literatur11 an, dass neuronale Zellkörperläsionen produziert werden können, während andere Nicht-Zielgewebe, wie Axone der Passage, geschont werden. Zweitens, obwohl QA ist ein neurotoxischer, wenn direkt an das Gehirn geliefert, Es ist gut verträglich, wenn systemisch verabreicht wegen seiner begrenzten Durchlässigkeit durch die BBB. Die anderen Toxine, die peripher gut verträglich sind, wie Mononatriumglutamat (MSG), könnten als Alternativen für die Qualitätssicherung in Betracht gezogen werden. Ein wesentlicher Vorteil von MSG wäre, dass es eine umfangreiche Literatur über die Verwendung dieser Verbindung durch den Menschen. Ein wichtiges Ziel für die zukünftige Forschung wird es sein, die Spezifität von Verletzungen zu definieren, die durch QUALITÄTSsicherung oder andere systemisch verabreichte Neurotoxine in Bezug auf die potenzielle Zelltypspezifität erzeugt werden. Eine weitere mögliche präklinische Anwendung für diesen allgemeinen Ansatz wäre die Verabreichung einer peripher tolerierten Verbindung, die toxisch für andere Zelltypen im Gehirnparenchym ist, wie Gliazellen. Zum Beispiel könnte die periphere Injektion eines Toxins, das Oligodendroglia betrifft, eine fokale Demyelination in einem Bereich weißer Materie ermöglichen. Dies würde eine gezielte Entmystinierung eines Teils eines zielgerichteten Pfades ermöglichen. Darüber hinaus könnte der Ansatz denkbarerweise eine Beurteilung der seriellen Demyelination desselben Standorts ermöglichen, was ein Kennzeichen der schubförmig-remittierenden Multiplen Sklerose ist.
Im Hinblick auf die möglichen zukünftigen Anwendungen von PING beim Menschen könnten neurologische Störungen, bei denen gestörte neuronale Schaltkreise ein Ziel sind, für die Behandlung mit PING möglich sein. Basierend auf unseren ersten präklinischen Befunden19ist Drug Resistant Epilepsy (DRE) ein vielversprechendes Beispiel für eine Erkrankung, die von PING profitieren könnte. Chirurgische Behandlung von DRE kann sehr vorteilhaft sein, aber bleibt eine der am meisten unterausgelasteten Behandlungen, die tatsächlich wirksam für eine große neurologische Erkrankung ist. Ein Vorteil von PING in dieser Einstellung besteht darin, dass das Volumen des Zielbereichs konform und vergrößert werden kann, indem serielle Beschallungen an mehreren Standorten verwendet werden. Dies würde eine genauere Ausrichtung von unregelmäßig geformten und unregelmäßig großen Zielen im Hirnparenchym ermöglichen. Der Translationsprozess für PING würde notwendigerweise Tests auf die Sicherheit der systemischen Verabreichung von QUALITÄTS-Fragen bei nichtmenschlichen Primaten und letztlich beim Menschen beinhalten. Kynurenin-Metaboliten werden in der Regel aus dem Blut durch die Nieren gelöscht und durch Wasserlassen eliminiert20,21; das Schicksal der injizierten Qualitätssicherung wurde jedoch in diesem Modell nicht bewertet. Dennoch ist es in diesem Zusammenhang wichtig zu beachten, dass hohe Mengen an systemisch verabreichter Qa bei Nagetieren gut vertragen werden. Wichtig ist, dass die Verwendung von PING eine Behandlung mit dem Standard of Care nicht ausschließen würde. Sollten sich einzelne oder mehrere PING-Behandlungen bei einem bestimmten Patienten als unwirksam erweisen, würden andere Verfahren, wie resekttive oder ablative Operationen, praktikable Optionen bleiben. Es ist auch wichtig zu erkennen, dass das klinische Umfeld, in das PING entstehen würde, ideal für die Übersetzung und Implementierung22,23,24,25,26vorbereitet ist. Die strukturellen und funktionalen bildgebenden Verfahren werden rasch verfeinert, was die Ermittlung geeigneter Ziele für präzise Interventionen besser ermöglicht. Außerdem ist die Planung, Konstruktion oder Genehmigung eines neuen Medizinproduktes für PING nicht erforderlich. MR-geführte, hochintensive FUS ist bereits eine etablierte und anerkannte Modalität für mehrere Indikationen, einschließlich neurologischer Anwendungen. Und, wie bereits erwähnt, haben die letzten Jahre eine Zunahme von Standorten erlebt, an denen FUS bereits im klinischen Einsatz ist. Zusammen schlagen diese Vorteile einen vielversprechenden Entwicklungskurs für PING für mehrere Anwendungen vor.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen Rene Jack Roy für seine hervorragende technische Unterstützung im Bereich MRT. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01 NS102194 an KSL und R01 CA217953-01 an MW), dem Chester Fund (KSL) und der Focused Ultrasound Foundation (KSL und JW) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T-ClinScan MRI System | Bruker Biospin, Ettinglen, Germany | MR Image Acquisition | |
| Acoustic Gel | Litho CLEAR | 11-601 | High Viscosity Accoustic Transmission Gel |
| DPX Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 13512 | Resin Based Cover Glass Mountant |
| Fluoro-Jade B | EDM Millipore | AG310 | High Affinity Stain For Degenerating Neurons |
| Fluovac anesthetic adsorber | Harvard Apparatus | 34-0388 | Organic Anaesthesia Scavenger |
| FUS System | Image Guided Therapy, Pessac, France | LabFUS | MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System |
| Gadodiamide | GE Healthcare AS, Oslo, Norway | Omniscan | MR Contrast Agent |
| Heparin | SAGENT | NDC2502140010 | Anti-Coagulant |
| Hypodermic needle 30G x 1/2 | Becton-Dickinson | 26027 | Tail Vein Catheterization |
| Insulin syringe 28G1/2 (1ml) | EXEL | 26027 | Administration of Injectables to Tail Vein Catheter |
| Isofluorane atomizer | SurgiVet | VCT302 | Anaesthesia Administration |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC1169567762 | Anaesthesia |
| KMnO4 | Sigma | 223468 | Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining |
| Microbubbles | Produced internally: A. Klibanov | 305106 | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Microbubbles (commercial source) | Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA | Definity microbubbles | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments | Model 1030 | Respiration Monitoring |
| Multisizer 3 Coulter counter | Beckman-Coulter, Hialeah, FL | Multisizer 3 | Used to Determine Average Size of Microbubbles |
| Optixcare EYE LUBE | CLC MEDICA, Ontario, Canada | 11611 | Corneal Protectant-Eye Lube |
| PE10 tubing | Becton-Dickinson | 427401 | Tail Vein Catheter Component |
| Quinolinic Acid | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | CAS 89-00-9 | Neurotoxin |
| Sprague-Dawley Rats | Taconic Biosciences | SD-M | Rat Model |
| Syringe Pump | Carnegie Medicin | CMA 100 | Controlled Delivery of Quinolinic Acid |
| Thermoguide Software | Image Guided Therapy, Pessac, France | Thermoguide | Drives Lab FUS System |
| Tish Rats | In-house colony | Rat Model | |
| Veet depilatory cream | Reckitt Benckiser | Removal of Scalp Hair |
References
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