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Neuroscience

Lesión neuronal dirigida para la desconexión no invasiva del circuito cerebral

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61271
* These authors contributed equally

Summary

El objetivo del protocolo es proporcionar un método para producir lesiones neuronales no invasivas en el cerebro. El método utiliza ultrasonido focalizado guiado por resonancia magnética (MRgFUS) para abrir la barrera hematoencefálica de una manera transitoria y focal, con el fin de entregar una neurotoxina circulante al parénquima cerebral.

Abstract

La intervención quirúrgica puede ser bastante eficaz para tratar ciertos tipos de enfermedades neurológicas médicamente intratables. Este enfoque es particularmente útil para trastornos en los que los circuitos neuronales identificables juegan un papel clave, como la epilepsia y los trastornos del movimiento. Actualmente las modalidades quirúrgicas disponibles, si bien son efectivas, generalmente implican un procedimiento quirúrgico invasivo, que puede resultar en lesiones quirúrgicas a tejidos no objetivo. En consecuencia, sería de valor ampliar la gama de enfoques quirúrgicos para incluir una técnica que no sea invasiva y neurotóxica.

Aquí, se presenta un método para producir lesiones neuronales focales en el cerebro de una manera no invasiva. Este enfoque utiliza ultrasonido enfocado de baja intensidad junto con microburbujas intravenosas para abrir transitoria y focalmente la Barrera Hemáncera (BBB). El período de apertura transitoria de BBB se explota entonces para entregar focalmente una neurotoxina administrada sistémicamente a un área cerebral dirigida. El ácido quinolinico de neurotoxina (QA) es normalmente impermeable a BBB, y es bien tolerado cuando se administra por vía intraperitoneal o intravenosa. Sin embargo, Cuando qa gana acceso directo al tejido cerebral, es tóxico para las neuronas. Este método se ha utilizado en ratas y ratones para apuntar a regiones cerebrales específicas. Inmediatamente después de MRgFUS, la apertura exitosa del BBB se confirma utilizando imágenes ponderadas en T1 mejoradas en contraste. Después del procedimiento, las imágenes T2 muestran una lesión restringida a la zona objetivo del cerebro y la pérdida de neuronas en el área objetivo se puede confirmar post mortem utilizando técnicas histológicas. En particular, los animales inyectados con solución salina en lugar de QA demuestran la apertura del BBB, pero punto no exhiben lesión o pérdida neuronal. Este método, llamado Precise Intracerebral Non-invasive Guided Surgery (PING) podría proporcionar un enfoque no invasivo para el tratamiento de trastornos neurológicos asociados con alteraciones en los circuitos neuronales.

Introduction

El propósito de este método es proporcionar un medio para producir lesiones neuronales no invasivas en una región específica del cerebro. La razón para desarrollar este enfoque es desconectar el circuito neuronal contribuyendo a los trastornos neurológicos. Por ejemplo, la cirugía puede ser bastante eficaz en el tratamiento de ciertos trastornos neurológicos médicamente intratables, como la epilepsia farmacorresistente (DRE)1. Sin embargo, cada una de las modalidades quirúrgicas disponibles posee limitaciones en términos de producir daño colateral indeseable al cerebro. La cirugía resectiva tradicional puede ser altamente invasiva con el riesgo de sangrado, infección, coágulos sanguíneos, accidente cerebrovascular, convulsiones, hinchazón del cerebro y daño a los nervios2. Las alternativas a la cirugía resectiva que son mínimamente invasivas o no invasivas incluyen la terapia térmica intersticial láser y la radiocirugía, que también han demostrado ser eficaces para suprimir las convulsiones en DRE. Más recientemente, las lesiones térmicas producidas por ultrasonido focalizado de alta intensidad (HIFU) han demostrado ser prometedoras en la reducción de las convulsiones. HIFU no es invasivo; sin embargo, su ventana de tratamiento actualmente se limita a áreas más centrales del cerebro debido al riesgo de lesión térmica al tejido no objetivo situado en las proximidades del cráneo. A pesar de estas limitaciones, los beneficios de la cirugía a menudo superan los riesgos potenciales. Por ejemplo, aunque la cirugía para la DRE puede producir daño cerebral colateral, sus efectos beneficiosos en la supresión de las convulsiones y la mejora de la calidad de vida suelen prevalecer sobre los riesgos quirúrgicos.

El método descrito en este documento, Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING), fue desarrollado con el propósito de desconectar los circuitos neuronales, al tiempo que limita el daño cerebral colateral. El método utiliza ultrasonido centrado de baja intensidad combinado con inyección intravenosa de microburbujas para abrir el BBB, con el fin de entregar una neurotoxina. Este enfoque no produce lesiones térmicas al cerebro3,4,5,6,7, y el período de apertura BBB puede ser explotado para entregar BBB-compuestos impermeables al parénquima cerebral. La apertura del BBB es transitoria y se puede producir de manera específica mediante la guía por imágenes por resonancia magnética. En nuestros estudios, el período de apertura de BBB se ha utilizado para entregar una neurotoxina circulante a una zona específica del parénquima cerebral en ratas y ratones8,,9. El ácido quinolinico es una neurotoxina bien tolerada cuando se administra por vía intravenosa10,intraarterialmente10, o intraperitonealmente8,9,11. La falta de toxicidad de control de calidad se debe a su escasa permeabilidad del BBB, que se ha informado de que es insignificante10. Por el contrario, la inyección directa de QA en el parénquima cerebral produce lesiones neuronales que evitan los axones vecinos12,,13. Por lo tanto, cuando el control de calidad circulante obtiene acceso al parénquima cerebral en el área objetivo de la apertura de BBB, la muerte neuronal se produce8,,9. El método actual produce así la pérdida neuronal focal de una manera precisa dirigida y no invasiva.

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Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia.

1. Preparación de reactivos

  1. El día de la cirugía, prepare 6,0 ml de ácido quinolinico inyectable (QA). Disolver 450 mg de QA en 4,0 ml de 1,0 N NaOH. Añadir 0,6 ml de 10 veces PBS, pH a 7,4, y llevar a un volumen final de 6,0 ml con dH2O. Filtrar a través de filtro de jeringa de 0,22 m. La solución es estable durante 2 semanas a 4oC.
  2. Preparar una dispersión acuosa de microburbujas en solución salina normal mediante sonicación de sonda de gas descafluorobutano y estabilizar con dspC/PEG stearate monocapa12.
  3. Tamaño de microburbujas por flotación a gravedad normal. Determinar la concentración y el tamaño de la microburbuja mediante la detección de electrozona mediante el contador Multisizer III. La concentración de microburbujas y la distribución del tamaño deben ser de 6 x10 8/mL y 2 m (diámetro medio de partículas), respectivamente. Las burbujas más grandes se eliminan por exclusión/separación de flotación.
  4. Alternativamente, compre microburbujas disponibles comercialmente.

2. Preparación de animales

  1. Aclimatar al animal (rata o ratón) durante 3 días después del parto. Los experimentos descritos aquí utilizaron ratas Sprague-Dawley (5-6 semanas de edad) o ratas de heterotopia estructural interna (tish) telencéfalas (colonia local).
  2. Casa a los animales bajo una luz de 12 horas: 12 horas de ciclo oscuro.
  3. Registre los pesos de los animales. Esta información es importante a lo largo del procedimiento.
  4. Obtenga imágenes de RM ponderadas por T2 el día antes del procedimiento FUS para establecer imágenes de línea base preoperatorias. Utilice los siguientes parámetros para las imágenes T2: tiempo de repetición/tiempo de eco [TR/TE] a 3.000/138 milisegundos, 3 promedios, campo de visión 29 x 45 mm2, tamaño de matriz a 125 x 192, espesor de la rebanada a 0,23 mm.
  5. Anestfetizar al animal con isoflurano (4% inducción, 2% mantenimiento). Confirme una profundidad adecuada de la anestesia con un pellizco en la dedo del dedo delfín. Aplicar una pomada oftálmica en los ojos.
  6. Afeitar el cuero cabelludo del animal, y eliminar el cabello restante con crema depilatoria.
  7. Utilice un catéter de vena de cola para la infusión de microburbujas, agente de contraste y control de calidad. Los catéteres consisten en una longitud de tubo PE10 equipado con una aguja de 30 G x 1/2 pulgada. Deje una jeringa de 1 ml con solución salina heparinizada en línea, que se extraerá y se volverá a unir cuando la línea se utilice para perfusiones.

3. Procedimientos de RMN y PING

  1. Realice la RMN en una unidad MR de 7 T con una resistencia de gradiente de 600 mT/m/ms(Figura 1 y Figura 2). Realice adquisiciones de RMN utilizando una bobina de superficie incorporada en el sistema FUS.
    NOTA: El sistema FUS utilizado para los experimentos consta de tres partes: (i) el sistema de sonicación es un matriz anular preenfocable de 8 elementos compatible con MR, transductor de 1,5 MHz (radio esférico a 20 mm a 2 mm, diámetro activo a 25 mm (número f a 0,8), con una eficiencia eléctrica-acústica del 80%, que está conectado a un generador de matriz por fases y amplificador de potencia de RF; (ii) una etapa de posicionamiento motorizado compatible con RMN para mover el transductor en la dirección anterior-posterior y la dirección medio-lateral; (iii) una estación de trabajo Thermoguide para controlar la entrega de sonicación, incluido el enfoque electrónico a través de la modulación de fase para ajustar la profundidad focal (Figura 2).
  2. Coloque el animal anestesiado en el conjunto de trineo de bobina (Figura 1) del sistema FUS compatible con MR en la posición propensa. Inmovilizar al animal utilizando la barra incisiva y las barras de oreja incorporadas en la cuna del trineo.
  3. Aplicar gel acústico en el cuero cabelludo humedecido con agua; asegurar que no existan burbujas, colocar la barrera de membrana de la porción del circulador de agua del conjunto del transductor por encima del cráneo del animal, y bajar el conjunto del transductor en la medida de lo posible en una orientación plana paralela relativa a la placa del cráneo. Coloque el diafragma del transductor firmemente contra el cuero cabelludo afeitado del animal directamente sobre la placa del cráneo.
  4. Coloque un sensor neumático al cuerpo con cinta quirúrgica para controlar la respiración. Coloque el sensor neumático en la caja torácica inferior izquierda.
  5. Mueva el conjunto del brazo FUS con bobina, trineo y animal a la unidad de RMN 7T(Figura 1).
  6. Ejecute una secuencia T2-scout para determinar la posición física general del conjunto del transductor en relación con la cabeza del animal, y realice los ajustes mecánicos necesarios(Figura 2). Los parámetros de las imágenes T2 son: tiempo de repetición/tiempo de eco [TR/TE] a 3.000/138 milisegundos, 3 promedios, campo de visión a 29 x 45 mm2, tamaño de matriz a 125 x 192, espesor de la rebanada a 0,23 mm. La termometría normalmente no se utiliza en este protocolo.
  7. Obtenga imágenes T2 para refinar el posicionamiento del transductor. Con precisión, defina la ubicación del transductor y especifique los puntos focales de sonicación utilizando la función de orientación del software. Los parámetros de las imágenes T2 son: tiempo de repetición/tiempo de eco [TR/TE] a 3.000/138 milisegundos, 3 promedios, campo de visión a 29 x 45 mm2, tamaño de matriz a 125 x 192, espesor de la rebanada a 0,23 mm.
  8. Justo antes de la sonicación, inyectar 300 l/kg de microburbujas14 a través de la vena de la cola.
  9. Utilice un transductor de 1,5 MHz para producir sonicaciones (paquete de onda de 30 ms, ciclo de trabajo del 3%, frecuencia de repetición de ráfaga de 1 Hz, duración/sonicación de 240 s.
  10. Inmediatamente después de la sonicación, inyecte el agente de contraste de gadodiamida a través de la vena de la cola y, a continuación, realice exploraciones de contraste ponderadas por T1 más para confirmar la apertura del BBB y la precisión de la focalización. Los parámetros para la imagen ponderada por T1: TR/TE a 900/12 milisegundos, 2 promedios, campo de visión a 24 x 30 mm2, tamaño de la matriz a 208 x 256, espesor de la rebanada a 0,7 mm. Normalmente, se realiza una sola exploración T1.
  11. Retire el brazo FUS y el trineo de la RMN, y colóquelo en una almohadilla de calentamiento ajustada a 40 oC, manteniendo al mismo tiempo una anestesia de isoflurano del 2%.
  12. A partir de 30 minutos después de la sonicación, utilice una bomba de jeringa para infundir QA (75 mg/ml de solución en stock) a través de la vena de cola durante 1 h a una velocidad de 16,8 l/min para lograr una dosis final de 225 mg/kg (p.m. a 1,0 ml de solución salina).
  13. Una vez completada la perfusión, interrumpa la anestesia, manteniendo al animal en una almohadilla térmica hasta que esté alerta. Colocar al animal en una jaula y hacer controles rutinarios para su actividad cada 15 minutos, durante varias horas después del procedimiento.
  14. Devolver el animal al vivarium y comprobar cada 6 h para el primer día para la angustia o actividad irregular.
  15. Un día después de la sonicación, realizar imágenes de RMN ponderadas en T2 para evaluar cualquier daño en el área de sonicación. Los parámetros para la imagen T2: tiempo de repetición/tiempo de eco [TR/TE] a 3.000/138 milisegundos, 3 promedios, campo de visión a 29 x 45 mm2, tamaño de la matriz a 125 x 192, espesor de la rebanada a 0,23 mm. Las imágenes se evalúan en busca de áreas de hiperintensidad para identificar posibles daños/edema tisulares.

4. Análisis post mortem de la pérdida neuronal

  1. Permita un post-sonicación, período de supervivencia de 4-5 días para evaluar la pérdida neuronal con histoquímica Fluoro-Jade.
  2. Anestesar profundamente al animal con isoflurano, y eutanasiar a través de perfusión intracardial con tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7.4) seguido de 4% de paraformaldehído en tampón de fosfato.
  3. Retire el cerebro del cráneo y después de arreglar durante 2 días en 4% de paraformaldehído.
  4. Sumergir el cerebro en 30% sacarosa para crioprotección, y cortar secciones a un espesor de 20-30 m con un criostato.
  5. Monte secciones de criostato en toboganes gelatinizados y seque al aire durante la noche.
  6. Rehidratar los toboganes en agua destilada, y luego deshidratar en etanoles de grado ascendente. Después de la deshidratación, rehidratar los portaobjetos en etanoles degradados.
  7. Transfiera las diapositivas a una solución de 0,06% de permanganato de potasio durante 15 minutos en un agitador orbital.
  8. Enjuague los portaobjetos durante 1 min en agua destilada y transfiera a una solución del 0,001% de Fluoro-Jade B en un 0,1% de ácido acético. Incubar bajo agitación suave durante 30 min a temperatura ambiente. Enjuague los portaobjetos tres veces durante 1 min en agua destilada.
  9. Seque las diapositivas en un calentador de diapositivas, equilibre en xilenos durante 3 minutos y cubra con medios de montaje DPX.

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Representative Results

Esta sección describe el efecto de PING en las neuronas ubicadas en una displasia neocortical. Las displasias tisulares son una característica común en el cerebro de los pacientes con epilepsia farmacorresistente, y la extirpación quirúrgica de displasias génicas por convulsiones puede proporcionar un excelente control de las convulsiones15. Por lo tanto, definir el efecto de PING en el tejido cerebral displásico es una prioridad importante. Un modelo de rata de displasia cortical genética, la rata tish, fue seleccionado para estudiar este problema porque el cerebro tish exhibe tejido displásico (heterotopía de banda subcortical) situado debajo de un neocórtex normalmente posicionado (Figura 3)16. Tanto la displasia como el neocórtex superior contienen neuronas que son funcionales y presentan conectividad neocortical característica17,18.

PING dirigido a la heterotopía del cerebro de rata tish fue eficaz en la producción de pérdida neuronal focal de las neuronas displásicas (Figura 3). Las imágenes ponderadas en T2 tomadas un día después del PING exhiben áreas de hiperintensidad, consistentes con el daño tisular en las áreas específicas de sonicación. La tinción post mortem usando Fluoro-Jade después de un período de supervivencia post-PING de 5 días demostró neuronas degenerantes en las áreas de hiperintensidad T2, corroborando la capacidad de PING para producir pérdida neuronal en el tejido neocórprotico displásico objetivo.

Figure 1
Figura 1: Trineo compatible con resonancia magnética (MR) e imán 7T MR. Las características clave del trineo utilizado para colocar al animal en el imán MR y para entregar la sonicación se representan (A). El conjunto de trineo se muestra insertado en el imán 7T MR (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Sala de control para imágenes de resonancia magnética (RM) y ultrasonido focalizado guiado por RMN (FUS). La sala de control consta de dos estaciones principales. La estación donde está sentado el investigador es el área de planificación para apuntar a FUS (A). La segunda estación es el área de control para el sistema de RMN (B). La ventana reforzada con cobre detrás de la estación de resonancia magnética mira a la habitación que alberga el imán 7T. El monitor de la estación FUS muestra el software que controla la orientación y los parámetros de sonicación (C). Este ejemplo muestra una sonicación dirigida al estriado superpuesto en una imagen de RM ponderada en T2 (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: PING produce pérdida neuronal en el neocórtex displásico del cerebro de rata tish. Las imágenes de RM ponderadas en T2 (A,B) se obtuvieron un día después de PING. El neocórtex [N], la heterotopía [H] y los ventrículos laterales [LV] están etiquetados con fines de orientación (A). Las áreas de hiperintensidad [flechas blancas y amarillas], indicativas de daño tisular, se pueden ver en las áreas específicas de la heterotopía en ambos lados del cerebro (B). Tinción post mortem con Fluoro-Jade(C–F). Las células verdes brillantes que representan neuronas degenerantes se observan en las regiones correspondientes a las áreas de hiperintensidad en ambos lados izquierdo(C,E; flechas blancas) y derecha(D,F;flechas amarillas) del cerebro. Barras de escala: C, D a 1 mm; E,F a 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El método PING está diseñado para producir lesiones neuronales dirigidas no invasivas. El método deriva de una base sólida y creciente de investigación en el campo de la ecografía focalizada3,4,5,6,7. La capacidad de proporcionar acceso focal a áreas específicas del parénquima cerebral a través de la apertura transitoria del BBB ha creado una vía para la entrega de una amplia variedad de agentes que normalmente no obtendrían acceso al cerebro. Esta oportunidad se está adelantando en gran medida para la entrega central de agentes terapéuticos que poseen una mala permeabilidad del BBB. El método PING aprovecha la misma oportunidad de una manera diferente mediante la entrega de una neurotoxina, con el objetivo final de destruir circuitos que contribuyen a la disfunción neurológica. Los circuitos neuronales aberrantes representan un objetivo eficaz para la intervención quirúrgica para atenuar el impacto de ciertos trastornos neurológicos2,,15. El objetivo a largo plazo para el método PING es aumentar los enfoques disponibles actualmente para desconectar los circuitos que contribuyen a la disfunción neuronal.

El diseño de un estudio exhaustivo utilizando el método PING incorporaría varios grupos de control. Estos grupos incluirían: a un grupo no tratado [Sin FUS/No QA]; (b) un grupo que controle los efectos directos de FUS [FUS/No QA]; (c) un grupo que evalúe los efectos directos de la neurotoxina sistémica en ausencia de FUS [Sin FUS/QA]. Los resultados de estos grupos se compararían con el grupo ping principal [FUS/QA].

El método PING requiere habilidades básicas para el manejo de animales pequeños. Estos incluyen la inducción y mantenimiento de la anestesia, la colocación de una línea venosa de cola, la administración intravenosa de múltiples agentes en el establecimiento de una unidad de RMN, la infusión intravenosa de un medicamento, y el cuidado de animales durante los períodos operativo y postoperatorio. También requiere la capacidad de realizar perfusión intracardial, sección de tejido, tinción histoquímica y análisis microscópicos. La capacitación institucional y la aprobación de un Comité de Cuidado y Uso animal, o agencia equivalente, es necesaria para varios de los pasos del protocolo.

El protocolo inicial para el procedimiento PING utilizó la inyección intraperitoneal repetitiva de QA durante varios días8,9. Este enfoque sigue siendo viable y eficaz. Sin embargo, el protocolo actual modificó la ruta y la velocidad de administración de control de calidad. En particular, el control de calidad se administró por vía intravenosa durante un período de 1 h después de la sonicación de perfusión. Una vez más, cualquiera de los protocolos de administración es eficaz. El período de supervivencia de 4-5 días utilizado en el protocolo actual fue adoptado para optimizar el uso del método Fluoro-Jade para detectar neuronas degenerantes. Si se requieren períodos de supervivencia más largos, entonces se indicarán métodos alternativos de tinción de tejido. Uno de estos enfoques sería utilizar un anticuerpo específico de la neurona (por ejemplo, anti-NeuN), para demostrar inmunohistoquímicamente donde las neuronas sobrevivientes permanecieron después de un período de supervivencia post-sonicación más largo. También sería útil una variedad de resultados, además de los análisis estructurales actuales. Por ejemplo, las evaluaciones post-PING de los resultados electrofisiológicos y conductuales mejorarían significativamente la caracterización del impacto del método PING.

Una posible complicación de los procedimientos de FUS es que las temperaturas podrían elevarse en las proximidades del cráneo, particularmente cuando se dirige a áreas corticales situadas cerca del cráneo. Esta complicación actualmente restringe el rango de sitios (sobre de tratamiento) susceptibles a lesiones térmicas utilizando FUS de alta intensidad (HIFU). En el contexto de PING, los aumentos térmicos cerca del cráneo también pueden representar una limitación de la técnica. Sin embargo, la baja intensidad de sonicación utilizada con PING reduce el riesgo de lesión térmica, y debe ampliar la envolvente del tratamiento en comparación con HIFU.

El método PING posee varias características que consumen mucha infraestructura y requieren un uso intensivo de la formación. Se requiere un equipo FUS compatible con RMN y una instalación de RMN equipada para la investigación de animales. Esto representa una considerable inversión front-end, con el fin de proporcionar la infraestructura de investigación necesaria. Sin embargo, es alentador notar que el número de sitios equipados con tecnología FUS se está expandiendo rápidamente tanto para la investigación como para los esfuerzos clínicos. Por lo tanto, a medida que aumente el número de sitios disponibles para realizar este tipo de trabajo, aumentarán las oportunidades para la investigación in situ y/o colaborativa. En términos de formación, cualquier investigador que busque realizar estudios de FUS se beneficiaría de la formación de un grupo de investigación con experiencia en experimentación por FUS. Por ejemplo, el software de orientación MRgFUS, aunque relativamente sencillo, se adquiere más fácilmente cuando es aconsejado por un investigador experimentado.

Existen múltiples modalidades quirúrgicas alternativas para la eliminación de circuitos neuronales perturbados. Estos incluyen cirugía resectiva, ablación láser estereotáctica, radiocirugía, ultrasonido enfocado de alta intensidad y tratamiento de radiofrecuencia. Cada uno de estos enfoques es eficaz y puede ser de considerable valor terapéutico para ciertos trastornos médicamente intratables. Sin embargo, estas modalidades quirúrgicas poseen una o más limitaciones específicas: a) procedimiento invasivo, b) impacto pannecrotico en el tejido objetivo, c) daño al tejido adyacente no objetivo (por ejemplo, axones de paso) y (d) retraso en la consecución de resultados efectivos. Las ventajas significativas del método PING son que: (a) no es invasivo, b) no es pannecrotico, c) limita los efectos sobre el tejido no objetivo adyacente y (d) debe proporcionar resultados rápidos.

Hay varias direcciones futuras potenciales para el método PING, incluyendo aplicaciones preclínicas y clínicas. Con respecto a la experimentación animal, el método proporciona un medio para producir lesiones neuronales focales en modelos preclínicos de enfermedad neurológica. Por ejemplo, recientemente hemos utilizado este enfoque para probar el efecto de PING en un modelo de roedores de epilepsia límbica19. El tratamiento con PING redujo la frecuencia de las convulsiones crónicas y espontáneas en un modelo de pilocarpina de epilepsia límbica. Este estudio proporcionó la primera prueba preclínica de concepto para la utilidad de ping en el tratamiento de un trastorno neurológico.

El ácido quinolinico fue seleccionado para el procedimiento PING por dos razones principales. En primer lugar, la literatura existente11 indica que se pueden producir lesiones del cuerpo celular neuronal mientras se ahorra otro tejido no objetivo, como los axones de paso. En segundo lugar, aunque el control de calidad es un neurotóxico cuando se entrega directamente al cerebro, es bien tolerado cuando se administra sistémicamente debido a su permeabilidad limitada a través del BBB. Las otras toxinas que son bien toleradas periféricamente, como el glutamato monosódico (MSG), podrían considerarse como alternativas para el control de calidad. Una ventaja clave de MSG sería que existe una literatura sustancial con respecto al uso de este compuesto por los seres humanos. Un objetivo importante para futuras investigaciones será definir la especificidad de la lesión producida por el control de calidad u otras neurotoxinas administradas sistémicamente en términos de especificidad potencial del tipo celular. Otra aplicación preclínica potencial para este enfoque general sería administrar un compuesto tolerado periféricamente que es tóxico para otros tipos de células en el parénquima cerebral, como las células gliales. Por ejemplo, la inyección periférica de una toxina que afecta a la oligodendroglia podría permitir la desmielinización focal en un área de materia blanca. Esto permitiría la desmielinización dirigida de parte de una vía dirigida. Además, es posible que el enfoque permita evaluar la desmielinización en serie del mismo sitio, lo que constituye un sello distintivo de la esclerosis múltiple recidivante-remitente.

Con respecto a las posibles aplicaciones futuras de PING en humanos, los trastornos neurológicos en los que los circuitos neuronales perturbados son un objetivo podrían ser susceptibles de tratamiento con PING. Basado en nuestros hallazgos preclínicos iniciales19,la epilepsia resistente a los medicamentos (DRE) es un ejemplo prometedor de un trastorno que podría beneficiarse de ping. El tratamiento quirúrgico de la DRE puede ser muy beneficioso, pero sigue siendo uno de los tratamientos más infrautilizados que es realmente eficaz para un trastorno neurológico importante. Una ventaja de PING en esta configuración es que el volumen del área de destino puede ser conformal y ampliado mediante la utilización de sonicaciones seriales en varios sitios. Esto permitiría una focalización más precisa de objetivos de forma irregular y tamaño irregular en el parénquima cerebral. El proceso traslacional de PING implicaría necesariamente pruebas para la seguridad de la administración sistémica de la qa en primates no humanos y, en última instancia, en humanos. Los metabolitos de Kynurenine se limpian típicamente de la sangre a través de los riñones y se eliminan a través de la micción20,21; sin embargo, el destino del control de calidad inyectado no ha sido evaluado en este modelo. Sin embargo, es importante señalar en este contexto que los altos niveles de control de calidad administrado sistémicamente son bien tolerados en roedores. Es importante destacar que el uso de PING no impediría el tratamiento de Standard of Care. Si los tratamientos de PING individuales o múltiples resultaran ineficaces en un paciente determinado, entonces otros procedimientos, como la cirugía resectiva o ablativa, seguirían siendo opciones viables. También es importante reconocer que el entorno clínico en el que surgiría PING está idealmente preparado para la traducción y la implementación22,23,24,25,26. Las modalidades de imagen estructural y funcional se están perfeccionando rápidamente, lo que permitirá identificar mejor los objetivos adecuados para intervenciones precisas. Además, no hay necesidad de diseñar, construcción o aprobación de un nuevo dispositivo médico para PING. El FUS guiado por RMN y de alta intensidad ya es una modalidad establecida y aprobada para múltiples indicaciones, incluidas las aplicaciones neurológicas. Y, como se mencionó anteriormente, en los últimos años se han dado a la proliferación de sitios en los que fuS ya está en uso clínico. Juntos, estas ventajas sugieren un curso prometedor de desarrollo para PING para múltiples aplicaciones.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen a Rene Jack Roy por su excelente apoyo técnico en el área de la RMN. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01 NS102194 a KSL y R01 CA217953-01 a MW), el Fondo Chester (KSL) y la Fundación de Ultrasonido Focalizado (KSL y JW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7T-ClinScan MRI System Bruker Biospin, Ettinglen, Germany MR Image Acquisition
Acoustic Gel Litho CLEAR 11-601 High Viscosity Accoustic Transmission Gel
DPX Mounting Medium Electron Microscopy Sciences 13512 Resin Based Cover Glass Mountant
Fluoro-Jade B EDM Millipore AG310 High Affinity Stain For Degenerating Neurons
Fluovac anesthetic adsorber Harvard Apparatus 34-0388 Organic Anaesthesia Scavenger
FUS System Image Guided Therapy, Pessac, France LabFUS MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System
Gadodiamide GE Healthcare AS, Oslo, Norway Omniscan MR Contrast Agent
Heparin SAGENT NDC2502140010 Anti-Coagulant
Hypodermic needle 30G x 1/2 Becton-Dickinson 26027 Tail Vein Catheterization
Insulin syringe 28G1/2 (1ml) EXEL 26027 Administration of Injectables to Tail Vein Catheter
Isofluorane atomizer SurgiVet VCT302 Anaesthesia Administration
Isoflurane Henry Schein NDC1169567762 Anaesthesia
KMnO4 Sigma 223468 Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining
Microbubbles Produced internally: A. Klibanov 305106 Blood Brain Barrier Disrupting Agent
Microbubbles (commercial source) Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA Definity microbubbles Blood Brain Barrier Disrupting Agent
Monitoring & Gating System Small Animal Instruments Model 1030 Respiration Monitoring
Multisizer 3 Coulter counter Beckman-Coulter, Hialeah, FL Multisizer 3 Used to Determine Average Size of Microbubbles
Optixcare EYE LUBE CLC MEDICA, Ontario, Canada 11611 Corneal Protectant-Eye Lube
PE10 tubing Becton-Dickinson 427401 Tail Vein Catheter Component
Quinolinic Acid Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX CAS 89-00-9 Neurotoxin
Sprague-Dawley Rats Taconic Biosciences SD-M Rat Model
Syringe Pump Carnegie Medicin CMA 100 Controlled Delivery of Quinolinic Acid
Thermoguide Software Image Guided Therapy, Pessac, France Thermoguide Drives Lab FUS System
Tish Rats In-house colony Rat Model
Veet depilatory cream Reckitt Benckiser Removal of Scalp Hair

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurociencia Número 163 Ultrasonido focalizado no invasivo neurocirugía lesión neuronal RMN cerebro
Lesión neuronal dirigida para la desconexión no invasiva del circuito cerebral
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Wang, W., Zhang, Y., Anzivino, M. J., Bertram, E. H., Woznak, J., Klibanov, A., Dumont, E., Wintermark, M., Lee, K. S. Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry. J. Vis. Exp. (163), e61271, doi:10.3791/61271 (2020).

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