Summary
L'obiettivo del protocollo è quello di fornire un metodo per produrre lesioni neuronali non invasive nel cervello. Il metodo utilizza l'ecografia focalizzata a risonanza magnetica (MRgFUS) per aprire la barriera del cervello del sangue in modo transitorio e focale, al fine di fornire una neurotossina circolante al parenchyma cerebrale.
Abstract
L'intervento chirurgico può essere molto efficace per il trattamento di alcuni tipi di malattie neurologiche medicalmente intrattabili. Questo approccio è particolarmente utile per i disturbi in cui i circuiti neuronali identificabili svolgono un ruolo chiave, come l'epilessia e i disturbi del movimento. Attualmente disponibili modalità chirurgiche, mentre efficace, generalmente comportano una procedura chirurgica invasiva, che può provocare lesioni chirurgiche ai tessuti non bersaglio. Di conseguenza, sarebbe utile ampliare la gamma di approcci chirurgici per includere una tecnica non invasiva e neurotossica.
Qui, viene presentato un metodo per la produzione focale, lesioni neuronali nel cervello in modo non invasivo. Questo approccio utilizza ultrasuoni focalizzati a bassa intensità insieme a microbolle endovenose per aprire transitoriamente e focalmente la barriera del cervello del sangue (BBB). Il periodo di apertura transitoria di BBB viene quindi sfruttato per fornire in modo focale una neurotossina somministrata sistemicamente in un'area cerebrale mirata. L'acido quinolinico neurotossina (QA) è normalmente impermeabile alla BBB ed è ben tollerato quando somministrato per via endovenosa o per via endovenosa. Tuttavia, Quando QA ottiene l'accesso diretto al tessuto cerebrale, è tossico per i neuroni. Questo metodo è stato utilizzato in ratti e topi per indirizzare specifiche regioni del cervello. Immediatamente dopo MRgFUS, l'apertura del BBB viene confermata utilizzando l'imaging ponderato T1 migliorato a contrasto. Dopo la procedura, L'imaging T2 mostra lesioni limitate all'area mirata del cervello e la perdita di neuroni nell'area mirata può essere confermata dopo la morte utilizzando tecniche sittologiche. In particolare, gli animali iniettati con salina piuttosto che QA dimostrano l'apertura del BBB, ma il punto non presenta lesioni o perdita neuronale. Questo metodo, chiamato preciso intracerebrale Chirurgia guidata non invasiva (PING) potrebbe fornire un approccio non invasivo per il trattamento di disturbi neurologici associati a disturbi nei circuiti neurali.
Introduction
Lo scopo di questo metodo è quello di fornire un mezzo per produrre lesioni neuronali non invasive in una regione mirata del cervello. La logica per sviluppare un tale approccio è quello di scollegare i circuiti neuronali contribuendo a disturbi neurologici. Per esempio, la chirurgia può essere molto efficace nel trattamento di alcuni disturbi neurologici medicalmente intrattabili, come l'epilessia farmacor resistente ai farmaci (DRE)1. Tuttavia, ognuna delle modalità chirurgiche disponibili possiedono limitazioni in termini di produzione di danni collaterali indesiderati al cervello. La chirurgia resectiva tradizionale può essere altamente invasiva con il rischio di sanguinamento, infezione, coaguli di sangue, ictus, convulsioni, gonfiore del cervello e danni ai nervi2. Le alternative alla chirurgia resectiva minimamente invasiva o non invasiva includono la terapia termica interstiziale laser e la radiochirurgia, che si sono dimostrate efficaci anche nella soppressione delle crisi epilettiche nel DRE. Più recentemente, le lesioni termiche prodotte da ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HIFU) hanno dimostrato di essere promettenti nel ridurre le convulsioni. HIFU non è invasivo; tuttavia, la sua finestra di trattamento è attualmente limitata alle aree più centrali del cervello a causa del rischio di lesioni termiche al tessuto non bersaglio situato nelle vicinanze del cranio. Nonostante tali limitazioni, i benefici della chirurgia spesso superano i potenziali rischi. Per esempio, anche se la chirurgia per DRE può produrre danni cerebrali collaterali, i suoi effetti benefici nella soppressione delle crisi epilettiche e migliorare la qualità della vita in genere prevalgono sui rischi chirurgici.
Il metodo descritto nel suo seguito, Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING), è stato sviluppato allo scopo di scollegare i circuiti neurali, limitando al contempo i danni collaterali al cervello. Il metodo utilizza ultrasuoni focalizzati a bassa intensità combinati con iniezione endovenosa di microbolle per aprire il BBB, al fine di fornire una neurotossina. Questo approccio non produce lesioni termiche al cervello3,4,5,6,7e il periodo di apertura BBB può essere sfruttato per fornire composti BBB-impermeable al parenchyma cervello. L'apertura del BBB è transitoria e può essere prodotta in modo mirato utilizzando la guida per la risonanza magnetica. Nei nostri studi, il periodo di apertura BBB è stato utilizzato per fornire una neurotossina circolante ad una zona mirata del parenchyma cerebrale in ratti e topi8,9. L'acido quinolinico è una neurotossina che è ben tollerata quando somministrata per viaendovenosa 10, intraarterially10, o intraperitoneally8,9,11. La mancanza di tossicità del QA è dovuta alla sua scarsa permeabilità BBB, che è stata segnalata come trascurabile10. Al contrario, l'iniezione diretta di QA nel parenchyma cerebrale produce lesioni neuronali che risparmiano gli assonivicini 12,13. Così, quando il QA circola ottiene l'accesso al parenchyma cerebrale nell'area mirata di apertura BBB, la morte neuronale èprodotta 8,9. L'attuale metodo produce quindi una perdita neuronale focale in modo mirato e non invasivo.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Virginia.
1. Preparazione dei reagenti
- Il giorno dell'intervento, preparare 6,0 mL di acido quinolinico iniettabile (QA). Sciogliere 450 mg di QA in 4,0 mL di 1,0 N NaOH. Aggiungere 0,6 mL di 10x PBS, pH a 7,4 e portare a un volume finale di 6,0 mL con dH2O. Filtrare attraverso il filtro di siringa da 0,22 m. La soluzione è stabile per 2 settimane a 4 gradi centigradi.
- Preparare una dispersione aquea di microbolle in normale salina mediante sonicazione sonda dal gas decafluorobutano e stabilizzarsi con guscio monostrato12Stabilizzazione DSPC/PEG.
- Dimensioni microbolle per galleggiamento a gravità normale. Determinare la concentrazione e le dimensioni della microbolle mediante il rilevamento dell'elettrozona utilizzando il contatore Multisizer III. La concentrazione di microbolle e la distribuzione delle dimensioni devono essere rispettivamente 6 x10 8/mL e 2 m (diametro medio delle particelle). Le bolle più grandi vengono rimosse dall'esclusione/separazione di galleggiamento.
- In alternativa, acquistare microbolle disponibili in vendita.
2. Preparazione degli animali
- Acclimatare l'animale (ratto o topo) per 3 giorni dopo il parto. Gli esperimenti qui descritti hanno usato ratti Sprague-Dawley (5-6 settimane di età) o ratti eterotopia strutturale (tish) interni telencephalici (colonia locale).
- Ospitare gli animali sotto una luce di 12 ore: ciclo buio di 12 ore.
- Registrare i pesi degli animali. Queste informazioni sono importanti durante tutta la procedura.
- Ottenere immagini MR ponderate T2 il giorno prima della procedura FUS al fine di stabilire immagini di base preoperative. Utilizzare i seguenti parametri per l'imaging T2: tempo di ripetizione/tempo eco [TR/TE] 3.000/138 millisecondi, 3 medie, campo di visualizzazione- 29 x 45 mm2, dimensione della matrice : 125 x 192, spessore della sezione : 0,23 mm.
- Anestesizzare l'animale con isoflurane (4% di induzione, 2% di manutenzione). Confermare un'adeguata profondità di anestesia utilizzando un pizzico di dita dei piedi. Applicare un unguento oftalmico agli occhi.
- Radere il cuoio capelluto dell'animale e rimuovere i capelli rimanenti con crema depilatoria.
- Utilizzare un catetere della vena della coda per l'infusione di microbolle, agente di contrasto e QA. I cateteri sono costituiti da una lunghezza di tubi PE10 dotati di un ago da 30 G x 1/2 pollici. Lasciare una siringa da 1 mL con salina epalinata in linea, da rimuovere e riattaccare quando la linea viene utilizzata per le infusioni.
3. Procedure di risonanza magnetica e PING
- Eseguire la risonanza magnetica su un'unità 7 T MR con una forza di gradiente di 600 mT/m/ms (Figura 1 e Figura 2). Eseguire acquisizioni di RMI utilizzando una bobina di superficie incorporata nel sistema FUS.
NOTA: il sistema FUS utilizzato per gli esperimenti comprende tre parti: (i) il sistema di sonicazione è un array anulare a 8 elementi compatibile con MR, trasduttore 1,5 MHz (raggio sferico - 20 mm , diametro attivo - 25 mm (numero f - 0,8), con 80% di efficienza elettro-acustica, che è collegato a un generatore di array a fasi e ad un amplificatore di potenza RF; ii) una fase di posizionamento motorizzato compatibile con MR per spostare il trasduttore nella direzione anteriore-posteriore e nella direzione medio-laterale; (iii) una workstation Thermoguide per controllare la fornitura di sonicazione, compresa la messa a fuoco elettronica attraverso la modulazione di fase per regolare la profondità focale (Figura 2). - Posizionare l'animale anetinato sull'assieme della slitta a bobina (Figura 1) del sistema FUS compatibile con MR nella posizione prona. Immobilizzare l'animale utilizzando la barra incisiva e le barre dell'orecchio incorporate nella culla della slitta.
- Applicare gel acustico sul cuoio capelluto bagnato dall'acqua; assicurandosi che non esistano bolle, posizionare la barriera membrana della porzione del circolatore d'acqua dell'assieme del trasduttore sopra il cranio dell'animale e abbassare il gruppo del trasduttore per quanto possibile in un orientamento planare parallelo rispetto alla piastra del cranio. Posizionare saldamente il diaframma del trasduttore contro il cuoio capelluto rasato dell'animale direttamente sopra la piastra del cranio.
- Collegare un sensore pneumatico al corpo con nastro adesivo chirurgico, per monitorare la respirazione. Posizionare il sensore pneumatico sulla gabbia toracica inferiore sinistra.
- Spostare l'assieme del braccio FUS con bobina, slitta e animale nell'unità 7T MRI(Figura 1).
- Eseguire una sequenza T2-scout per determinare la posizione fisica generale dell'assieme del trasduttore rispetto alla testa dell'animale ed effettuare le regolazioni meccaniche necessarie (Figura 2). I parametri per l'imaging T2 sono: tempo di ripetizione/tempo eco [TR/TE] - 3.000/138 millisecondi, 3 medie, campo di visualizzazione : 29 x 45 mm2, dimensione della matrice : 125 x 192, spessore della sezione : 0,23 mm. La termometria in genere non viene utilizzata in questo protocollo.
- Ottenere immagini T2 per perfezionare il posizionamento del trasduttore. Definire con precisione la posizione del trasduttore e specificare i punti focali della sonicazione utilizzando la funzione di targeting del software. I parametri per l'imaging T2 sono: tempo di ripetizione/tempo eco [TR/TE] - 3.000/138 millisecondi, 3 medie, campo di visualizzazione : 29 x 45 mm2, dimensione della matrice : 125 x 192, spessore della sezione : 0,23 mm.
- Appena prima della sonicazione, iniettare 300 L/kg di microbolle14 attraverso la vena della coda.
- Utilizzare un trasduttore da 1,5 MHz per produrre sonicazioni (pacchetto onda 30 ms, ciclo di servizio del 3%, frequenza di ripetizione burst da 1 Hz, durata/sonicazione di 240 s.
- Immediatamente dopo la sonicazione, iniettare l'agente di contrasto gadodiamide tramite la vena della coda, quindi eseguire scansioni t1-weighted più contrasto per confermare l'apertura del BBB e la precisione del targeting. I parametri per l'imaging ponderato T1: TR/TE - 900/12 millisecondi, 2 medie, campo di visualizzazione : 24 x 30 mm2, dimensione della matrice : 208 x 256, spessore della sezione - 0,7 mm. In genere, viene eseguita una singola scansione T1.
- Togliere il braccio FUS e la slitta dalla risonanza magnetica, e posizionare l'animale su un pad di riscaldamento impostato a 40 gradi centigradi, pur mantenendo il 2% di anestesia isoflurana.
- A partire da 30 min dopo la sonicazione, utilizzare una pompa di siringa per infondere QA (soluzione di stock 75 mg/mL) tramite la vena della coda per 1 h ad un tasso di 16,8 L/min per ottenere un dosaggio finale di 225 mg/kg (q.s. a 1,0 mL saline).
- Quando l'infusione è completa, interrompere l'anestesia, mantenendo l'animale su un tampone di riscaldamento fino all'allarme. Mettere l'animale in una gabbia e fare controlli di routine per la sua attività ogni 15 minuti, per diverse ore dopo la procedura.
- Riportare l'animale al vivaio e controllare ogni 6 h per il primo giorno per l'angoscia o l'attività irregolare.
- Un giorno dopo la sro sonora, esegui l'imaging MR ponderato T2 per valutare eventuali danni nell'area della sonicazione. I parametri per l'imaging T2: tempo di ripetizione/tempo eco [TR/TE] - 3.000/138 millisecondi, 3 medie, campo di visualizzazione : 29 x 45 mm2, dimensione della matrice : 125 x 192, spessore della sezione : 0,23 mm. Le immagini vengono valutate per le aree di iperintensità per identificare possibili danni/edema tissunti.
4. Analisi post-mortem della perdita neuronale
- Consentire un periodo di sopravvivenza post-sonicazione di 4-5 giorni per valutare la perdita neuronale con istochimica Fluoro-Jade.
- Anestetizzare profondamente l'animale con isoflurane ed eutanasia tramite perfusione intracarcardica con tampone di fosfato di 0,1 M (pH 7,4) seguito dal 4% di paraformaldeide nel tampone di fosfato.
- Rimuovere il cervello dal cranio e post-fissa per 2 giorni in 4% paraformaldeide.
- Immergere il cervello in saccarosio 30% per la crioprotezione, e tagliare le sezioni ad uno spessore di 20-30 m con un criostato.
- Montare sezioni criostati su scivoli gelatinizzati e asciugare l'aria durante la notte.
- Reidratare gli scivoli in acqua distillata, e poi disidratare in etanolo di grado ascendente. Dopo la disidratazione, reidratare i vetrini in etanoli di grado decrescente.
- Trasferire i vetrini in una soluzione di 0,06% di permanganato di potassio per 15 min su uno shaker orbitale.
- Sciacquare gli scivoli per 1 min in acqua distillata e trasferire in una soluzione dello 0,001% di Fluoro-Jade B in acido acetico dello 0,1%. Incubare in leggera agitazione per 30 min a temperatura ambiente. Sciacquare tre diapositive per 1 min in acqua distillata.
- Asciugare i vetrini su un riscaldatore di scorrimento, equilibrare in xylenes per 3 min, e coverslip utilizzando supporti di montaggio DPX.
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Representative Results
Questa sezione descrive l'effetto del PING sui neuroni situati in una displasia neocorticale. Le displasia dei tessuti sono una caratteristica comune nel cervello dei pazienti con epilessia farmacoresa, e la rimozione chirurgica di displasia convulsioni-geniche può fornire un eccellente controllo delle crisiepilettiche 15. Definire l'effetto del PING sul tessuto cerebrale displastico è quindi una priorità importante. Un modello di displasia corticale genetica, il ratto tish, è stato selezionato per studiare questo problema perché il cervello tish presenta tessuto displastico (eterotopia banda subcorticale) situato sotto una neocorteccia normalmente posizionata (Figura 3)16. Sia la displasia che la neocorteccia sovrastolana contengono neuroni funzionali e presentano caratteristica connettività neocorticale17,18.
PING mirando l'eterotopia del cervello di ratto tish è stato efficace nel produrre la perdita neuronale focale dei neuroni displastici (Figura 3). Le immagini ponderate T2 scattate un giorno dopo IL PING presentano aree di iperintensità, coerenti con i danni ai tessuti nelle aree mirate della sonicazione. La colorazione post-mortem con Fluoro-Jade dopo un periodo di sopravvivenza post-PING di 5 giorni ha dimostrato la degenerazione dei neuroni nelle aree dell'iperintensità T2, corroborando la capacità del PING di produrre perdita neuronale nel tessuto neocorticale di displastico mirato.
Figura 1: slitta compatibile con risonanza magnetica (MR) e magnete 7T MR. Le caratteristiche principali della slitta utilizzata per posizionare l'animale nel magnete MR e per fornire sonicazione sono raffigurate (A). L'assieme slitta viene visualizzato inserito nel magnete 7T MR (B). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sala di controllo per l'imaging a risonanza magnetica (MR) e l'ecografia mirata guidata da MR (FUS). La sala di controllo comprende due stazioni primarie. La stazione in cui si trova l'investigatore è l'area di pianificazione per il targeting FUS (A). La seconda stazione è l'area di controllo per il sistema di risonanza magnetica (B). La finestra rinforzata in rame dietro la stazione di risonanza magnetica guarda nella stanza che ospita il magnete 7T. Il monitor della stazione FUS visualizza il software che controlla le linee guida e i parametri della sonicazione (C). In questo esempio viene illustrata una srotona destinata allo striato sovrapposto a un'immagine MR ponderata T2 (D). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: PING produce perdita neuronale nella neocorteccia displastica del cervello del ratto tish. Le immagini MR ponderate T2 (A,B) sono state ottenute un giorno dopo PING. La neocorteccia [N], l'eterotopia [H] e i ventricoli laterali [LV] sono etichettati ai fini dell'orientamento (A). Aree di iperintensità [frecce bianche e gialle], indicative di danni ai tessuti, possono essere viste nelle aree mirate dell'eterotopia su entrambi i lati del cervello (B). Colorazione post-mortem con Fluoro-Jade(C-F). Le cellule verde brillante che rappresentano i neuroni degeneranti sono osservate nelle regioni corrispondenti alle aree di iperintensità sia sui lati sinistro (C,E; frecce bianche) che a destra(D,F; frecce gialle) del cervello. Barre di scala: C,D - 1 mm; E,F - 0,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo PING è progettato per produrre lesioni neuronali non invasive e mirate. Il metodo deriva da una solida e crescente base di ricerca nel campo degli ultrasuonimirati 3,4,5,6,7. La capacità di fornire un accesso focale a specifiche aree del parenchyma cerebrale tramite l'apertura transitoria del BBB ha creato una via per fornire una vasta gamma di agenti che normalmente non avrebbero accesso al cervello. Questa opportunità è in gran parte avanzata per la consegna centrale di agenti terapeutici che possiedono scarsa permeabilità BBB. Il metodo PING sfrutta la stessa opportunità in modo diverso fornendo una neurotossina, con l'obiettivo finale di distruggere circuiti che contribuiscono alla disfunzione neurologica. I circuiti neurali aberranti rappresentano un obiettivo efficace per l'intervento chirurgico per attenuare l'impatto di alcuni disturbineurologici 2,15. L'obiettivo a lungo termine per il metodo PING è quello di aumentare gli approcci attualmente disponibili per scollegare circuiti che contribuiscono alla disfunzione neurale.
La progettazione di uno studio completo che utilizza il metodo PING incorporerebbe più gruppi di controllo. Questi gruppi includerebbero: (a) un gruppo non trattato [No FUS/No QA]; b) un gruppo che controlla gli effetti diretti del FUS [FUS/No QA]; c) un gruppo che valuta gli effetti diretti della neurotossina sistemica in assenza di FUS [Nessun FUS/QA]. I risultati di questi gruppi verrebbero confrontati con il gruppo primario PING [FUS/QA].
Il metodo PING richiede competenze di base per la movimentazione di piccoli animali. Questi includono l'induzione e il mantenimento dell'anestesia, il posizionamento di una linea della vena della coda, la somministrazione endovenosa di più agenti nell'impostazione di un'unità di risonanza magnetica, l'infusione endovenosa di un farmaco e la cura degli animali durante i periodi operativi e postoperativi. Richiede anche la capacità di eseguire perfusioni intracarcardali, sezionamento dei tessuti, colorazione istochimica e analisi microscopiche. La formazione istituzionale e l'approvazione da parte di un comitato per la cura e l'uso degli animali, o di un'agenzia equivalente, sono necessarie per diverse delle fasi del protocollo.
Il protocollo iniziale per la procedura PING utilizzato iniezione intraperitoneale ripetitivo di QA per più giorni8,9. Questo approccio è ancora praticabile ed efficace. Tuttavia, il protocollo corrente ha modificato la route e la frequenza di amministrazione del QA. In particolare, il QA è stato somministrato per via endovenosa durante un periodo di infusione post-sonicazione di 1 h. Anche in questo caso, entrambi i protocolli di amministrazione sono efficaci. Il periodo di sopravvivenza di 4-5 giorni utilizzato nell'attuale protocollo è stato adottato per ottimizzare l'uso del metodo Fluoro-Jade per rilevare i neuroni degeneranti. Se sono necessari periodi di sopravvivenza più lunghi, sarebbero indicati metodi alternativi di colorazione dei tessuti. Uno di questi approcci sarebbe quello di utilizzare un anticorpo specifico del neurone (ad esempio, anti-NeuN), per dimostrare immunohistochimicamente dove i neuroni sopravvissuti sono rimasti dopo un periodo di sopravvivenza post-sonicazione più lungo. Una serie di risultati, oltre alle attuali analisi strutturali, sarebbe utile. Ad esempio, le valutazioni post-PING degli esiti elettrofisiologici e comportamentali farebbero progredire significativamente la caratterizzazione dell'impatto del metodo PING.
Una potenziale complicazione delle procedure FUS è che le temperature potrebbero essere elevate in prossimità del cranio, in particolare quando si prendono di mira le aree corticali situate vicino al cranio. Questa complicazione attualmente limita la gamma di siti (involucro di trattamento) su misura per la lesioni termiche utilizzando FUS ad alta intensità (HIFU). Nel contesto del PING, gli aumenti termici vicino al cranio possono anche rappresentare una limitazione della tecnica. Tuttavia, la bassa intensità di sonicazione utilizzata con PING riduce il rischio di lesioni termiche e dovrebbe espandere l'involucro di trattamento rispetto all'HIFU.
Il metodo PING possiede diverse funzionalità che richiedono un uso intensivo dell'infrastruttura e un'intensa formazione. Sono necessarie apparecchiature FUS compatibili con la risonanza magnetica e un impianto di risonanza magnetica attrezzato per la ricerca sugli animali. Si tratta di un notevole investimento front-end, al fine di fornire l'infrastruttura di ricerca necessaria. Tuttavia, è incoraggiante notare che il numero di siti dotati di tecnologia FUS è in rapida espansione sia per la ricerca che per gli sforzi clinici. Pertanto, con l'aumentare del numero di siti disponibili per l'esecuzione di tale lavoro, le opportunità di indagine in loco e/o collaborativa cresceranno. In termini di formazione, qualsiasi ricercatore che cerchi di intraprendere studi FUS trarrebbe beneficio dalla formazione di un gruppo di ricerca esperto nella sperimentazione FUS. Per esempio, il software di targeting MRgFUS, anche se relativamente semplice, è più facilmente acquisito quando consigliato da un investigatore esperto.
Esistono molteplici modalità chirurgiche alternative per la rimozione dei circuiti neuronali disturbati. Questi includono chirurgia risectiva, ablazione laser stereotassica, radiochirurgia, ultrasuoni focalizzati ad alta intensità, e il trattamento a radiofrequenza. Ognuno di questi approcci è efficace e può essere di notevole valore terapeutico per alcuni disturbi medicalmente intrattabili. Tuttavia, queste modalità chirurgiche possiedono una o più limitazioni specifiche: (a) procedura invasiva, (b) impatto pannecrotico sul tessuto bersaglio, (c) danno al tessuto adiacente non bersaglio (ad esempio, assoni di passaggio) e (d) ritardo nel raggiungimento di esiti efficaci. Vantaggi significativi del metodo PING sono che: (a) non è invasivo, (b) non è pannecrotico, (c) limita gli effetti sul tessuto adiacente non bersaglio e (d) dovrebbe fornire risultati rapidi.
Ci sono diverse direzioni future potenziali per il metodo PING, comprese le applicazioni preclinici e cliniche. Per quanto riguarda la sperimentazione animale, il metodo fornisce un mezzo per produrre lesioni neuronali focali in modelli preclinici di malattia neurologica. Per esempio, abbiamo recentemente utilizzato questo approccio per testare l'effetto di PING in un modello di roditore di epilessia limbica19. Il trattamento con PING ha ridotto la frequenza delle crisi croniche e spontanee in un modello di pilocarpina dell'epilessia limbica. Questo studio ha fornito la prima prova preclinica di concetto per l'utilità del PING nel trattamento di un disturbo neurologico.
L'acido quinolinico è stato selezionato per la procedura PING per due motivi principali. In primo luogo,la letteratura esistente 11 indica che le lesioni del corpo delle cellule neuronali possono essere prodotte risparmiando altri tessuti non bersaglio, come gli assoni di passaggio. In secondo luogo, anche se il QA è un neurotossico quando consegnato direttamente al cervello, è ben tollerato quando somministrato sistemicamente a causa della sua permeabilità limitata attraverso il BBB. Le altre tossine che sono ben tollerate dal mercato periferico, come il glutammato monosodato (MSG), potrebbero essere considerate come alternative per il QA. Un vantaggio chiave di MSG sarebbe che esiste una letteratura sostanziale per quanto riguarda l'uso di questo composto da parte degli esseri umani. Un obiettivo importante per la ricerca futura sarà quello di definire la specificità della lesione prodotta dal QA o da altre neurotossine somministrate sistemicamente in termini di potenziale specificità del tipo di cellula. Un'altra potenziale applicazione preclinica per questo approccio generale sarebbe quella di amministrare un composto perifericamente tollerato che è tossico per altri tipi di cellule nel parenchyma cerebrale, come le cellule gliali. Per esempio, l'iniezione periferica di una tossina che colpisce l'oligodendroglia potrebbe consentire la demistelinazione focale in un'area di materia bianca. Ciò consentirebbe una demistezzante mirata di parte di un percorso mirato. Inoltre, l'approccio potrebbe consentire in teoria valutazioni della demistelinazione seriale dello stesso sito, che è un segno distintivo della sclerosi multipla recidivante.
Per quanto riguarda le possibili applicazioni future di PING negli esseri umani, i disturbi neurologici in cui i circuiti neurali disturbati sono un obiettivo potrebbero essere susbili al trattamento con PING. Sulla base dei nostri primi risultati preclinici19, l'epilessia resistente ai farmaci (DRE) è un esempio promettente di un disturbo che potrebbe trarre beneficio da PING. Il trattamento chirurgico di DRE può essere altamente utile, ma rimane uno dei trattamenti più sottoutilizzati che è effettivamente efficace per un disturbo neurologico importante. Un vantaggio di PING in questa impostazione è che il volume dell'area di destinazione può essere conforme e ingrandito utilizzando sonicazioni seriali in più siti. Ciò consentirebbe un targeting più preciso di bersagli di forma irregolare e di dimensioni irregolari nel parenchyma cerebrale. Il processo trasslazione per PING comporterebbe necessariamente test per la sicurezza dell'amministrazione sistemica del QA nei primati non umani e, in ultima analisi, negli esseri umani. I metaboliti della Kynurenine sono in genere eliminati dal sangue attraverso i reni ed eliminati tramite minzione20,21; tuttavia, il destino del QA iniettato non è stato valutato in questo modello. Tuttavia, è importante notare in questo contesto che alti livelli di QA amministrato sistemicamente sono ben tollerati nei roditori. È importante sottolineare che l'uso di PING non precluderebbe il trattamento Standard of Care. Se i trattamenti PING singoli o multipli si dimostrassero inefficaci in un dato paziente, altre procedure, come la chirurgia resectiva o ablativa, resteranno opzioni praticabili. È inoltre importante riconoscere che l'ambiente clinico in cui emergerebbe PING è idealmente pronto per la traduzione el'implementazione 22,23,24,25,26. Le modalità di imaging strutturale e funzionale stanno rapidamente diventando più raffinate, il che consentirà una migliore identificazione di obiettivi appropriati per interventi precisi. Inoltre, non è necessario la progettazione, la costruzione o l'approvazione di un nuovo dispositivo medico per PING. MR-guided, ad alta intensità FUS è già una modalità consolidata e approvata per molteplici indicazioni, comprese le applicazioni neurologiche. E, come accennato in precedenza, negli ultimi anni hanno assistito a una proliferazione di siti in cui FUS è già in uso clinico. Insieme, questi vantaggi suggeriscono un promettente corso di sviluppo per PING per più applicazioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono Rene Jack Roy per il suo eccellente supporto tecnico nel settore della risonanza magnetica. Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (R01 NS102194 a KSL e R01 CA217953-01 a MW), dal Chester Fund (KSL) e dalla Focused Ultrasound Foundation (KSL e JW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T-ClinScan MRI System | Bruker Biospin, Ettinglen, Germany | MR Image Acquisition | |
| Acoustic Gel | Litho CLEAR | 11-601 | High Viscosity Accoustic Transmission Gel |
| DPX Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 13512 | Resin Based Cover Glass Mountant |
| Fluoro-Jade B | EDM Millipore | AG310 | High Affinity Stain For Degenerating Neurons |
| Fluovac anesthetic adsorber | Harvard Apparatus | 34-0388 | Organic Anaesthesia Scavenger |
| FUS System | Image Guided Therapy, Pessac, France | LabFUS | MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System |
| Gadodiamide | GE Healthcare AS, Oslo, Norway | Omniscan | MR Contrast Agent |
| Heparin | SAGENT | NDC2502140010 | Anti-Coagulant |
| Hypodermic needle 30G x 1/2 | Becton-Dickinson | 26027 | Tail Vein Catheterization |
| Insulin syringe 28G1/2 (1ml) | EXEL | 26027 | Administration of Injectables to Tail Vein Catheter |
| Isofluorane atomizer | SurgiVet | VCT302 | Anaesthesia Administration |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC1169567762 | Anaesthesia |
| KMnO4 | Sigma | 223468 | Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining |
| Microbubbles | Produced internally: A. Klibanov | 305106 | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Microbubbles (commercial source) | Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA | Definity microbubbles | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments | Model 1030 | Respiration Monitoring |
| Multisizer 3 Coulter counter | Beckman-Coulter, Hialeah, FL | Multisizer 3 | Used to Determine Average Size of Microbubbles |
| Optixcare EYE LUBE | CLC MEDICA, Ontario, Canada | 11611 | Corneal Protectant-Eye Lube |
| PE10 tubing | Becton-Dickinson | 427401 | Tail Vein Catheter Component |
| Quinolinic Acid | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | CAS 89-00-9 | Neurotoxin |
| Sprague-Dawley Rats | Taconic Biosciences | SD-M | Rat Model |
| Syringe Pump | Carnegie Medicin | CMA 100 | Controlled Delivery of Quinolinic Acid |
| Thermoguide Software | Image Guided Therapy, Pessac, France | Thermoguide | Drives Lab FUS System |
| Tish Rats | In-house colony | Rat Model | |
| Veet depilatory cream | Reckitt Benckiser | Removal of Scalp Hair |
References
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