Summary
O objetivo do protocolo é fornecer um método para produzir lesões neuronais não invasivas no cérebro. O método utiliza o Ultrassom Focalizado guiado por Ressonância Magnética (MRgFUS) para abrir a Barreira Cerebral sanguínea de forma transitória e focal, a fim de fornecer uma neurotoxina circulante para o parenchyma cerebral.
Abstract
A intervenção cirúrgica pode ser bastante eficaz para o tratamento de certos tipos de doenças neurológicas medicamente intratáveis. Essa abordagem é particularmente útil para distúrbios nos quais circuitos neuronais identificáveis desempenham um papel fundamental, como epilepsia e distúrbios de movimento. Atualmente, as modalidades cirúrgicas disponíveis, embora eficazes, geralmente envolvem um procedimento cirúrgico invasivo, que pode resultar em lesão cirúrgica em tecidos não-alvo. Consequentemente, seria de valor expandir a gama de abordagens cirúrgicas para incluir uma técnica que não seja invasiva e neurotóxica.
Aqui, é apresentado um método para produzir lesões focais e neuronais no cérebro de forma não invasiva. Esta abordagem utiliza ultrassom focado em baixa intensidade, juntamente com microbolhas intravenosas para abrir transitoriamente e focalmente a Barreira Cerebral de Sangue (BBB). O período de abertura do BBB transitório é então explorado para fornecer focalmente uma neurotoxina administrada sistematicamente em uma área cerebral direcionada. O ácido neurotoxina quinolínico (QA) é normalmente impermeável ao BBB, e é bem tolerado quando administrado intraperitoneal ou intravenosamente. No entanto, quando a QA ganha acesso direto ao tecido cerebral, é tóxica para os neurônios. Este método tem sido usado em ratos e camundongos para atingir regiões cerebrais específicas. Imediatamente após o MRgFUS, a abertura bem sucedida do BBB é confirmada usando imagens ponderadas t1 aprimoradas em contraste. Após o procedimento, a imagem T2 mostra lesão restrita à área alvo do cérebro e a perda de neurônios na área alvo pode ser confirmada após a morte utilizando técnicas histológicas. Notavelmente, os animais injetados com soro fisiológico em vez de QA demonstram abertura do BBB, mas não apresentam lesão ou perda neuronal. Este método, denominado Cirurgia Guiada Não Invasiva Não Invasiva Precisa (PING) poderia fornecer uma abordagem não invasiva para o tratamento de distúrbios neurológicos associados a distúrbios em circuitos neurais.
Introduction
O objetivo deste método é fornecer um meio para produzir lesões neuronais não invasivas em uma região alvo do cérebro. A lógica para desenvolver tal abordagem é desconectar circuitos neuronais que contribuem para distúrbios neurológicos. Por exemplo, a cirurgia pode ser bastante eficaz no tratamento de certos distúrbios neurológicos medicamente intratáveis, como epilepsia resistente a medicamentos (DRE)1. No entanto, cada uma das modalidades cirúrgicas disponíveis possuem limitações em termos de produzir danos colaterais indesejáveis ao cérebro. A cirurgia resetiva tradicional pode ser altamente invasiva com o risco de sangramento, infecção, coágulos sanguíneos, derrame, convulsões, inchaço do cérebro e danos nos nervos2. Alternativas à cirurgia resegtiva que são minimamente invasivas ou não invasivas incluem terapia térmica intersticiacional a laser e radiocirurgia, que também se mostraram eficazes na supressão de convulsões em DRE. Mais recentemente, lesões térmicas produzidas por ultrassom focado em alta intensidade (HIFU) têm se mostrado promissoras na redução das convulsões. HIFU não é invasivo; no entanto, sua janela de tratamento está atualmente limitada a áreas mais centrais do cérebro devido ao risco de lesão térmica ao tecido não-alvo localizado nas proximidades do crânio. Apesar dessas limitações, os benefícios da cirurgia muitas vezes superam os riscos potenciais. Por exemplo, embora a cirurgia para DRE possa produzir danos cerebrais colaterais, seus efeitos benéficos na supressão de convulsões e na melhoria da qualidade de vida normalmente prevalecem sobre os riscos cirúrgicos.
O método descrito aqui, Precise Intracerebral Non-invasivo Cirurgia Guiada (PING), foi desenvolvido com o propósito de desconectar circuitos neurais, limitando os danos cerebrais colaterais. O método utiliza ultrassom focado em baixa intensidade combinado com injeção intravenosa de microbolhas para abrir o BBB, a fim de entregar uma neurotoxina. Esta abordagem não produz lesões térmicas no cérebro3,4,5,,6,7, e o período de abertura do BBB pode ser explorado para fornecer compostos bbb-impermeáveis ao cérebro parenchyma. A abertura do BBB é transitória, podendo ser produzida de forma direcionada usando orientação de ressonância magnética. Em nossos estudos, o período de abertura do BBB tem sido utilizado para fornecer uma neurotoxina circulante para uma área alvo do parênquim cerebral em ratos e camundongos8,9. O ácido quinolínico é uma neurotoxina bem tolerada quando administrada por via intravenosa10, intraarterially10, ou intraperitoneally8,9,11. A falta de toxicidade do QA deve-se à sua baixa permeabilidade BBB, que tem sido relatada como insignificante10. Em contraste, a injeção direta de QA no parênquim cerebral produz lesões neuronais que poupam os axônios vizinhos12,13. Assim, quando a QA circulante ganha acesso ao parênquim cerebral na área alvo da abertura do BBB, a morte neuronal é produzida8,9. O presente método produz, assim, perda neuronal focal de forma precisamente direcionada e não invasiva.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia.
1. Preparação de reagentes
- No dia da cirurgia, prepare 6,0 mL de ácido quinolínico injetável (QA). Dissolver 450 mg de QA em 4,0 mL de 1.0 N NaOH. Adicione 0,6 mL de PBS de 10x, pH a 7,4, e leve a um volume final de 6,0 mL com dH2O. Filtre através de 0,22 μm filtro de seringa. A solução é estável por 2 semanas a 4 °C.
- Prepare uma dispersão aquosa de microbolhas em soro fisiológico normal por sônica de sonda a partir de gás decafluorobutano e estabilize com a concha de monocamado de estearato DSPC/PEG12.
- O tamanho microboliza por flutuação em gravidade normal. Determine a concentração e o tamanho da microbolhas por sensor de eletrozona usando o contador Multisizer III. A concentração de microbolhas e a distribuição de tamanho devem ser de 6 x 108/mL e ~2 μm (diâmetro médio de partículas), respectivamente. As maiores bolhas são removidas por exclusão/separação de flutuação.
- Alternativamente, compre microbolhas disponíveis comercialmente.
2. Preparação de animais
- Aclimatar o animal (rato ou rato) por 3 dias após o parto. Os experimentos descritos aqui usaram ratos Sprague-Dawley (5-6 semanas de idade) ou ratos estruturais internos telencéceicos (tish) (colônia local).
- Abrigar os animais sob uma luz de 12 horas: ciclo escuro de 12 horas.
- Grave os pesos dos animais. Essas informações são importantes durante todo o procedimento.
- Obtenha imagens de Mr ponderadas t2 no dia anterior ao procedimento de FUS, a fim de estabelecer imagens de linha de base pré-operatórias. Use os seguintes parâmetros para imagem T2: tempo de repetição/tempo de eco [TR/TE] =3.000/138 milissegundos, 3 médias, campo de visão=29 x 45 mm2, tamanho da matriz = 125 x 192, espessura da fatia = 0,23 mm.
- Anestesiar o animal com isoflurane (4% de indução, 2% de manutenção). Confirme a profundidade adequada da anestesia usando uma pitada de dedo do dedo do sol. Aplique uma pomada oftálmica aos olhos.
- Raspe o couro cabeludo do animal e remova o cabelo restante com creme depilatório.
- Use um cateter de veias da cauda para a infusão de microbolhas, agente de contraste e QA. Os cateteres consistem em um comprimento de tubo PE10 equipado com uma agulha de 30 G x 1/2 polegada. Deixe uma seringa de 1 mL com soro fisiológico heparinizado na linha, para ser removida e recolocado quando a linha for usada para infusões.
3. Procedimentos de ressonância magnética e ping
- Realize a ressonância magnética em uma unidade de 7 T MR com uma força gradiente de 600 mT/m/ms(Figura 1 e Figura 2). Realize aquisições de ressonância magnética utilizando uma bobina de superfície incorporada no sistema FUS.
NOTA: O sistema de FUS utilizado para os experimentos compreende três partes: (i) o sistema de sônica é um pré-focalização compatível com MR, Matriz anular de 8 elementos, transdutor de 1,5 MHz (raio esférico = 20 mm ± 2 mm, diâmetro ativo = 25 mm (f-número = 0,8), com eficiência elétrica-acústica de 80%, que está conectada a um gerador de matriz em fases e amplificador de energia RF; (ii) um estágio de posicionamento motorizado compatível com MR para mover o transdutor na direção anterior-posterior e sentido medio-lateral; (iii) uma estação de trabalho Termoguide para controlar a entrega da sônicação, incluindo foco eletrônico através da modulação de fase para ajustar a profundidade focal(Figura 2). - Coloque o animal anestesiado no conjunto de trenó da bobina(Figura 1)do sistema fus compatível com MR na posição propensa. Imobilize o animal usando a barra incisiva e as barras de ouvido incorporadas no berço do trenó.
- Aplique gel acústico no couro cabeludo molhado com água; garantindo que não existam bolhas, coloque a barreira da membrana da porção do circulador de água do conjunto do transdutor acima do crânio do animal, e baixe o conjunto do transdutor o mais longe possível em uma orientação planar paralela em relação à placa do crânio. Coloque o diafragma do transdutor firmemente contra o couro cabeludo raspado do animal diretamente sobre a placa do crânio.
- Conecte um sensor pneumático ao corpo com fita cirúrgica, para monitorar a respiração. Posicione o sensor pneumático na caixa torácica inferior esquerda.
- Mova o conjunto do braço de FUS com bobina, trenó e animal para a unidade de ressonância magnética 7T(Figura 1).
- Execute uma sequência de batedores T2 para determinar a posição física geral do conjunto transdutor em relação à cabeça do animal, e faça ajustes mecânicos conforme necessário(Figura 2). Os parâmetros para imagem T2 são: tempo de repetição/tempo de eco [TR/TE] = 3.000/138 milissegundos, 3 médias, campo de visão = 29 x 45 mm2, tamanho da matriz = 125 x 192, espessura da fatia = 0,23 mm. A termometria normalmente não é usada neste protocolo.
- Obtenha imagens T2 para refinar o posicionamento do transdutor. Precisamente, defina a localização do transdutor e especifique os pontos focais da sônica usando a função de segmentação do software. Os parâmetros para imagem T2 são: tempo de repetição/tempo de eco [TR/TE] = 3.000/138 milissegundos, 3 médias, campo de visão = 29 x 45 mm2, tamanho da matriz = 125 x 192, espessura da fatia = 0,23 mm.
- Pouco antes da sônicação, injete 300 μL/kg de microbolhas14 através da veia traseira.
- Use um transdutor de 1,5 MHz para produzir sônicas (pacote de onda de 30 ms, ciclo de 3% de imposto, frequência de repetição de rajadas de 1 Hz, duração/sônica de 240 s.
- Imediatamente após a sônicação, injete o agente de contraste de gadodiamida através da veia da cauda e, em seguida, realize varreduras de contraste mais ponderadas em T1 para confirmar a abertura do BBB e a precisão do alvo. Os parâmetros para imagem ponderada T1: TR/TE = 900/12 milissegundos, 2 médias, campo de visão = 24 x 30 mm2, tamanho da matriz = 208 x 256, espessura da fatia = 0,7 mm. Normalmente, uma única varredura T1 é realizada.
- Retire o braço de FUS e o trenó da ressonância magnética e coloque o animal em uma almofada de aquecimento a 40 °C, mantendo 2% de anestesia isoflurane.
- A partir de 30 minutos após a sônicação, use uma bomba de seringa para infundir QA (solução de estoque de 75 mg/mL) através da veia traseira por 1h a uma taxa de 16,8 μL/min para obter uma dosagem final de 225 mg/kg (q.s. a 1,0 mL salino).
- Quando a infusão estiver completa, interrompa a anestesia, mantendo o animal em uma almofada de aquecimento até ficar alerta. Coloque o animal em uma gaiola e faça verificações de rotina para sua atividade a cada 15 minutos, por várias horas após o procedimento.
- Devolva o animal ao vivarium e verifique a cada 6h para o primeiro dia por socorro ou atividade irregular.
- Um dia após a sônica, realize imagens de Mr ponderadas t2 para avaliar quaisquer danos na área de sônicação. Os parâmetros para imagem T2: tempo de repetição/tempo de eco [TR/TE] = 3.000/138 milissegundos, 3 médias, campo de visão = 29 x 45 mm2, tamanho da matriz = 125 x 192, espessura da fatia = 0,23 mm. As imagens são avaliadas para áreas de hiperintensidade para identificar possíveis danos/edema tecidual.
4. Análise post-mortem da perda neuronal
- Permita uma pós-sônica, período de sobrevivência de 4 a 5 dias para avaliar a perda neuronal com histoquímica Fluoro-Jade.
- Anestesiar profundamente o animal com isoflurano, e eutanásia via perfusão intracárdia com tampão fosfato de 0,1 M (pH 7,4) seguido de 4% de paraformaldeído no tampão fosfato.
- Remova o cérebro do crânio e pós-correção por 2 dias em 4% de paraformaldeído.
- Mergulhe o cérebro em 30% de sacarose para crioproteção, e corte seções a uma espessura de 20-30 μm com um criostat.
- Monte seções criostatas em lâminas gelatinizadas e secas durante a noite.
- Deslizamentos de reidratação em água destilada e, em seguida, desidratam em etanols de grau ascendente. Após a desidratação, a reidratação desliza em etanols de grau descendente.
- Transfira slides para uma solução de 0,06% de permanganato de potássio por 15 minutos em um agitador orbital.
- Enxágüe slides por 1 min em água destilada e transfira para uma solução de 0,001% de Fluoro-Jade B em ácido acético de 0,1%. Incubar sob agitação suave por 30 minutos em temperatura ambiente. Enxágüe lâminas três vezes por 1 min em água destilada.
- Seque os slides em um aquecedor de slides, equilibre-se em xileno por 3 minutos e cubra usando mídia de montagem DPX.
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Representative Results
Esta seção descreve o efeito do PING em neurônios localizados em uma displasia neocortical. Displasias teciduais são uma característica comum no cérebro de pacientes com epilepsia resistente a medicamentos, e a remoção cirúrgica de displasias convulsivas-gênicas pode fornecer excelente controle das convulsões15. Definir o efeito do PING no tecido cerebral displásico é, portanto, uma prioridade importante. Um modelo de rato de displasia cortical genética, o rato tish, foi selecionado para estudar esta questão porque o cérebro tish exibe tecido displásico (heterotopia de banda subcortical) localizado abaixo de um neocórtex normalmente posicionado (Figura 3)16. Tanto a displasia quanto o neocórtex sobrellying contêm neurônios funcionais e exibem conectividade neocortical característica17,18.
PING visando a heterotopia do cérebro de rato tish foi eficaz na produção de perda neuronal focal dos neurônios displásticos(Figura 3). Imagens ponderadas por T2 tiradas um dia após o PING exibem áreas de hiperintensidade, consistentes com danos teciduais nas áreas alvo da sonicação. A coloração pós-morte usando Fluoro-Jade após um período de sobrevivência pós-PING de 5 dias demonstrou neurônios degenerados nas áreas de hiperintensidade T2, corroborando a capacidade do PING de produzir perda neuronal no tecido neocortical displásico direcionado.
Figura 1: Trenó compatível com ressonância magnética (MR) e ímã mr 7T. As principais características do trenó usado para posicionar o animal no ímã MR e entregar a sônica são retratadas(A). O conjunto de trenó é mostrado inserido no ímã 7T MR(B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sala de controle de ressonância magnética (MR) e ultrassom focado orientado por Ressonância Magnética (FUS). A sala de controle é composta por duas estações primárias. A estação onde o investigador está sentado é a área de planejamento para o alvo de FUS(A). A segunda estação é a área de controle do sistema de ressonância magnética(B). A janela reforçada por cobre atrás da estação de ressonância magnética olha para a sala que abriga o ímã 7T. O monitor da estação FUS exibe o software que controla as orientações e parâmetros da sônica (C). Este exemplo mostra uma sônica direcionada ao estriado sobreposto a uma imagem mr ponderada T2(D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ping produz perda neuronal no neocórtex displástico do cérebro de rato tish. As imagens mr ponderadas t2(A,B) foram obtidas um dia após ping. O neocórtex [N], a heterotopia [H], e os ventrículos laterais [LV] são rotulados para fins de orientação (A). Áreas de hiperintensidade [setas brancas e amarelas], indicativas de danos teciduais, podem ser vistas nas áreas alvo da heterotopia em ambos os lados do cérebro(B). Mancha pós-morte com Fluoro-Jade(C-F). Células verdes brilhantes que representam neurônios degenerados são observadas nas regiões correspondentes às áreas de hiperintensidade nos lados esquerdo(C,E; setas brancas) e direita(D,F; setas amarelas) do cérebro. Barras de escala: C,D = 1 mm; E,F = 0,5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método PING foi projetado para produzir lesões neuronais não invasivas e direcionadas. O método deriva de uma forte e crescente base de pesquisa no campo do ultrassom focado3,4,,5,6,7. A capacidade de fornecer acesso focal a áreas específicas do cérebro parenchyma através da abertura transitória do BBB criou uma avenida para entregar uma grande variedade de agentes que normalmente não teriam acesso ao cérebro. Esta oportunidade está sendo em grande parte avançada para a entrega central de agentes terapêuticos que possuem má permeabilidade BBB. O método PING aproveita a mesma oportunidade de uma maneira diferente, fornecendo uma neurotoxina, com o objetivo final de destruir circuitos que contribuem para a disfunção neurológica. Circuitos neurais aberrantes representam um alvo eficaz para a intervenção cirúrgica para atenuar o impacto de certas doenças neurológicas2,15. O objetivo a longo prazo para o método PING é aumentar as abordagens disponíveis atualmente para desconectar circuitos que contribuem para a disfunção neural.
O projeto de um estudo abrangente usando o método PING incorporaria vários grupos de controle. Esses grupos incluiriam: (a) um grupo não tratado [Sem FUS/No QA]; b Um grupo que controla os efeitos diretos do FUS [FUS/No QA]; c Um grupo que avalia os efeitos diretos da neurotoxina sistêmica na ausência de FUS [Sem FUS/QA]. Os resultados nesses grupos seriam comparados com o grupo ping primário [FUS/QA].
O método PING requer habilidades básicas para o manuseio de animais de pequeno porte. Estes incluem a indução e manutenção da anestesia, colocação de linha venosa traseira, administração intravenosa de múltiplos agentes na instalação de uma unidade de ressonância magnética, infusão intravenosa de uma droga e cuidados com animais durante os períodos operacionais e pós-operatórios. Também requer a capacidade de realizar perfusão intracárdica, secção tecidual, coloração histoquímica e análises microscópicas. O treinamento institucional e a aprovação de um Comitê de Cuidado e Uso de Animais, ou órgão equivalente, são necessários para várias das etapas do protocolo.
O protocolo inicial para o procedimento PING utilizou injeção intraperitoneal repetitiva de QA durante vários dias8,9. Essa abordagem ainda é viável e eficaz. No entanto, o protocolo atual modificou a rota e a taxa de administração de QA. Em particular, a QA foi administrada por via intravenosa durante um período pós-sonicação de 1 h de infusão. Novamente, qualquer protocolo de administração é eficaz. O período de sobrevivência de 4 a 5 dias utilizado no protocolo atual foi adotado para otimizar o uso do método Fluoro-Jade para detectar neurônios degenerados. Se forem necessários períodos de sobrevivência mais longos, então métodos alternativos de coloração de tecido seriam indicados. Uma dessas abordagens seria usar um anticorpo específico para neurônios (por exemplo, anti-NeuN), para demonstrar imunohistoquesticamente onde os neurônios sobreviventes permaneceram após um período de sobrevivência pós-sônica mais longo. Uma variedade de resultados, além das análises estruturais atuais, também seria útil. Por exemplo, avaliações pós-PING de desfechos eletrofisiológicos e comportamentais avançariam significativamente a caracterização do impacto do método PING.
Uma complicação potencial dos procedimentos de TR é que as temperaturas podem ser elevadas nas proximidades do crânio, particularmente quando se miram em áreas corticais localizadas perto do crânio. Essa complicação atualmente restringe a gama de locais (envelope de tratamento) amenáveis à lesão térmica por meio de FUS (HIFU) de alta intensidade. No contexto do PING, aumentos térmicos próximos ao crânio também podem representar uma limitação da técnica. No entanto, a baixa intensidade da sônica utilizada com ping reduz o risco de lesão térmica, e deve expandir o envelope de tratamento em comparação com a HIFU.
O método PING possui vários recursos que são intensivos em infraestrutura e intensivos em treinamento. São necessários equipamentos de FUS compatíveis com ressonância magnética e uma instalação de ressonância magnética equipada para pesquisa animal. Isso representa um investimento front-end considerável, a fim de fornecer a infraestrutura de pesquisa necessária. No entanto, é encorajador notar que o número de locais equipados com tecnologia DE FUS está se expandindo rapidamente tanto para pesquisas quanto para esforços clínicos. Assim, à medida que o número de sites disponíveis para a realização desse trabalho aumenta, as oportunidades de investigação in loco e/ou colaborativa aumentarão. Em termos de treinamento, qualquer pesquisador que buscasse realizar estudos de ME se beneficiaria do treinamento de um grupo de pesquisa experiente em experimentação de ME. Por exemplo, o software de segmentação MRgFUS, embora relativamente simples, é mais facilmente adquirido quando aconselhado por um investigador experiente.
Existem múltiplas modalidades cirúrgicas alternativas para a remoção de circuitos neuronais perturbados. Estes incluem cirurgia resetiva, ablação a laser estereotática, radiocirurgia, ultrassom focado em alta intensidade e tratamento de radiofrequência. Cada uma dessas abordagens é eficaz e pode ser de considerável valor terapêutico para certos distúrbios medicamente intratáveis. No entanto, essas modalidades cirúrgicas possuem uma ou mais limitações específicas: (a) procedimento invasivo, (b) impacto pannecrotico no tecido alvo, (c) dano ao tecido adjacente, não-alvo (por exemplo, axônios de passagem) e (d) atraso na obtenção de resultados efetivos. As vantagens significativas do método PING são que ele: (a) não é invasivo, (b) não é pannecrotico, (c) limita os efeitos sobre o tecido não-alvo adjacente, e (d) deve fornecer resultados rápidos.
Existem várias direções futuras potenciais para o método PING, incluindo aplicações pré-clínicas e clínicas. Com relação à experimentação animal, o método fornece um meio de produção de lesões neuronais focais em modelos pré-clínicos de doenças neurológicas. Por exemplo, recentemente usamos essa abordagem para testar o efeito do PING em um modelo de roedor de epilepsialímbica 19. O tratamento com PING reduziu a frequência de convulsões crônicas e espontâneas em um modelo pilocarpina de epilepsia límbica. Este estudo forneceu a primeira prova pré-plínica de conceito para a utilidade do PING no tratamento de uma doença neurológica.
O ácido quinolínico foi selecionado para o procedimento ping por duas razões primárias. Em primeiro lugar, a literatura existente11 indica que lesões corporais de células neuronais podem ser produzidas poupando outros tecidos não-alvo, como axônios de passagem. Em segundo lugar, embora a QA seja neurotóxica quando entregue diretamente ao cérebro, ela é bem tolerada quando administrada sisticamente devido à sua permeabilidade limitada através do BBB. As outras toxinas que são bem toleradas periféricamente, como o glutamato monossódico (MSG), poderiam ser consideradas alternativas para a QA. Uma vantagem fundamental do MSG seria que existe uma literatura substancial sobre o uso deste composto pelos seres humanos. Um objetivo importante para futuras pesquisas será definir a especificidade da lesão produzida pela QA ou outras neurotoxinas administradas sistematicamente em termos de especificidade potencial do tipo celular. Outra possível aplicação pré-clínica para esta abordagem geral seria administrar um composto periféricamente tolerado que é tóxico para outros tipos de células no parnchyma cerebral, como células gliais. Por exemplo, a injeção periférica de uma toxina que afeta o oligodendroglia poderia permitir a desmielinização focal em uma área de matéria branca. Isso permitiria a desmielinização direcionada de parte de um caminho direcionado. Além disso, a abordagem pode permitir avaliações de desmielinização em série do mesmo local, que é uma marca registrada da esclerose múltipla recorrente.
Com relação às possíveis aplicações futuras de PING em humanos, distúrbios neurológicos nos quais circuitos neurais perturbados são um alvo podem ser favoráveis ao tratamento com PING. Com base em nossos achados pré-clínicos iniciais19, A Epilepsia Resistente a Medicamentos (DRE) é um exemplo promissor de uma desordem que pode se beneficiar do PING. O tratamento cirúrgico da DRE pode ser altamente benéfico, mas continua sendo um dos tratamentos mais subutilizados que é realmente eficaz para uma grande doença neurológica. Uma vantagem do PING nesta configuração é que o volume da área de destino pode ser conformal e ampliado utilizando sonicações seriais em vários locais. Isso permitiria um direcionamento mais preciso de alvos irregularmente moldados e de tamanho irregular no parenchyma cerebral. O processo translacional para ping envolveria necessariamente testes para a segurança da administração sistêmica da QA em primatas não humanos e, finalmente, em humanos. Os metabólitos de kynurenina são normalmente retirados do sangue através dos rins e eliminados via urinação20,21; no entanto, o destino da QA injetada não foi avaliado neste modelo. No entanto, é importante notar neste contexto que altos níveis de QA administrados sistemicamente são bem tolerados em roedores. É importante ressaltar que o uso de PING não impediria o tratamento padrão de cuidado. Foram tratamentos ping únicos ou múltiplos para se mostrarem ineficazes em um determinado paciente, então outros procedimentos, como cirurgia resectiva ou ablativa, permaneceriam opções viáveis. Também é importante reconhecer que o ambiente clínico em que o PING emergiria está idealmente preparado para tradução e implementação22,23,24,,25,26. As modalidades de imagem estrutural e funcional estão rapidamente se tornando mais refinadas, o que permitirá melhor a identificação de alvos apropriados para intervenções precisas. Além disso, não há necessidade de projeto, construção ou aprovação de um novo dispositivo médico para PING. O MED guiado por Ressonância Magnética já é uma modalidade estabelecida e aprovada para múltiplas indicações, incluindo aplicações neurológicas. E, como mencionado anteriormente, os últimos anos testemunharam uma proliferação de locais nos quais o FUS já está em uso clínico. Juntas, essas vantagens sugerem um curso promissor de desenvolvimento para PING para múltiplas aplicações.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem Rene Jack Roy por seu excelente apoio técnico na área de ressonância magnética. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01 NS102194 para KSL e R01 CA217953-01 para MW), o Chester Fund (KSL) e a Focused Ultrasound Foundation (KSL e JW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T-ClinScan MRI System | Bruker Biospin, Ettinglen, Germany | MR Image Acquisition | |
| Acoustic Gel | Litho CLEAR | 11-601 | High Viscosity Accoustic Transmission Gel |
| DPX Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 13512 | Resin Based Cover Glass Mountant |
| Fluoro-Jade B | EDM Millipore | AG310 | High Affinity Stain For Degenerating Neurons |
| Fluovac anesthetic adsorber | Harvard Apparatus | 34-0388 | Organic Anaesthesia Scavenger |
| FUS System | Image Guided Therapy, Pessac, France | LabFUS | MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System |
| Gadodiamide | GE Healthcare AS, Oslo, Norway | Omniscan | MR Contrast Agent |
| Heparin | SAGENT | NDC2502140010 | Anti-Coagulant |
| Hypodermic needle 30G x 1/2 | Becton-Dickinson | 26027 | Tail Vein Catheterization |
| Insulin syringe 28G1/2 (1ml) | EXEL | 26027 | Administration of Injectables to Tail Vein Catheter |
| Isofluorane atomizer | SurgiVet | VCT302 | Anaesthesia Administration |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC1169567762 | Anaesthesia |
| KMnO4 | Sigma | 223468 | Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining |
| Microbubbles | Produced internally: A. Klibanov | 305106 | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Microbubbles (commercial source) | Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA | Definity microbubbles | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments | Model 1030 | Respiration Monitoring |
| Multisizer 3 Coulter counter | Beckman-Coulter, Hialeah, FL | Multisizer 3 | Used to Determine Average Size of Microbubbles |
| Optixcare EYE LUBE | CLC MEDICA, Ontario, Canada | 11611 | Corneal Protectant-Eye Lube |
| PE10 tubing | Becton-Dickinson | 427401 | Tail Vein Catheter Component |
| Quinolinic Acid | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | CAS 89-00-9 | Neurotoxin |
| Sprague-Dawley Rats | Taconic Biosciences | SD-M | Rat Model |
| Syringe Pump | Carnegie Medicin | CMA 100 | Controlled Delivery of Quinolinic Acid |
| Thermoguide Software | Image Guided Therapy, Pessac, France | Thermoguide | Drives Lab FUS System |
| Tish Rats | In-house colony | Rat Model | |
| Veet depilatory cream | Reckitt Benckiser | Removal of Scalp Hair |
References
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