Summary
Målet med protokollen er at give en metode til fremstilling af ikke-invasive neuronale læsioner i hjernen. Metoden udnytter Magnetic Resonance-guidet Fokuseret ultralyd (MRgFUS) til at åbne Blodhjernen Barrier i en forbigående og fokal måde, for at levere en cirkulerende neurotoksin til hjernen parenkym.
Abstract
Kirurgisk indgreb kan være ganske effektiv til behandling af visse typer af medicinsk uhåndterlige neurologiske sygdomme. Denne fremgangsmåde er især nyttig for lidelser, hvor identificerbare neuronal kredsløb spiller en central rolle, såsom epilepsi og bevægelsesforstyrrelser. I øjeblikket tilgængelige kirurgiske modaliteter, mens effektiv, generelt indebærer en invasiv kirurgisk procedure, som kan resultere i kirurgisk skade på ikke-målvæv. Derfor ville det være af værdi at udvide rækken af kirurgiske tilgange til at omfatte en teknik, der er både ikke-invasiv og neurotoksisk.
Her præsenteres en metode til fremstilling af fokale, neuronale læsioner i hjernen på en ikke-invasiv måde. Denne tilgang udnytter lav intensitet fokuseret ultralyd sammen med intravenøse mikrobobler til forbigående og focally åbne Blood Brain Barrier (BBB). Perioden med forbigående BBB åbning udnyttes derefter til at focally levere en systemisk administreret neurotoksin til et målrettet hjerneområde. Neurotoksinokvinolinsyre (QA) er normalt BBB-uigennemtrængelig og tåler det godt, når den administreres intraperitoneally eller intravenøst. Men, Når QA får direkte adgang til hjernevæv, Det er giftigt for neuroner. Denne metode er blevet brugt i rotter og mus til at målrette specifikke hjerneregioner. Umiddelbart efter MRgFUS bekræftes en vellykket åbning af BBB ved hjælp af kontrastforøget T1-vægtet billeddannelse. Efter proceduren, T2 billeddannelse viser skade begrænset til det målrettede område af hjernen og tabet af neuroner i det målrettede område kan bekræftes post-mortem udnytte histologiske teknikker. Især, dyr injiceres med saltvand i stedet for QA demonstrere åbning af BBB, men dot ikke udviser skade eller neuronal tab. Denne metode, der betegnes præcis intracerebral ikke-invasiv guidet kirurgi (PING) kunne give en ikke-invasiv tilgang til behandling af neurologiske lidelser forbundet med forstyrrelser i neurale kredsløb.
Introduction
Formålet med denne metode er at give et middel til at producere ikke-invasive neuronal læsioner i en målrettet region af hjernen. Begrundelsen for at udvikle en sådan tilgang er at afbryde neuronal kredsløb bidrager til neurologiske lidelser. For eksempel kan kirurgi være ganske effektiv til behandling af visse medicinsk uhåndterlige neurologiske lidelser, såsom resistent epilepsi (DRE)1. Men, hver af de tilgængelige kirurgiske modaliteter besidder begrænsninger med hensyn til at producere uønskede følgeskader på hjernen. Traditionel resektiv kirurgi kan være meget invasiv med risiko for blødning, infektion, blodpropper, slagtilfælde, anfald, hævelse af hjernen, og nerveskader2. Alternativer til resektiv kirurgi, der er minimalt invasive eller ikke-invasive omfatter laser interstitiel termisk terapi og radiokirurgi, som også har vist sig at være effektiv til at undertrykke anfald i DRE. For nylig, termiske læsioner produceret af høj intensitet fokuseret ultralyd (HIFU) har vist lovende i at reducere anfald. HIFU er ikke-invasiv; men, dens behandling vindue er i øjeblikket begrænset til mere centrale områder af hjernen på grund af risikoen for termisk skade på ikke-målvæv placeret i nærheden af kraniet. På trods af sådanne begrænsninger, fordelene ved kirurgi ofte opvejer de potentielle risici. For eksempel, selv kirurgi for DRE kan producere følgeskader hjerneskade, dens gavnlige virkninger i at undertrykke anfald og forbedre livskvaliteten typisk forrang over de kirurgiske risici.
Den metode, der er beskrevet heri, Præcis Intracerebral Ikke-invasiv Guidet kirurgi (PING), blev udviklet med henblik på at afbryde neurale kredsløb, samtidig med at begrænse sikkerhedsstillelse hjerneskade. Metoden udnytter lav intensitet fokuseret ultralyd kombineret med intravenøs injektion af mikrobobler til at åbne BBB, for at levere en neurotoksin. Denne fremgangsmåde producerer ikke termiske læsioner tilhjernen 3,,4,,5,6,7, og perioden med BBB åbning kan udnyttes til at levere BBB-uigennemtrængelige forbindelser til hjernen parenkym. Åbningen af BBB er forbigående og kan fremstilles på en målrettet måde ved hjælp af magnetisk resonansbilleddannelsesvejledning. I vores undersøgelser, perioden med BBB åbning er blevet udnyttet til at levere en cirkulerende neurotoksin til et målrettet område af hjernen parenkym i rotter og mus8,9. Quinolininsyre er en neurotoksin, der tåles veltolereret, når det indgives intravenøst10, intraarterialt10eller intraperitoneally8,9,11. Manglen på kvalitetssikringstoksicitet skyldes dens dårlige BBB-permeabilitet, som er blevet rapporteret at være ubetydelig10. I modsætning hertil, direkte injektion af QA i hjernen parenkym producerer neuronal læsioner, der skåner tilstødendeaxoner 12,,13. Således, når cirkulerende QA får adgang til hjernen parenkym i det målrettede område af BBB åbning, neuronal død produceres8,9. Den nuværende metode producerer således fokal neuronal tab på en præcist målrettet og ikke-invasiv måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af University of Virginia Animal Care and Use Committee.
1. Fremstilling af reagenser
- På dagen for operationen, forberede 6.0 ml injicerbar quinolinsyre (QA). 450 mg QA opløses i 4,0 ml 1,0 N NaOH. Der tilsættes 0,6 ml 10x PBS, pH til 7,4, og der tilbrings et endeligt volumen på 6,0 ml med dH2O. Filter gennem 0,22 μm sprøjtefilter. Opløsningen er stabil i 2 uger ved 4 °C.
- Forbered en vandig dispersion af mikrobobler i normalt saltvand ved sondesondering fra decafluorobutangas og stabiliseres med DSPC/PEG stearate monolayer shell12.
- Størrelse mikrobobler ved flotation ved normal tyngdekraft. Bestemme mikroboble koncentration og størrelse ved electrozone sensing ved hjælp af Multisizer III tæller. Mikroboblekoncentrationen og størrelsesfordelingen skal være henholdsvis 6 x 108/ml og ~2 μm (gennemsnitlig partikeldiameter). De største bobler fjernes ved flotation udelukkelse / adskillelse.
- Alternativt kan du købe kommercielt tilgængelige mikrobobler.
2. Tilberedning af dyr
- Akklimatisere dyret (rotte eller mus) i 3 dage efter fødslen. De eksperimenter, der er beskrevet her brugt Sprague-Dawley rotter (5-6 uger) eller telencephalic interne strukturelle heterotopia (tish) rotter (lokal koloni).
- Hus dyrene under en 12 timers lys: 12 timers mørk cyklus.
- Optag dyrenes vægt. Disse oplysninger er vigtige under hele proceduren.
- Få T2-vægtede MR-billeder dagen før FUS-proceduren for at etablere præoperative baseline-billeder. Brug følgende parametre for T2-billeddannelse: gentagelsestid/ekkotid [TR/TE] =3.000/138 millisekunder, 3 gennemsnit, synsfelt=29 x 45 mm2, matrixstørrelse = 125 x 192, udsnitstykkelse = 0,23 mm.
- Bedøve dyret med isofluran (4% induktion, 2% vedligeholdelse). Bekræft tilstrækkelig dybde af anæstesi ved hjælp af en tå knivspids. Påfør en oftalmisk salve til øjnene.
- Barber dyrets hovedbund, og fjern de resterende hår med depilatory creme.
- Brug et hale venekateter til infusion af mikrobobler, kontrastmiddel og QA. Kateteret består af en længde på PE10 slanger udstyret med en 30 G x 1/2 tommer nål. Efterlad en 1 ml sprøjte med hepariniseret saltvand i kø, der skal fjernes og sættes på igen, når linjen anvendes til infusioner.
3. MR-procedurer og PING-procedurer
- Der udføres MR-scanningen på en 7 T MR-enhed med en hældningsstyrke på 600 mT/m/ms (Figur 1 og Figur 2). Udfør MR-anskaffelser ved hjælp af en overfladespole, der er indarbejdet i FUS-systemet.
BEMÆRK: DET FUS-system, der anvendes til forsøgene, består af tre dele: i) sonikeringssystemet er et MR-kompatibelt præfokuseret, 8-elementet ringformet array, 1,5 MHz transducer (sfærisk radius = 20 mm ± 2 mm, aktiv diameter = 25 mm (f-tal = 0,8), med 80% elektrisk akustisk effektivitet, som er forbundet til en fasebaseret generator og RF-forstærker; ii) et MR-kompatibelt motoriseret positionsindretningsstadium, der kan bevæge transduceren i forreste og bageste retning og medio lateral retning iii) en thermoguide-arbejdsstation til kontrol af levering af sonikering, herunder elektronisk fokusering gennem fasemodulering for at justere brænddybden (figur 2). - Ansende dyret på spolens slædesamling (Figur 1) i det MR-kompatible FUS-system i udsat position. Immobilisere dyret ved hjælp af fortænder bar og øre barer indarbejdet i slædens vugge.
- Påfør akustisk gel på den vandbevandede hovedbund; sikre, at der ikke findes bobler, placere membranbarrieren af vandcirkulationspumpedelen af transducersamlingen over dyrets kranium og så vidt muligt sænke transducersamlingen i en parallel planar orientering i forhold til kraniepladen. Placer transducerens mellemgulv fast mod dyrets barberet hovedbund direkte over kraniepladen.
- Fastgør en pneumatisk sensor til kroppen med kirurgisk tape for at overvåge respiration. Placer den pneumatiske sensor på venstre nederste brystkasse.
- Flyt FUS-armsamlingen med spole, slæde og dyr ind i 7T MR-enheden (Figur 1).
- Kør en T2-spejdersekvens for at bestemme transducerenhedens generelle fysiske position i forhold til dyrets hoved, og foretag mekaniske justeringer efter behov (figur 2). Parametrene for T2-billeddannelse er: gentagelsestid/ekkotid [TR/TE] = 3.000/138 millisekunder, 3 gennemsnit, synsfelt = 29 x 45 mm2, matrixstørrelse = 125 x 192, udsnitstykkelse = 0,23 mm. Termometri bruges typisk ikke i denne protokol.
- Ansk af dem for at forfine transducerpositioneringen. Præcist, definere transducer placering og angive omdrejningspunktet (e) af sonikering ved hjælp af målretning funktion af softwaren. Parametrene for T2-billeddannelse er: gentagelsestid/ekkotid [TR/TE] = 3.000/138 millisekunder, 3 gennemsnit, synsfelt = 29 x 45 mm2, matrixstørrelse = 125 x 192, udsnitstykkelse = 0,23 mm.
- Lige før sonikering injiceres 300 μL/kg mikrobobler14 via hale venen.
- Brug en 1,5 MHz transducer til at producere sonikering (30 ms bølgepakke, 3% arbejdscyklus, 1 Hz burst repetition frekvens, 240 s varighed / sonikering.
- Umiddelbart efter sonikering skal gadodiamid kontrastmidlet injiceres via halevenen, og derefter udføre T1-vægtede plus kontrastscanninger for at bekræfte åbningen af BBB og nøjagtigheden af målretning. Parametrene for T1-vægtet billeddannelse: TR/TE = 900/12 millisekunder, 2 gennemsnit, synsfelt = 24 x 30 mm2,matrixstørrelse = 208 x 256, udsnitstykkelse = 0,7 mm. Der udføres typisk en enkelt T1-scanning.
- Fjern FUS-armen og slæden fra MR-scanningen, og anlæg dyret på en varmepude indstillet til 40 °C, samtidig med at 2% isofluran anæstesi bevares.
- Fra 30 minutter efter sonikering skal en sprøjtepumpe anvendes til at indgyde QA (75 mg/ml lageropløsning) via halevenen i 1 time med en hastighed på 16,8 μL/min. for at opnå en endelig dosis på 225 mg/kg (q.s. til 1,0 ml saltvand).
- Når infusionen er færdig, skal anæstesi ophøre, holde dyret på en varmepude, indtil alarm. Placer dyret i et bur og foretage rutinemæssig kontrol for sin aktivitet hver 15 min, i flere timer efter proceduren.
- Returner dyret til vivarium og kontrollere hver 6 timer for den første dag for angst eller uregelmæssig aktivitet.
- En dag efter sonikering, udføre T2-vægtet MR billeddannelse til at vurdere eventuelle skader i området sonikering. Parametrene for T2-billeddannelse: gentagelsestid/ekkotid [TR/TE] = 3.000/138 millisekunder, 3 gennemsnit, synsfelt = 29 x 45 mm2, matrixstørrelse = 125 x 192, skivetykkelse = 0,23 mm. Billeder evalueres for områder med hyperintensitet for at identificere mulige vævsskader/ødem.
4. Post mortem analyse af neuronal tab
- Tillad en post-sonikering, overlevelsesperiode på 4-5 dage til vurdering af neuronal tab med Fluoro-Jade histokemi.
- Dybt bedøve dyret med isofluran, og aflive via intracardial perfusion med 0,1 M fosfat buffer (pH 7,4) efterfulgt af 4% paraformaldehyd i fosfat buffer.
- Fjern hjernen fra kraniet og post-fix i 2 dage i 4% paraformaldehyd.
- Fordyb hjernen i 30% saccharose til kryobeskyttelse, og skær sektioner med en tykkelse på 20-30 μm med en kryostat.
- Monter kryostatsektioner på gelatinerede rutsjebaner og lufttørrer natten over.
- Rehydrere dias i destilleret vand, og derefter dehydrere i stigende gradueret ethanol. Efter dehydrering, rehydrere dias i faldende gradueret ethanol.
- Overfør dias til en opløsning på 0,06% kaliumpermanganat i 15 minutter på en orbital shaker.
- Skyl lysbilleder i 1 min i destilleret vand og overfør til en 0,001% opløsning af Fluoro-Jade B i 0,1% eddikesyre. Inkuberes under forsigtig omrøring i 30 minutter ved stuetemperatur. Skyl slides tre gange i 1 min i destilleret vand.
- Tør diasene på en slidevarmer, ligevægt i xylenes i 3 min. og coverslip ved hjælp af DPX-monteringsmedier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette afsnit beskriver virkningen af PING på neuroner placeret i en neocortisk dysplasi. Væv dysplasi er et fælles træk i hjernen hos patienter med resistent epilepsi, og kirurgisk fjernelse af beslaglæggelse-genic dysplasis kan give fremragende kontrol af anfald15. Definition af pings virkning på dysplastisk hjernevæv er derfor en vigtig prioritet. En rotte model af genetisk kortikale dysplasi, den tish rotte, blev udvalgt til at studere dette problem, fordi tish hjernen udviser dysplastisk væv (subkortikale bånd heterotopia) placeret under en normalt placeret neocortex (Figur 3)16. Både dysplasi og den overliggende neocortex indeholder neuroner, der er funktionelle og udviser karakteristiske neocortisketilslutningsmuligheder 17,18.
PING rettet mod heterotopia af tish rotte hjernen var effektiv til at producere fokal neuronal tab af dysplastiske neuroner (Figur 3). T2-vægtede billeder taget en dag post-PING udstille områder af hyperintensitet, i overensstemmelse med vævsskader i de målrettede områder af sonikering. Post mortem farvning ved hjælp af Fluoro-Jade efter en 5-dages post-PING overlevelsesperiode demonstreret degenererende neuroner i de områder af T2-hyperintensity, bekræfter evne ping til at producere neuronal tab i målrettet dysplastisk neocortisk væv.
Figur 1: Magnetisk resonans (MR)-kompatibel slæde og 7T MR magnet. De vigtigste funktioner i slæden bruges til at placere dyret i MR magnet og til at levere sonikering er afbildet (A). Slæden er vist indsat i 7T MR magnet (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kontrolrum til MR-billeddannelse (Magnetic Resonance) og MR-styret fokuseret ultralyd (FUS). Kontrolrummet består af to primære stationer. Den station, hvor investigator sidder, er planlægningsområdet for målretning FUS (A). Den anden station er kontrolområdet for MR-systemet (B). Det kobberforstærkede vindue bag MR-stationen ser ind i rummet, der huser 7T magneten. Skærmen på FUS-stationen viser den software, der styrer styringen og parametrene for sonikering (C). Dette eksempel viser en sonikering rettet mod striatum oven på en T2-vægtet MR-billede (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: PING producerer neuronal tab i dysplastisk neocortex af tish rotte hjernen. T2-vægtede MR-billeder (A,B) blev opnået en dag efter PING. Neocortex [N], heterotopia [H] og de laterale hjertekamre [LV] er mærket med henblik på orientering (A). Områder med hyperintensitet [hvide og gule pile], der indikerer vævsskader, kan ses i de målrettede områder af heterotopia på begge sider af hjernen (B). Post-mortem farvning med Fluoro-Jade(C-F). Lyse grønne celler, der repræsenterer degenererende neuroner, observeres i de områder, der svarer til de områder af hyperintensitet på både venstre(C,E; hvide pile) og højre (D,F; gule pile) sider af hjernen. Skalastænger: C,D = 1 mm; E,F = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PING-metoden er designet til at producere ikke-invasive, målrettede neuronale læsioner. Metoden stammer fra et stærkt og voksende fundament af forskning inden for fokuseret ultralyd3,,4,,5,,6,7. Evnen til at give fokal adgang til specifikke områder af hjernen parenkym via forbigående åbning af BBB har skabt en vej til at levere en bred vifte af agenter, der normalt ikke ville få adgang til hjernen. Denne mulighed er i vid udstrækning fremmes for den centrale levering af terapeutiske midler, der besidder dårlig BBB permeabilitet. PING-metoden udnytter den samme mulighed på en anden måde ved at levere et neurotoksin med det ultimative mål at ødelægge kredsløb, der bidrager til neurologisk dysfunktion. Afvigende neurale kredsløb repræsenterer et effektivt mål for kirurgisk indgreb for at dæmpe virkningen af visse neurologiske lidelser2,15. Det langsigtede mål for PING-metoden er at forøge de aktuelt tilgængelige tilgange til frakobling af kredsløb, der bidrager til neural dysfunktion.
Udformningen af en omfattende undersøgelse ved hjælp af PING-metoden vil omfatte flere kontrolgrupper. Disse grupper omfatter: a) en ubehandlet gruppe [Ingen FUS/Ingen KVALITETSSIKRING]; b) en gruppe, der kontrollerer de direkte virkninger af FUS [FUS/No QA] c) en gruppe, der vurderer de direkte virkninger af systemisk neurotoksin i mangel af FUS [Ingen FUS/QA]. Resultaterne i disse grupper vil blive sammenlignet med den primære PING-gruppe [FUS/QA].
PING-metoden kræver grundlæggende færdigheder til håndtering af små dyr. Disse omfatter induktion og vedligeholdelse af anæstesi, placering af en hale vene linje, intravenøs administration af flere agenter i fastsættelsen af en MR-enhed, intravenøs infusion af et lægemiddel, og dyrepleje i de operative og postoperative perioder. Det kræver også evnen til at udføre intracardial perfusion, væv sektionsopdelt, histoktemiske farvning, og mikroskopiske analyser. Institutionel uddannelse og godkendelse fra en dyrepleje- og brugskomité eller et tilsvarende agentur er nødvendig for flere af trinnene i protokollen.
Den oprindelige protokol for PING-proceduren anvendte gentagne intraperitoneale injektion af QA over flere dage8,9. Denne fremgangsmåde er stadig levedygtig og effektiv. Den aktuelle protokol ændrede dog ruten og hastigheden for administration af kvalitetssikring. Især blev QA administreret intravenøst i løbet af en 1 timers eftersoningsperiode for infusion. Igen, enten administration protokol er effektiv. Den 4-5 dages overlevelsesperiode, der blev udnyttet i den nuværende protokol, blev vedtaget for at optimere brugen af Fluoro-Jade-metoden til påvisning af degenererende neuroner. Hvis længere overlevelsesperioder er påkrævet, vil alternative vævsfarvningsmetoder blive angivet. En sådan fremgangsmåde ville være at bruge et neuron-specifikt antistof (f.eks. anti-NeuN) til at demonstrere immunhistokemisk, hvor overlevende neuroner forblev efter en længere overlevelsesperiode efter sonikering. Ud over de nuværende strukturelle analyser vil det også være nyttigt at opnå en række resultater. For eksempel, post-PING vurderinger af elektrofysiologiske og adfærdsmæssige resultater ville i væsentlig grad fremme karakterisering af virkningen af PING-metoden.
En potentiel komplikation ved FUS-procedurer er, at temperaturerne kan hæves i nærheden af kraniet, især når de målrettes mod kortikale områder i nærheden af kraniet. Denne komplikation begrænser i øjeblikket de forskellige steder (behandlingskuvert), der kan benyttes til termisk læsion ved hjælp af højintensitets-FUS (HIFU). I forbindelse med PING, termiske stigninger i nærheden af kraniet kan også udgøre en begrænsning af teknikken. Den lave lydintensitet, der anvendes sammen med PING, reducerer dog risikoen for termisk skade og bør udvide behandlingskonvolutten sammenlignet med HIFU.
PING-metoden har flere funktioner, der både er infrastrukturintensive og træningstunge. Der er behov for MR-kompatibelt FUS-udstyr og et MR-anlæg, der er udstyret til dyreforsøg. Dette er en betydelig front-end investering for at tilvejebringe den nødvendige forskningsinfrastruktur. Det er dog opmuntrende at bemærke, at antallet af lokaliteter, der er udstyret med FUS-teknologi, er i hastig vækst for både forskning og kliniske bestræbelser. Efterhånden som antallet af tilgængelige websteder til udførelse af dette arbejde øges, vil mulighederne for undersøgelser på stedet og/eller samarbejdsundersøgelsen således vokse. Med hensyn til uddannelse vil enhver forsker, der ønsker at gennemføre FUS-undersøgelser, drage fordel af uddannelse af en forskergruppe med erfaring i FUS-eksperimenter. For eksempel, den MRgFUS målretning software, mens relativt ligetil, er lettere erhverves, når rådgivet af en erfaren investigator.
Flere, alternative kirurgiske modaliteter findes for fjernelse af forstyrret neuronal kredsløb. Disse omfatter resective kirurgi, stereotaktisk laser ablation, radiokirurgi, høj intensitet fokuseret ultralyd, og radiofrekvens behandling. Hver af disse tilgange er effektiv og kan være af betydelig terapeutisk værdi for visse medicinsk uhåndterlige lidelser. Disse kirurgiske modaliteter har imidlertid en eller flere specifikke begrænsninger: a) invasiv procedure, b) pannecrotisk påvirkning af målvæv, (c) beskadigelse af tilstødende væv (f.eks. passageraksler) og (d) forsinkelse i opnåelsen af effektive resultater. De betydelige fordele ved PING-metoden er, at den: a) er ikke-invasiv, b) ikke er pannecrotisk, c) begrænser virkningerne på tilstødende ikke-målvæv og (d) bør give hurtige resultater.
Der er flere potentielle fremtidige retninger for PING-metoden, herunder både prækliniske og kliniske anvendelser. Med hensyn til dyreforsøg giver metoden et middel til at producere fokale neuronale læsioner i prækliniske modeller af neurologisk sygdom. For eksempel har vi for nylig brugt denne tilgang til at teste effekten af PING i en gnaver model af limbisk epilepsi19. Behandling med PING reducerede hyppigheden af kroniske, spontane anfald i en pilocarpin model af limbisk epilepsi. Denne undersøgelse gav den første, prækliniske proof of concept for nytten af PING til behandling af en neurologisk lidelse.
Quinolininsyre blev udvalgt til PING-proceduren af to primære årsager. For det førsteindikerer eksisterende litteratur 11, at neuronal celle kropslæsioner kan produceres, mens skåne andre ikke-målvæv, såsom axoner af passage. For det andet, selv om QA er en neurotoksisk, når leveres direkte til hjernen, er det veltolereret, når det administreres systemisk på grund af sin begrænsede permeabilitet gennem BBB. De andre toksiner, der er veltolereret perifert, såsom mononatriumglama (MSG), kunne betragtes som alternativer til QA. En vigtig fordel ved MSG ville være, at der findes en betydelig litteratur om brugen af dette stof af mennesker. Et vigtigt mål for den fremtidige forskning vil være at definere specificiteten af den skade, der forårsages af QA eller andre systemisk administrerede neurotoksiner med hensyn til potentiel celletype specificitet. En anden potentiel præklinisk anvendelse for denne generelle tilgang ville være at administrere en perifert tolereret forbindelse, der er giftigt for andre celletyper i hjernen parenkym, såsom gliaceller. For eksempel, perifer injektion af et toksin, der påvirker oligodendroglia kunne tillade fokal afmyelination i et område af hvidt stof. Dette vil gøre det muligt målrettet demyelinisering af en del af en målrettet vej. Desuden kan man forestille sig, at man kan vurdere den serielle demyelinisering af det samme sted, som er kendetegnende for recidiverings-remitterende multipel sklerose.
Med hensyn til de mulige fremtidige anvendelser af PING hos mennesker, neurologiske lidelser, hvor forstyrret neurale kredsløb er et mål kunne være modtagelige for behandling med PING. Baseret på vores første prækliniskeresultater 19, Lægemiddelresistent epilepsi (DRE) er et lovende eksempel på en lidelse, der kan drage fordel af PING. Kirurgisk behandling af DRE kan være meget gavnligt, men er stadig en af de mest underudnyttede behandlinger, der faktisk er effektiv til en større neurologisk lidelse. En fordel ved PING i denne indstilling er, at mængden af målområdet kan være konform og udvidet ved at udnytte serielle sonikeringer på flere steder. Dette ville give mulighed for mere præcis målretning af uregelmæssigt formede og uregelmæssigt mellemstore mål i hjernen parenkym. Den translationelle proces for PING vil nødvendigvis indebære test for sikkerheden ved systemisk administration af QA hos ikke-menneskelige primater og i sidste ende hos mennesker. Kynurenin metabolitter er typisk ryddet fra blodet gennem nyrerne og elimineres via vandladning20,21; men, skæbne injiceres QA er ikke blevet vurderet i denne model. Ikke desto mindre er det vigtigt at bemærke i denne sammenhæng, at høje niveauer af systemisk administreret QA tåles godt hos gnavere. Det er vigtigt, at brugen af PING ikke ville udelukke behandling af standard for pleje. Var enkelt eller flere PING behandlinger til at vise sig ineffektiv i en given patient, så andre procedurer, såsom resective eller ablativ kirurgi, ville forblive levedygtige muligheder. Det er også vigtigt at erkende , at det kliniske miljø , som PING ville opstå i , ideelt set er klar til oversættelse ogimplementering 22,23,24,25,26. Strukturelle og funktionelle billeddannelsesmoaliteter bliver hurtigt mere raffinerede, hvilket bedre vil gøre det muligt at identificere passende mål for præcise indgreb. Der er heller ikke behov for design, konstruktion eller godkendelse af et nyt medicinsk udstyr til PING. MR-guidet, høj intensitet FUS er allerede en etableret og godkendt modalitet for flere indikationer, herunder neurologiske applikationer. Og som tidligere nævnt har de seneste år været vidne til en spredning af steder, hvor FUS allerede er i klinisk brug. Tilsammen tyder disse fordele på et lovende udviklingsforløb for PING til flere applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Rene Jack Roy for hans fremragende tekniske støtte inden for MR. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01 NS102194 til KSL og R01 CA217953-01 til MW), Chester Fund (KSL) og Focused Ultralyd Foundation (KSL og JW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T-ClinScan MRI System | Bruker Biospin, Ettinglen, Germany | MR Image Acquisition | |
| Acoustic Gel | Litho CLEAR | 11-601 | High Viscosity Accoustic Transmission Gel |
| DPX Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 13512 | Resin Based Cover Glass Mountant |
| Fluoro-Jade B | EDM Millipore | AG310 | High Affinity Stain For Degenerating Neurons |
| Fluovac anesthetic adsorber | Harvard Apparatus | 34-0388 | Organic Anaesthesia Scavenger |
| FUS System | Image Guided Therapy, Pessac, France | LabFUS | MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System |
| Gadodiamide | GE Healthcare AS, Oslo, Norway | Omniscan | MR Contrast Agent |
| Heparin | SAGENT | NDC2502140010 | Anti-Coagulant |
| Hypodermic needle 30G x 1/2 | Becton-Dickinson | 26027 | Tail Vein Catheterization |
| Insulin syringe 28G1/2 (1ml) | EXEL | 26027 | Administration of Injectables to Tail Vein Catheter |
| Isofluorane atomizer | SurgiVet | VCT302 | Anaesthesia Administration |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC1169567762 | Anaesthesia |
| KMnO4 | Sigma | 223468 | Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining |
| Microbubbles | Produced internally: A. Klibanov | 305106 | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Microbubbles (commercial source) | Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA | Definity microbubbles | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments | Model 1030 | Respiration Monitoring |
| Multisizer 3 Coulter counter | Beckman-Coulter, Hialeah, FL | Multisizer 3 | Used to Determine Average Size of Microbubbles |
| Optixcare EYE LUBE | CLC MEDICA, Ontario, Canada | 11611 | Corneal Protectant-Eye Lube |
| PE10 tubing | Becton-Dickinson | 427401 | Tail Vein Catheter Component |
| Quinolinic Acid | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | CAS 89-00-9 | Neurotoxin |
| Sprague-Dawley Rats | Taconic Biosciences | SD-M | Rat Model |
| Syringe Pump | Carnegie Medicin | CMA 100 | Controlled Delivery of Quinolinic Acid |
| Thermoguide Software | Image Guided Therapy, Pessac, France | Thermoguide | Drives Lab FUS System |
| Tish Rats | In-house colony | Rat Model | |
| Veet depilatory cream | Reckitt Benckiser | Removal of Scalp Hair |
References
- Wiebe, S., Eliasziw, M., Matijevic, S. I. Changes in quality of life in epilepsy: How large must they be to be real. Epilepsia. 42, 113-118 (2001).
- McClelland, S., Guo, H., Okuyemi, K. S. Population-based analysis of morbidity and mortality following surgery for intractable temporal lobe epilepsy in the United States. Archives of Neurology. 68, 725-729 (2011).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhotseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: histological findings in rabbits. Ultrasound in Medicine & Biology. 31, 1527-1537 (2005).
- Park, J., Zhang, Y., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A., McDannold, N. J. The kinetics of blood brain barrier permeability and targeted doxorubicin delivery into brain induced by focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 162 (1), 134-142 (2012).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in the presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30, 979-989 (2004).
- Vlachos, F., Tung, Y. S., Konofagou, E. E. Permeability assessment of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using dynamic contrast-enhanced MRI. Physics in Medicine and Biology. 55 (18), 5451-5466 (2010).
- Zhang, Y., et al. focal disconnection of brain circuitry using magnetic resonance-guided low-intensity focused ultrasound to deliver a Neurotoxin. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (9), 2261-2269 (2016).
- Zhang, Y., et al. Testing different combinations of acoustic pressure and doses of quinolinic acid to induce focal-neuron loss in mice using transcranial low-intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 45, 129-136 (2018).
- Foster, A. C., Miller, L. P., Oldendorf, W. H., Schwarcz, R. Studies on the disposition of quinolinic acid after intracerebral or systemic administration in the rat. Experimental Neurology. 84, 428-440 (1984).
- Beskid, M., Różycka, Z., Taraszewska, A. Quinolinic acid: effect on the nucleus arcuatus of the hypothalamus in the rat (ultrastructural evidence). Experimental and Toxicologic Pathology. 49, 477-481 (1997).
- Schwarcz, R., Köhler, C. Differential vulnerability of central neurons of the rat to quinolinic acid. Neuroscience Letters. 38, 85-90 (1983).
- Schwarcz, R., Whetsell, W. O., Mangano, R. M. Quinolinic acid: an endogenous metabolite that produces axon-sparing lesions in rat brain. Science. 219, New York, N.Y. 316-318 (1983).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Agari, T., et al. Successful treatment of epilepsy by resection of periventricular nodular heterotopia. Acta Medica Okayama. 66 (6), 487-492 (2012).
- Lee, K. S., et al. A genetic animal model of human neocortical heterotopia associated with seizures. The Journal of Neuroscience. 17 (16), 6236-6242 (1997).
- Schottler, F., Couture, D., Rao, A., Kahn, H., Lee, K. S. Subcortical connections of normotopic and heterotopic neurons in sensory and motor cortices of the tish mutant rat. The Journal of Comparative Neurology. 395 (1), 29-42 (1998).
- Schottler, F., et al. Normotopic and heterotopic cortical representations of mystacial vibrissae in rats with subcortical band heterotopia. Neuroscience. 108 (2), 217-235 (2001).
- Zhang, Y., et al. Effects of non-invasive, targeted, neuronal lesions on seizures in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Ultrasound in Medicine and Biology. 46, 1224-1234 (2020).
- Holmes, E. W. Determination of serum kynurenine and hepatic tryptophan dioxygenase activity by high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 518-525 (1988).
- Shibata, K., Ohno, T., Sano, M., Fukuwatari, T. The urinary ratio of 3-hydroxykynurenine/3-hydroxyanthranilic acid is an index of predicting the adverse effects of D-trytophan in rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminology. 60, 261-268 (2014).
- Aubry, J. -F., Tanter, M. MR-guided transcranial focused ultrasound. Therapeutic Ultrasound. , 97-111 (2016).
- Elias, W. J., et al. A Randomized trial of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 375, 730-739 (2016).
- Ghanouni, P., et al. Transcranial MR-guided focused ultrasound: a review of the technology and neuro applications. American Journal of Roentgenology. 205, 150-159 (2015).
- Martin, E., Jeanmonod, D., Morel, A., Zadicario, E., Werner, B. High-intensity focused ultrasound for noninvasive functional neurosurgery. Annals of Neurology. 66, 858-861 (2009).
- Monteith, S., et al. Transcranial magnetic resonance-guided focused ultrasound for temporal lobe epilepsy: a laboratory feasibility study. Journal of Neurosurgery. 12, 1-8 (2016).
