Summary
Målet med protokollet är att ge en metod för att producera icke-invasiva neuronala lesioner i hjärnan. Metoden använder Magnetisk resonans-guidad fokuserad ultraljud (MRgFUS) för att öppna blodhjärnbarriären på ett övergående och fokalt sätt, för att leverera ett cirkulerande neurotoxin till hjärnan parenkym.
Abstract
Kirurgiskt ingrepp kan vara ganska effektivt för behandling av vissa typer av medicinskt svårbehandlade neurologiska sjukdomar. Detta tillvägagångssätt är särskilt användbart för sjukdomar där identifierbara neuronala kretsar spelar en nyckelroll, såsom epilepsi och rörelsestörningar. För närvarande tillgängliga kirurgiska modaliteter, medan effektiva, allmänhet innebär en invasiv kirurgiskt ingrepp, vilket kan resultera i kirurgisk skada på icke-mål vävnader. Följaktligen skulle det vara av värde att utöka utbudet av kirurgiska metoder till att omfatta en teknik som är både icke-invasiv och neurotoxiska.
Här presenteras en metod för att producera focal, neuronal skador i hjärnan på ett icke-invasivt sätt. Detta tillvägagångssätt utnyttjar lågintensiva fokuserad ultraljud tillsammans med intravenösa mikrobubblor att transiently och focally öppna blod-hjärnbarriären (BBB). Perioden av övergående BBB öppning utnyttjas sedan att focally leverera ett systemiskt administrerat neurotoxin till en riktad hjärnan område. Den neurotoxin quinolininsyra (QA) är normalt BBB-ogenomtränglig, och tolereras väl när de administreras intraperitoneally eller intravenöst. Emellertid, När QA får direkt tillgång till hjärnvävnad, Det är giftigt för nervceller. Denna metod har använts på råttor och möss för att rikta specifika hjärnregioner. Omedelbart efter MRgFUS, framgångsrik öppning av BBB bekräftas med hjälp av kontrast förbättrad T1-viktade bildbehandling. Efter ingreppet, T2 imaging visar skada begränsas till det riktade området i hjärnan och förlusten av nervceller i det riktade området kan bekräftas post-mortem utnyttja histologiska tekniker. Noterbart, djur injiceras med saltlösning snarare än QA visar öppnandet av BBB, men dot inte uppvisar skada eller neuronal förlust. Denna metod, som kallas Precise Intracerebral Non-invasive Guided kirurgi (PING) skulle kunna ge en icke-invasiv metod för behandling av neurologiska sjukdomar i samband med störningar i neurala kretsar.
Introduction
Syftet med denna metod är att ge ett medel för att producera icke-invasiva neuronala lesioner i en riktad region i hjärnan. Motiveringen för att utveckla ett sådant tillvägagångssätt är att koppla bort neuronala kretsar bidrar till neurologiska sjukdomar. Till exempel, kirurgi kan vara ganska effektiva vid behandling av vissa medicinskt svårbehandlade neurologiska sjukdomar, såsom läkemedelsresistent epilepsi (DRE)1. Var och en av de tillgängliga kirurgiska modaliteterna har dock begränsningar när det gäller att producera oönskade indirekta skador på hjärnan. Traditionell resective kirurgi kan vara mycket invasiv med risk för blödning, infektion, blodproppar, stroke, kramper, svullnad i hjärnan, och nervskador2. Alternativ till resective kirurgi som är minimalt invasiva eller icke-invasiv inkluderar laser interstitiell termisk terapi och radiokirurgi, som också har visat sig vara effektiva i undertrycka beslag i DRE. På senare tid har termiska lesioner som produceras av högintensiva fokuserade ultraljud (HIFU) visat lovande i att minska anfall. HIFU är icke-invasiv; emellertid, dess behandlingsfönster är för närvarande begränsad till mer centrala områden i hjärnan på grund av risken för termisk skada på icke-målvävnad som ligger i närheten av skallen. Trots sådana begränsningar, fördelarna med kirurgi ofta uppväger de potentiella riskerna. Till exempel, även om kirurgi för DRE kan producera indirekta hjärnskador, dess positiva effekter i undertrycka anfall och förbättra livskvaliteten vanligtvis råda över de kirurgiska riskerna.
Den metod som beskrivs häri, Precise Intracerebral Icke-invasiv Guidad kirurgi (PING), utvecklades i syfte att koppla bort neurala kretsar, samtidigt begränsa säkerheter hjärnskador. Metoden utnyttjar lågintensiva fokuserade ultraljud i kombination med intravenös injektion av mikrobubblor för att öppna BBB, för att leverera ett nervgift. Detta tillvägagångssätt producerar inte termiska lesioner till hjärnan3,4,5,6,7, och perioden av BBB öppning kan utnyttjas för att leverera BBB-ogenomträngliga föreningar till hjärnan parenkym. Öppningen av BBB är övergående, och kan produceras på ett målinriktat sätt med hjälp av magnetisk resonanstomografi vägledning. I våra studier, perioden av BBB öppning har utnyttjats för att leverera en cirkulerande neurotoxin till ett målinriktat område av hjärnan parenkym hos råttor och möss8,9. Kinolinsyra är ett neurotoxin som tolereras väl när det administreras intravenöst10, intraarterialt10, eller intraperitoneal8,9,11. Bristen på QA toxicitet beror på dess dåliga BBB permeabilitet, som har rapporterats vara försumbar10. Däremot direkt injektion av QA i hjärnan parenkym producerar neuronala skador som skonar angränsande axoner12,13. Således, när cirkulerande QA vinner tillgång till hjärnan parenkym i det riktade området BBB öppning, neuronal död produceras8,9. Den nuvarande metoden producerar således fokal neuronal förlust på ett exakt målinriktat och icke-invasivt sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av University of Virginia Animal Care and Use Committee.
1. Beredning av reagenser
- På operationsdagen, förbered 6,0 mL injicerbar kinolinsyra (QA). Lös upp 450 mg QA i 4,0 mL på 1,0 N NaOH. Tillsätt 0,6 mL av 10x PBS, pH till 7,4, och ta till en slutlig volym på 6,0 mL med dH2O. Filtrera genom 0,22 μm spruta filter. Lösningen är stabil i 2 veckor vid 4 °C.
- Förbered en vattenhaltig spridning av mikrobubblor i normal saltlösning genom sondljudning från dekafluorbutangas och stabiliseras med DSPC/PEG-stearate monolayerskal12.
- Storlek mikrobubblor genom flotation vid normal gravitation. Bestäm mikrobubbla koncentration och storlek genom elektrozonavkänning med hjälp av Multisizer III-räknare. Mikrobubbla koncentration och storleksfördelning bör vara 6 x 108/ mL och ~ 2 μm (medelvärde partikeldiameter), respektive. De största bubblorna avlägsnas genom flotation uteslutning / separation.
- Alternativt, köpa kommersiellt tillgängliga mikrobubblor.
2. Beredning av djur
- Acklimatisera djuret (råtta eller mus) i 3 dagar efter leverans. De experiment som beskrivs här används Sprague-Dawley råttor (5–6 veckors ålder) eller telencephalic inre strukturella heterotopia (tish) råttor (lokal koloni).
- Hus djuren under en 12 timmars ljus: 12 timmars mörk cykel.
- Registrera djurens vikter. Denna information är viktig under hela förfarandet.
- Få T2-viktade MR-bilder dagen före FUS-proceduren för att kunna upprätta preoperativa baslinjebilder. Använd följande parametrar för T2-avbildning: repetitionstid/ekotid [TR/TE] =3 000/138 millisekunder, 3 medelvärden, synfält=29 x 45 mm2, matrisstorlek = 125 x 192, segmenttjocklek = 0,23 mm.
- Söva djuret med isofluran (4% induktion, 2% underhåll). Bekräfta tillräckligt djup av anestesi med hjälp av en tå nypa. Applicera en oftalmisk salva på ögonen.
- Raka djurets hårbotten, och ta bort det återstående håret med depilatory grädde.
- Använd en svans ven kateter för infusion av mikrobubblor, kontrastmedel, och QA. Katetrarna består av en längd av PE10 slangar försedda med en 30 G x 1/2 tum nål. Lämna en 1 mL spruta med hepariniserad saltlösning i linje, som ska avlägsnas och återfästs när linjen används för infusioner.
3. MRI och PING förfaranden
- Utför MRT på en 7 T MR-enhet med en lutningsstyrka på 600 mT/m/ms (figur 1 och bild 2). Utför MRI-förvärv med hjälp av en ytspole som ingår i FUS-systemet.
OBS: FUS-systemet som används för experimenten omfattar tre delar: (i) ultraljudsbehandlingssystemet är en MR-kompatibel förfokuserad, 8-elements ringformig array, 1,5 MHz-givare (kulsfärisk radie = 20 mm ± 2 mm, aktiv diameter = 25 mm (f-förstärkare = 0,8), med 80% elektrisk-akustisk effektivitet, som är ansluten till en fasad generator och RF-effekt; ii en MR-kompatibel motoriserad positioneringsstadie för att flytta givaren i den främre-bakre riktningen och medio-lateral riktning. iii en Termoguide arbetsstation för att styra leveransen av ultraljudsbehandling, inklusive elektronisk fokusering genom fasmodulering för att justera fokaldjupet (figur 2). - Placera det sövda djuret på slädmonteringen för sladd (figur 1) på det MR-kompatibla FUS-systemet i benäget läge. Immobilisera djuret med hjälp av incisor bar och öronstänger som ingår i slädens vagga.
- Applicera akustisk gel på den vatten-fuktade hårbotten; säkerställa att inga bubblor finns, placera membranbarriären av vattencirkulationspumpen del av givaren församling ovanför djurets skalle, och sänka givaren montering så långt som möjligt i en parallell planar orientering i förhållande till skallen plattan. Placera membran av givaren stadigt mot djurets rakade hårbotten direkt över skallen plattan.
- Fäst en pneumatisk sensor på kroppen med kirurgisk tejp, för att övervaka andning. Placera den pneumatiska sensorn på den vänstra nedre bröstkorgen.
- Flytta FUS armenheten med spole, släde och djur i 7T MRI-enheten (Bild 1).
- Kör en T2-scoutsekvens för att bestämma transducerenhetens allmänna fysiska position i förhållande till djurets huvud, och gör mekaniska justeringar efter behov (Bild 2). Parametrarna för T2-avbildning är: repetitionstid/ekotid [TR/TE] = 3 000/138 millisekunder, 3 medelvärden, synfält = 29 x 45 mm2, matrisstorlek = 125 x 192, segmenttjocklek = 0,23 mm. Termometri används vanligtvis inte i det här protokollet.
- Erhåll T2-bilder för att förfina givaren positionering. Exakt, definiera givaren plats och ange kontaktpunkt (er) av ultraljudsbehandling med hjälp av inriktning funktion av programvaran. Parametrarna för T2-avbildning är: repetitionstid/ekotid [TR/TE] = 3 000/138 millisekunder, 3 medelvärden, synfält = 29 x 45 mm2, matrisstorlek = 125 x 192, segmenttjocklek = 0,23 mm.
- Strax före ultraljudsbehandling, injicera 300 μL/kg mikrobubblor14 via svansvenen.
- Använd en 1,5 MHz-givare för att producera ultraljudsbehandling (30 ms wave-paket, 3% tullcykel, 1 Hz burst repetitionsfrekvens, 240 s varaktighet/ultraljudsbehandling.
- Omedelbart efter ultraljudsbehandling, injicera gadodiamide kontrastmedel via svansen venen, och sedan utföra T1-viktade plus kontrast skanningar för att bekräfta öppnandet av BBB och noggrannheten i inriktning. Parametrarna för T1-viktad bildbehandling: TR/TE = 900/12 millisekunder, 2 medelvärden, synfält = 24 x 30 mm2, matrisstorlek = 208 x 256, skivatjocklek = 0,7 mm. Vanligtvis utförs en enda T1-skanning.
- Ta bort FUS-armen och släden från MRT, och placera djuret på en värmedyna inställd på 40 °C, samtidigt som 2% isofluranbedövning.
- Start 30 min efter ultraljudsbehandling, använd en spruta pump för att ingjuta QA (75 mg/mL stamlösning) via svansvenen för 1 h med en hastighet av 16,8 μL/min för att uppnå en slutlig dosering av 225 mg/kg (q.s. till 1,0 mL saltlösning).
- När infusionen är klar, avbryta anestesi, hålla djuret på en värmedyna tills varning. Placera djuret i en bur och göra rutinkontroller för sin verksamhet var 15 min, i flera timmar efter ingreppet.
- Returnera djuret till vivarium och kontrollera var 6 h för första dagen för nöd eller oregelbunden aktivitet.
- En dag post-ultraljudsbehandling, utföra T2-viktade MR imaging att bedöma eventuella skador i området för ultraljudsbehandling. Parametrarna för T2-bildtagning: repetitionstid/ekotid [TR/TE] = 3 000/138 millisekunder, 3 genomsnitt, synfält = 29 x 45 mm2, matrisstorlek = 125 x 192, segmenttjocklek = 0,23 mm. Bilder utvärderas för områden med hyperintensity för att identifiera möjliga vävnadsskador/ödem.
4. Post-mortem analys av neuronal förlust
- Tillåt en post-ultraljudsbehandling, överlevnad period 4–5 dagar för bedömning av neuronal förlust med Fluoro-Jade histokemi.
- Djupt bedöva djuret med isofluran, och avliva via intracardial perfusion med 0,1 M fosfat buffert (pH 7,4) följt av 4% paraformaldehyd i fosfatbuffert.
- Ta bort hjärnan från skallen och post-fix för 2 dagar i 4% paraformaldehyd.
- Sänk ner hjärnan i 30 % sackaros för kryoskydd, och skär sektioner i en tjocklek av 20–30 μm med en kryostat.
- Mount cryostat sektioner på gelatiniserade diabilder och lufttorka över natten.
- Rehydrera diabilder i destillerat vatten, och sedan torka i stigande graderade etanoler. Efter uttorkning, rehydrera diabilder i fallande graderade etanoler.
- Överför diabilder till en lösning på 0,06 % kaliumpermanganat i 15 min på en orbitalskak.
- Skölj diabilder i 1 min i destillerat vatten och överför till en 0,001% lösning av Fluoro-Jade B i 0,1% ättiksyra. Inkubera under skonsam agitation i 30 min vid rumstemperatur. Skölj diabilder tre gånger i 1 min i destillerat vatten.
- Torka objektglasen på en glidvärmare, jämvikt i xylener i 3 min och täckskydd med hjälp av DPX-monteringsmedia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta avsnitt beskriver effekten av PING på nervceller som ligger i en neokortikal dysplasi. Vävnad dysplasi är ett vanligt inslag i hjärnan hos patienter med läkemedelsresistent epilepsi, och kirurgiskt avlägsnande av beslag-genic dysplasi kan ge utmärkt kontroll av anfall15. Definiera effekten av PING på dysplastic hjärnvävnad är därför en viktig prioritet. En råtta modell av genetiska när dysplasi, den tish råtta, valdes för att studera denna fråga eftersom tish hjärnan uppvisar dysplastisk vävnad (subkortikala bandet heterotopi) ligger under en normalt placerad neocortex (Figur 3)16. Både dysplasi och överliggande neocortex innehåller nervceller som är funktionella och uppvisar karakteristiska neokortikal anslutning17,18.
PING inriktning heterotopia av tish råtta hjärnan var effektivt för att producera fokal neuronal förlust av dysplastiska nervceller (Figur 3). T2-viktade bilder tagna en dag post-PING uppvisar områden av hyperintensity, överensstämmer med vävnadsskador i de riktade områdena av ultraljudsbehandling. Post-mortem färgning med fluoro-Jade efter en 5-dagars post-PING överlevnad period visat degenererande nervceller i områdena T2-hyperintensity, styrker möjligheten för PING att producera neuronal förlust i den riktade dysplastic neocortical vävnad.
Figur 1: Magnetresonans (MR)-kompatibel släde och 7T MR magnet. De viktigaste dragen i släden som används för att placera djuret i MR magnet och att leverera ultraljudsbehandling avbildas (A). Slädmonteringen visas insatt i 7T MR-magneten (B). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Kontrollrum för magnetisk resonans (MR) avbildning och MR-guidad fokuserad ultraljud (FUS). Kontrollrummet omfattar två primära stationer. Stationen där utredaren sitter är planeringsområdet för inriktning på FUS (A). Den andra stationen är kontrollområdet för MR-systemet (B). Det kopparförstärkta fönstret bakom MR-stationen tittar in i rummet som höljer 7T-magneten. Monitorn på FUS-stationen visar programvaran som styr vägledningen och parametrarna för ultraljudsbehandling (C). Det här exemplet visar en ultraljudsbehandling som riktar sig mot striatum överlagrade på en T2-viktad MR-bild (D). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: PING ger neuronal förlust i dysplastic neocortex av tish råtta hjärnan. T2-vägda MR-bilder (A,B) erhölls en dag efter PING. Neocortex [N], heterotopia [H], och de laterala ventriklarna [LV] är märkta i syfte att orientering (A). Områden med hyperintensity [vita och gula pilar], som tyder på vävnadsskada, kan ses i de riktade områdena i heterotopia på båda sidor av hjärnan (B). Infärgning efter slakt med Fluoro-Jade(C–F). Ljusa gröna celler som representerar degenererande nervceller observeras i de regioner som motsvarar de områden av hyperintensity på både vänster (C,E; vita pilar) och höger (D,F; gula pilar) sidor av hjärnan. Skala barer: C,D = 1 mm; E,F = 0,5 mm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PING-metoden är utformad för att producera icke-invasiva, riktade neuronala lesioner. Metoden härstammar från en stark och växande grund för forskning inom området fokuserat ultraljud3,4,55,6,7. Förmågan att ge fokal tillgång till specifika områden i hjärnan parenkym via övergående öppnande av BBB har skapat en väg för att leverera en mängd olika agenter som normalt inte skulle få tillgång till hjärnan. Denna möjlighet är till stor del avancerade för central leverans av terapeutiska medel som besitter dålig BBB permeabilitet. PING-metoden utnyttjar samma möjlighet på ett annat sätt genom att leverera ett nervgift, med det slutliga målet att förstöra kretsar som bidrar till neurologisk dysfunktion. Aberrant neurala kretsar representerar ett effektivt mål för kirurgiskt ingrepp för att dämpa effekterna av vissa neurologiska sjukdomar2,15. Det långsiktiga målet för PING-metoden är att öka de för närvarande tillgängliga metoderna för att koppla bort kretsar som bidrar till neural dysfunktion.
Utformningen av en omfattande studie med PING-metoden skulle omfatta flera kontrollgrupper. Dessa grupper skulle omfatta: a) en obehandlad grupp [No FUS/No QA]; b) En grupp som kontrollerar fus [FUS/nr QA]s direkta effekter. c) en grupp som bedömer de direkta effekterna av systemiskt neurotoxin i frånvaro av FUS [No FUS/QA]. Utfall i dessa grupper skulle jämföras med den primära PING-gruppen [FUS/QA].
PING-metoden kräver grundläggande färdigheter för hantering av smådjur. Dessa inkluderar induktion och underhåll av anestesi, placering av en svans ven linje, intravenös administrering av flera medel i inställningen av en MRI enhet, intravenös infusion av ett läkemedel och djurvård under de operativa och postoperativa perioder. Det kräver också förmågan att utföra intracardial perfusion, vävnadssektionering, histokemisk färgning och mikroskopiska analyser. Institutionell utbildning och godkännande från en animalisk vård- och användningskommitté, eller motsvarande byrå, är nödvändig för flera av stegen i protokollet.
Det initiala protokollet för PING-förfarandet utnyttjas repetitiva intraperitoneal injektion av QA under flera dagar8,9. Denna strategi är fortfarande livskraftig och effektiv. Det aktuella protokollet ändrade dock rutten och hastigheten för QA-administrationen. I synnerhet var QA administreras intravenöst under en 1 h post-ultraljudsbehandling period av infusion. Återigen är antingen administrationsprotokollet effektivt. Den 4 – 5 dagars överlevnadsperiod som utnyttjas i det aktuella protokollet antogs för att optimera användningen av Fluoro-Jade-metoden för att upptäcka degenererande nervceller. Om längre överlevnadsperioder krävs, då skulle alternativa vävnadsfärgningsmetoder anges. Ett sådant tillvägagångssätt skulle vara att använda en neuron-specifik antikropp (t.ex., anti-NeuN), att visa immunohistochemically där överlevande nervceller kvar efter en längre post-ultraljudsbehandling överlevnad period. En mängd olika resultat, utöver de nuvarande strukturella analyserna, skulle också vara användbara. Till exempel skulle post-PING bedömningar av elektrofysiologiska och beteendemässiga resultat avsevärt föra karakterisering av effekterna av PING-metoden.
En potentiell komplikation av FUS förfaranden är att temperaturen kan höjas i närheten av skallen, särskilt när man riktar kortikala områden som ligger nära skallen. Denna komplikation begränsar för närvarande utbudet av platser (behandling kuvert) mottagliga för termisk lesioning med hjälp av hög intensitet FUS (HIFU). I samband med PING, termiska ökningar nära skallen kan också utgöra en begränsning av tekniken. Den låga intensiteten av ultraljudsbehandling som används med PING minskar dock risken för termisk skada, och bör utöka behandlingskuvertet jämfört med HIFU.
PING-metoden besitter flera funktioner som är både infrastrukturintensiva och utbildningsintensiva. MRI-kompatibel FUS-utrustning och en MR-anläggning som är utrustad för djurforskning krävs. Detta innebär en avsevärd front-end investering, för att tillhandahålla den nödvändiga forskningsinfrastrukturen. Det är dock uppmuntrande att notera att antalet platser utrustade med FUS-teknik snabbt expanderar för både forskning och kliniska strävanden. Således, som antalet tillgängliga platser för att utföra sådant arbete ökar, möjligheterna till på plats och / eller samarbete utredning kommer att växa. När det gäller utbildning, varje utredare som försöker genomföra FUS studier skulle dra nytta av utbildning av en forskargrupp med erfarenhet av FUS experiment. Till exempel är MRgFUS inriktning programvara, medan relativt enkelt, lättare förvärvas när de råd av en erfaren utredare.
Flera, alternativa kirurgiska modaliteter finns för avlägsnande av störd neuronal kretsar. Dessa inkluderar resective kirurgi, stereotaktisk laser ablation, radiokirurgi, högintensiva fokuserad ultraljud, och radiofrekvensbehandling. Var och en av dessa metoder är effektiv och kan vara av betydande terapeutiskt värde för vissa medicinskt svårbehandlade sjukdomar. Dessa kirurgiska modaliteter har dock en eller flera specifika begränsningar: (a) invasivt förfarande, b) panecrotisk inverkan på målvävnad, (c) skador på angränsande, icke-målvävnad (t.ex., axoner av passage), och (d) försening i att uppnå effektiva resultat. Betydande fördelar med PING-metoden är att det: (a) är icke-invasiv, (b) är inte pannecrotic, (c) gränser effekter på angränsande icke-målvävnad, och (d) bör ge snabba resultat.
Det finns flera potentiella framtida riktningar för PING-metoden, inklusive både prekliniska och kliniska tillämpningar. Med avseende på djurförsök ger metoden ett medel för att producera fokala neuronala lesioner i prekliniska modeller av neurologisk sjukdom. Till exempel har vi nyligen använt denna metod för att testa effekten av PING i en gnagare modell av limbisk epilepsi19. Behandling med PING minskade frekvensen av kroniska, spontana anfall i en pilokarpin modell av limbisk epilepsi. Denna studie som den första, prekliniska proof of concept för nyttan av PING vid behandling av en neurologisk sjukdom.
Quinolinic syra valdes för PING-förfarandet av två primära skäl. Först anger befintlig litteratur11 att neuronal cell organ organ organ kan produceras samtidigt skona andra icke-mål vävnad, såsom axoner av passage. Andra, även om QA är en neurotoxisk när levereras direkt till hjärnan, Det tolereras väl när det administreras systemiskt på grund av dess begränsade permeabilitet genom BBB. De andra gifter som tolereras väl perifert, såsom mononatriumglutamat (MSG), kan betraktas som alternativ för QA. En viktig fördel med MSG skulle vara att det finns en väsentlig litteratur om användningen av denna förening av människor. Ett viktigt mål för framtida forskning kommer att vara att definiera specificiteten hos skada som produceras av QA eller andra systemiskt administrerade neurotoxiner i termer av potentiell cell-typ specificitet. En annan potentiell preklinisk tillämpning för denna allmänna metod skulle vara att administrera en perifert tolererad förening som är giftigt för andra celltyper i hjärnan parenkym, såsom gliaceller. Till exempel, perifera injektion av ett toxin som påverkar oligodendroglia kan tillåta focal demyelination i ett område med vit fråga. Detta skulle möjliggöra riktad demyelination av en del av en riktad väg. Dessutom kan tillvägagångssättet möjligen tillåta bedömningar av seriell demyelinisering av samma plats, vilket är ett kännetecken för skovledande förlöpande multipel skleros.
När det gäller de möjliga framtida tillämpningar av PING hos människor, neurologiska sjukdomar där störda neurala kretsar är ett mål kan vara mottagliga för behandling med PING. Baserat på våra första prekliniska resultat19, läkemedelsresistent epilepsi (DRE) är ett lovande exempel på en sjukdom som kan dra nytta av PING. Kirurgisk behandling av DRE kan vara mycket fördelaktigt, men är fortfarande en av de mest underutnyttjade behandlingar som faktiskt är effektiva för en större neurologisk sjukdom. En fördel med PING i denna inställning är att volymen av målområdet kan vara conformal och förstoras genom att utnyttja seriella ultraljudsbehandling på flera platser. Detta skulle möjliggöra mer exakt inriktning av oregelbundet formade och oregelbundet stora mål i hjärnan parenkym. Den translationella processen för PING skulle nödvändigtvis innebära testning för säkerheten för systemisk administrering av QA i icke-mänskliga primater, och i slutändan hos människor. Kynureninmetaboliter rensas typiskt från blodet genom njurarna och elimineras via urinering20,21; har dock ödet för injicerad QA inte bedömts i denna modell. Icke desto mindre, Det är viktigt att notera i detta sammanhang att höga nivåer av systemiskt administrerade QA tolereras väl hos gnagare. Viktigt, användning av PING skulle inte utesluta Standard of Care behandling. Var singel eller flera PING behandlingar för att visa sig ineffektiva i en viss patient, då andra förfaranden, såsom resective eller ablativ kirurgi, skulle förbli livskraftiga alternativ. Det är också viktigt att inse att den kliniska miljö som PING skulle växa fram är idealiskt redo för översättning och genomförande22,23,24,25,26. De strukturella och funktionella bildhanteringsmodaliteterna blir snabbt mer förfinade, vilket bättre kommer att möjliggöra identifiering av lämpliga mål(er) för exakta interventioner. Dessutom finns det inget behov av design, konstruktion, eller godkännande av en ny medicinteknisk produkt för PING. MR-guidad, högintensiv FUS är redan en etablerad och godkänd modalitet för flera indikationer, inklusive neurologiska tillämpningar. Och, som tidigare nämnts, har de senaste åren bevittnat en spridning av platser där FUS redan är i klinisk användning. Tillsammans tyder dessa fördelar på en lovande utvecklingskurs för PING för flera applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna känner igen Rene Jack Roy för hans utmärkta tekniska stöd inom området MRI. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01 NS102194 till KSL och R01 CA217953-01 till MW), Chester Fund (KSL), och Focused Ultrasound Foundation (KSL och JW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T-ClinScan MRI System | Bruker Biospin, Ettinglen, Germany | MR Image Acquisition | |
| Acoustic Gel | Litho CLEAR | 11-601 | High Viscosity Accoustic Transmission Gel |
| DPX Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 13512 | Resin Based Cover Glass Mountant |
| Fluoro-Jade B | EDM Millipore | AG310 | High Affinity Stain For Degenerating Neurons |
| Fluovac anesthetic adsorber | Harvard Apparatus | 34-0388 | Organic Anaesthesia Scavenger |
| FUS System | Image Guided Therapy, Pessac, France | LabFUS | MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System |
| Gadodiamide | GE Healthcare AS, Oslo, Norway | Omniscan | MR Contrast Agent |
| Heparin | SAGENT | NDC2502140010 | Anti-Coagulant |
| Hypodermic needle 30G x 1/2 | Becton-Dickinson | 26027 | Tail Vein Catheterization |
| Insulin syringe 28G1/2 (1ml) | EXEL | 26027 | Administration of Injectables to Tail Vein Catheter |
| Isofluorane atomizer | SurgiVet | VCT302 | Anaesthesia Administration |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC1169567762 | Anaesthesia |
| KMnO4 | Sigma | 223468 | Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining |
| Microbubbles | Produced internally: A. Klibanov | 305106 | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Microbubbles (commercial source) | Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA | Definity microbubbles | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments | Model 1030 | Respiration Monitoring |
| Multisizer 3 Coulter counter | Beckman-Coulter, Hialeah, FL | Multisizer 3 | Used to Determine Average Size of Microbubbles |
| Optixcare EYE LUBE | CLC MEDICA, Ontario, Canada | 11611 | Corneal Protectant-Eye Lube |
| PE10 tubing | Becton-Dickinson | 427401 | Tail Vein Catheter Component |
| Quinolinic Acid | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | CAS 89-00-9 | Neurotoxin |
| Sprague-Dawley Rats | Taconic Biosciences | SD-M | Rat Model |
| Syringe Pump | Carnegie Medicin | CMA 100 | Controlled Delivery of Quinolinic Acid |
| Thermoguide Software | Image Guided Therapy, Pessac, France | Thermoguide | Drives Lab FUS System |
| Tish Rats | In-house colony | Rat Model | |
| Veet depilatory cream | Reckitt Benckiser | Removal of Scalp Hair |
References
- Wiebe, S., Eliasziw, M., Matijevic, S. I. Changes in quality of life in epilepsy: How large must they be to be real. Epilepsia. 42, 113-118 (2001).
- McClelland, S., Guo, H., Okuyemi, K. S. Population-based analysis of morbidity and mortality following surgery for intractable temporal lobe epilepsy in the United States. Archives of Neurology. 68, 725-729 (2011).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhotseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: histological findings in rabbits. Ultrasound in Medicine & Biology. 31, 1527-1537 (2005).
- Park, J., Zhang, Y., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A., McDannold, N. J. The kinetics of blood brain barrier permeability and targeted doxorubicin delivery into brain induced by focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 162 (1), 134-142 (2012).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in the presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30, 979-989 (2004).
- Vlachos, F., Tung, Y. S., Konofagou, E. E. Permeability assessment of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using dynamic contrast-enhanced MRI. Physics in Medicine and Biology. 55 (18), 5451-5466 (2010).
- Zhang, Y., et al. focal disconnection of brain circuitry using magnetic resonance-guided low-intensity focused ultrasound to deliver a Neurotoxin. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (9), 2261-2269 (2016).
- Zhang, Y., et al. Testing different combinations of acoustic pressure and doses of quinolinic acid to induce focal-neuron loss in mice using transcranial low-intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 45, 129-136 (2018).
- Foster, A. C., Miller, L. P., Oldendorf, W. H., Schwarcz, R. Studies on the disposition of quinolinic acid after intracerebral or systemic administration in the rat. Experimental Neurology. 84, 428-440 (1984).
- Beskid, M., Różycka, Z., Taraszewska, A. Quinolinic acid: effect on the nucleus arcuatus of the hypothalamus in the rat (ultrastructural evidence). Experimental and Toxicologic Pathology. 49, 477-481 (1997).
- Schwarcz, R., Köhler, C. Differential vulnerability of central neurons of the rat to quinolinic acid. Neuroscience Letters. 38, 85-90 (1983).
- Schwarcz, R., Whetsell, W. O., Mangano, R. M. Quinolinic acid: an endogenous metabolite that produces axon-sparing lesions in rat brain. Science. 219, New York, N.Y. 316-318 (1983).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Agari, T., et al. Successful treatment of epilepsy by resection of periventricular nodular heterotopia. Acta Medica Okayama. 66 (6), 487-492 (2012).
- Lee, K. S., et al. A genetic animal model of human neocortical heterotopia associated with seizures. The Journal of Neuroscience. 17 (16), 6236-6242 (1997).
- Schottler, F., Couture, D., Rao, A., Kahn, H., Lee, K. S. Subcortical connections of normotopic and heterotopic neurons in sensory and motor cortices of the tish mutant rat. The Journal of Comparative Neurology. 395 (1), 29-42 (1998).
- Schottler, F., et al. Normotopic and heterotopic cortical representations of mystacial vibrissae in rats with subcortical band heterotopia. Neuroscience. 108 (2), 217-235 (2001).
- Zhang, Y., et al. Effects of non-invasive, targeted, neuronal lesions on seizures in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Ultrasound in Medicine and Biology. 46, 1224-1234 (2020).
- Holmes, E. W. Determination of serum kynurenine and hepatic tryptophan dioxygenase activity by high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 518-525 (1988).
- Shibata, K., Ohno, T., Sano, M., Fukuwatari, T. The urinary ratio of 3-hydroxykynurenine/3-hydroxyanthranilic acid is an index of predicting the adverse effects of D-trytophan in rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminology. 60, 261-268 (2014).
- Aubry, J. -F., Tanter, M. MR-guided transcranial focused ultrasound. Therapeutic Ultrasound. , 97-111 (2016).
- Elias, W. J., et al. A Randomized trial of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 375, 730-739 (2016).
- Ghanouni, P., et al. Transcranial MR-guided focused ultrasound: a review of the technology and neuro applications. American Journal of Roentgenology. 205, 150-159 (2015).
- Martin, E., Jeanmonod, D., Morel, A., Zadicario, E., Werner, B. High-intensity focused ultrasound for noninvasive functional neurosurgery. Annals of Neurology. 66, 858-861 (2009).
- Monteith, S., et al. Transcranial magnetic resonance-guided focused ultrasound for temporal lobe epilepsy: a laboratory feasibility study. Journal of Neurosurgery. 12, 1-8 (2016).
