Summary
Målet med protokollen er å gi en metode for å produsere ikke-invasive nevronale lesjoner i hjernen. Metoden benytter Magnetic Resonance-guidede Focused Ultrasound (MRgFUS) for å åpne Blodhjernsbarrieren på en forbigående og fokal måte, for å levere et sirkulerende nevrotoksin til hjernens parenchyma.
Abstract
Kirurgisk inngrep kan være ganske effektivt for behandling av visse typer medisinsk intractable nevrologiske sykdommer. Denne tilnærmingen er spesielt nyttig for lidelser der identifiserbare nevronale kretser spiller en nøkkelrolle, som epilepsi og bevegelsesforstyrrelser. Foreløpig tilgjengelig kirurgiske modaliteter, mens effektiv, vanligvis innebære en invasiv kirurgisk prosedyre, som kan resultere i kirurgisk skade på ikke-mål vev. Følgelig ville det være av verdi å utvide utvalget av kirurgiske tilnærminger for å inkludere en teknikk som er både ikke-invasiv og nevrotoksisk.
Her presenteres en metode for å produsere fokale, nevronale lesjoner i hjernen på en ikke-invasiv måte. Denne tilnærmingen benytter lavintensitetsfokusert ultralyd sammen med intravenøse mikrobobler for å midlertidig og fokalt åpne Blood Brain Barrier (BBB). Perioden med forbigående BBB-åpning utnyttes deretter til å levere et systemisk administrert nevrotoksin til et målrettet hjerneområde. Nevrotoksinet quinolinsyre (QA) er normalt BBB-ugjennomtrengelig, og tolereres godt når det administreres intraperitonealt eller intravenøst. Men når QA får direkte tilgang til hjernevev, er det giftig for nevronene. Denne metoden har blitt brukt hos rotter og mus for å målrette bestemte hjerneregioner. Umiddelbart etter MRgFUS, vellykket åpning av BBB er bekreftet ved hjelp av kontrast forbedret T1-vektet bildebehandling. Etter prosedyren viser T2-bildebehandling skade begrenset til det målrettede området av hjernen, og tapet av nevroner i det målrettede området kan bekreftes etter mortem ved hjelp av histologiske teknikker. Spesielt, dyr injisert med saltvann i stedet for QA viser åpning av BBB, men dot ikke viser skade eller neuronal tap. Denne metoden, betegnes Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) kan gi en ikke-invasiv tilnærming for behandling av nevrologiske lidelser forbundet med forstyrrelser i nevrale kretser.
Introduction
Formålet med denne metoden er å gi et middel for å produsere ikke-invasive nevronale lesjoner i et målrettet område av hjernen. Begrunnelsen for å utvikle en slik tilnærming er å koble fra nevronale kretser som bidrar til nevrologiske lidelser. For eksempel kan kirurgi være ganske effektiv i behandling av visse medisinsk intractable nevrologiske lidelser, for eksempel resistent epilepsi (DRE)1. Imidlertid har hver av de tilgjengelige kirurgiske modalitetene begrensninger når det gjelder å produsere uønsket sikkerhet skade på hjernen. Tradisjonell resective kirurgi kan være svært invasiv med risikoen for blødning, infeksjon, blodpropp, hjerneslag, anfall, hevelse i hjernen, og nerveskader2. Alternativer til resective kirurgi som er minimalt invasiv eller ikke-invasiv inkluderer laser interstitiell termisk terapi og strålekirurgi, som også har vist seg å være effektive i å undertrykke anfall i DRE. Mer nylig har termiske lesjoner produsert av høyintensitetsfokusert ultralyd (HIFU) vist løfte om å redusere anfall. HIFU er ikke-invasiv; Imidlertid er behandlingsvinduet for tiden begrenset til mer sentrale områder av hjernen på grunn av risikoen for termisk skade på ikke-målvev som ligger i nærheten av skallen. Til tross for slike begrensninger, fordelene med kirurgi ofte oppveier den potensielle risikoen. For eksempel, Selv om kirurgi for DRE kan produsere sikkerhet hjerneskade, dens gunstige effekter i å undertrykke anfall og forbedre livskvaliteten vanligvis råde over kirurgiskrisiko.
Metoden beskrevet heri, Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING), ble utviklet for å koble nevrale kretser, samtidig som sikkerhet hjerneskade. Metoden benytter lav intensitet fokusert ultralyd kombinert med intravenøs injeksjon av mikrobobler for å åpne BBB, for å levere et nevrotoksin. Denne tilnærmingen produserer ikke termiske lesjoner til hjernen3,4,5,6,7,og perioden med BBB-åpning kan utnyttes til å levere BBB-ugjennomtrengelige forbindelser til hjernen parenchyma. Åpningen av BBB er forbigående, og kan produseres på en målrettet måte ved hjelp av magnetisk resonansavbildningsveiledning. I våre studier har perioden med BBB-åpning blitt benyttet til å levere et sirkulerende nevrotoksin til et målrettet område av hjernensparenchyma hos rotter og mus8,9. Quinolinic acid er et nevrotoksin som tolereres godt når det administreres intravenøst10, intraarterielt10eller intraperitonealt8,9,11. Mangelen på QA toksisitet skyldes sin dårlige BBB permeabilitet, som har blitt rapportert å være ubetydelig10. I motsetning, direkte injeksjon av QA i hjernen parenchyma produserer nevronale lesjoner som sparer nærliggendeaksoner 12,13. Dermed, når sirkulerende QA får tilgang til hjernen parenchyma i det målrettede området av BBB åpning, neuronal død erprodusert 8,9. Den nåværende metoden produserer dermed fokal neuronal tap på en nøyaktig målrettet og ikke-invasiv måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av University of Virginia Animal Care and Use Committee.
1. Tilberedning av reagenser
- På operasjonsdagen, forberede 6,0 ml injiserbar quinolinic acid (QA). Oppløs 450 mg QA i 4,0 ml på 1,0 N NaOH. Tilsett 0,6 ml 10x PBS, pH til 7,4, og ta med til et endelig volum på 6,0 ml med dH2O. Filtrer gjennom 0,22 μm sprøytefilter. Oppløsningen er stabil i 2 uker ved 4 °C.
- Forbered en vandig spredning av mikrobobler i normal saltvann ved sonde sonikering fra decafluorobutane gass og stabilisere med DSPC / PEG stearat monolayer skall12.
- Størrelse mikrobobler ved flotasjon ved normal tyngdekraften. Bestem mikrobublekonsentrasjon og størrelse ved hjelp av Multisizer III-teller. Mikrobublekonsentrasjon og størrelsesfordeling bør være henholdsvis 6 x 108/ml og ~2 μm (gjennomsnittlig partikkeldiameter). De største boblene fjernes ved flotasjonsekskludering/separasjon.
- Alternativt kan kjøpe kommersielt tilgjengelige mikrobobler.
2. Fremstilling av dyr
- Akklimatisere dyret (rotte eller mus) i 3 dager etter levering. Forsøkene som er beskrevet her brukte Sprague-Dawley rotter (5-6 uker) eller telencefalisk indre strukturelle heterotopia (tish) rotter (lokal koloni).
- Hus dyrene under en 12 timers lys: 12 timers mørk syklus.
- Registrer dyrenes vekter. Denne informasjonen er viktig gjennom hele prosedyren.
- Få T2-vektede MR-bilder dagen før FUS-prosedyren for å etablere preoperative grunnlinjebilder. Bruk følgende parametere for T2-bildebehandling: repetisjonstid/ekkotid [TR/TE] =3000/138 millisekunder, 3 gjennomsnitt, synsfelt=29 x 45 mm2, matrisestørrelse = 125 x 192, skivetykkelse = 0,23 mm.
- Bedøve dyret med isofluran (4% induksjon, 2% vedlikehold). Bekreft tilstrekkelig dybde av anestesi ved hjelp av en tåklem. Påfør en oftalmisk salve på øynene.
- Barber dyrets hodebunn, og fjern det gjenværende håret med hårfjerningskrem.
- Bruk et halevenekateter til infusjon av mikrobobler, kontrastmiddel og QA. Kateterne består av en lengde på PE10-rør utstyrt med en 30 G x 1/2 tommers nål. La en 1 ml sprøyte med heparinisert saltvann stå i kø, som skal fjernes og festes på nytt når linjen brukes til infusjoner.
3. MR- og PING-prosedyrer
- Utfør MR på en 7 T MR-enhet med en graderingsstyrke på 600 mT/m/ms (figur 1 og figur 2). Utfør MR-oppkjøp ved hjelp av en overflatespole som er innlemmet i FUS-systemet.
MERK: FUS-systemet som brukes til eksperimentene består av tre deler: (i) sonikeringssystemet er en MR-kompatibel pre-fokusert, 8-element ringformet array, 1,5 MHz svinger (sfærisk radius = 20 mm ± 2 mm, aktiv diameter = 25 mm (f-nummer = 0,8), med 80% elektrisk akustisk effektivitet, som er koblet til en faset array generator og RF-effektforsterker; (ii) et MR-kompatibelt motorisert posisjoneringstrinn for å flytte svingeren i fremre bakre retning og middelmådig sideretning; (iii) en Thermoguide arbeidsstasjon for å kontrollere levering av sonikering, inkludert elektronisk fokus gjennom fasemodulering for å justere brennvidden (figur 2). - Plasser det bedøvede dyret på spolesledeenheten (figur 1) av DET MR-kompatible FUS-systemet i utsatt posisjon. Immobiliser dyret ved hjelp av fortennbaren og ørestangene som er innlemmet i sledens vugge.
- Påfør akustisk gel til den vannfuktede hodebunnen; sikre at det ikke finnes bobler, plasser membranbarrieren til vannsirkulasjonsdelen av transduserenheten over dyrets skallen, og senk transduserenheten så langt som mulig i en parallell planorientering i forhold til skallen. Plasser membranen til transduseren fast mot dyrets barberte hodebunn rett over skallen.
- Fest en pneumatisk sensor til kroppen med kirurgisk tape, for å overvåke åndedrett. Plasser den pneumatiske sensoren på venstre nedre ribbebur.
- Flytt FUS-armenheten med spole, slede og dyr inn i 7T MR-enheten (figur 1).
- Kjør en T2-speidersekvens for å bestemme den generelle fysiske posisjonen til svingerenheten i forhold til dyrets hode, og foreta mekaniske justeringer etter behov (figur 2). Parametrene for T2-avbildning er: repetisjonstid/ekkotid [TR/TE] = 3000/138 millisekunder, 3 gjennomsnitt, synsfelt = 29 x 45 mm2, matrisestørrelse = 125 x 192, skivetykkelse = 0,23 mm. Termometri brukes vanligvis ikke i denne protokollen.
- Få T2-bilder for å finjustere svingerposisjoneringen. Nøyaktig definerer du transduserplasseringen og angir fokuspunktet(e) for sonikering ved hjelp av programvarens målrettingsfunksjon. Parametrene for T2-avbildning er: repetisjonstid/ekkotid [TR/TE] = 3000/138 millisekunder, 3 gjennomsnitt, synsfelt = 29 x 45 mm2, matrisestørrelse = 125 x 192, skivetykkelse = 0,23 mm.
- Like før sonikering, injiser 300 μL/kg mikrobobler14 via halevenen.
- Bruk en 1,5 MHz transduser til å produsere sonikeringer (30 ms bølgepakke, 3% driftssyklus, 1 Hz burst repetisjonsfrekvens, 240 s varighet / sonikering.
- Umiddelbart etter sonikering, injiser gadodiamid kontrastmiddel via halevenen, og utfør deretter T1-vektede pluss kontrastskanninger for å bekrefte åpningen av BBB og nøyaktigheten av målretting. Parametrene for T1-vektet bildebehandling: TR / TE = 900/12 millisekunder, 2 gjennomsnitt, synsfelt = 24 x 30 mm2,matrisestørrelse = 208 x 256, skivetykkelse = 0,7 mm. Vanligvis utføres en enkelt T1-skanning.
- Fjern FUS-armen og sleden fra MR, og plasser dyret på en varmepute satt til 40 °C, samtidig som det opprettholdes 2 % isoflurananestesi.
- Start 30 min etter sonikering, bruk en sprøytepumpe til å infuse QA (75 mg / ml lageroppløsning) via halevenen i 1 time med en hastighet på 16,8 μL / min for å oppnå en endelig dose på 225 mg / kg (q.s. til 1,0 ml saltvann).
- Når infusjonen er fullført, avslutt anestesi, og hold dyret på en varmepute til våken. Plasser dyret i et bur og gjør rutinemessige kontroller for sin aktivitet hver 15 min, i flere timer etter prosedyren.
- Returner dyret til vivarium og sjekk hver 6 time for den første dagen for nød eller uregelmessig aktivitet.
- En dag etter sonikering, utføre T2-vektet MR imaging for å vurdere eventuelle skader i sonikeringsområdet. Parameterne for T2-avbildning: repetisjonstid/ekkotid [TR/TE] = 3000/138 millisekunder, 3 gjennomsnitt, synsfelt = 29 x 45 mm2, matrisestørrelse = 125 x 192, skivetykkelse = 0,23 mm. Bilder evalueres for områder med hyperintensitet for å identifisere mulig vevsskade/ødem.
4. Post-mortem analyse av nevronalt tap
- Tillat en etter-sonikering, overlevelsesperiode på 4-5 dager for å vurdere nevronalt tap med Fluoro-Jade histochemistry.
- Bedøv dyret dypt med isofluran, og euthanize via intracardial perfusjon med 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) etterfulgt av 4% paraformaldehyd i fosfatbuffer.
- Fjern hjernen fra skallen og post-fix i 2 dager i 4% paraformaldehyd.
- Dypp hjernen i 30% sukrose for kryobeskyttelse, og kutt seksjoner med en tykkelse på 20-30 μm med en kryostat.
- Mount cryostat seksjoner på gelatiniserte lysbilder og lufttørk over natten.
- Rehydrer lysbilder i destillert vann, og dehydrere deretter i stigende graderte etanoler. Etter dehydrering, rehydrere lysbilder i synkende graderte etanoler.
- Overfør lysbilder til en løsning på 0,06% kaliumpermanganat i 15 min på en orbital shaker.
- Skyll lysbildene i 1 min i destillert vann og overfør til en 0,001% løsning av Fluoro-Jade B i 0,1% eddiksyre. Inkuber under mild agitasjon i 30 min ved romtemperatur. Skyll lysbildene tre ganger i 1 min i destillert vann.
- Tørk lysbildene på en glidevarmer, likevekt i xylener i 3 min, og dekkslips ved hjelp av DPX monteringsmedier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne delen beskriver effekten av PING på nevroner som ligger i en neokortikale dysplasi. Vevdysplasi er et vanlig trekk i hjernen til pasienter med resistent epilepsi, og kirurgisk fjerning av anfallsgene dysplasier kan gi utmerket kontroll over anfall15. Å definere effekten av PING på dysplastisk hjernevev er derfor en viktig prioritet. En rottemodell av genetisk kortikal dysplasi, tish rotte, ble valgt for å studere dette problemet fordi tish hjernen viser dysplastisk vev (subkortikale bandet heterotopia) ligger under en normalt plassert neocortex (Figur 3)16. Både dysplasi og den overlying neocortex inneholder nevroner som er funksjonelle og viser karakteristisk neokortikaletilkobling 17,18.
PING rettet mot heterotopien til tish rottehjernen var effektiv i å produsere fokal neuronal tap av dysplastiske nevroner (figur 3). T2-vektede bilder tatt en dag etter PING utstilling områder av hyperintensitet, i samsvar med vevsskader i målrettede områder av sonikering. Post-mortem farging ved hjelp av Fluoro-Jade etter en 5-dagers post-PING overlevelse periode demonstrert degenerating nevroner i områdene T2-hyperintensity, bekrefter evnen til PING å produsere neuronal tap i målrettet dysplastisk neokortikale vev.
Figur 1: Magnetisk resonans (MR)-kompatibel slede og 7T MR magnet. De viktigste funksjonene i sleden som brukes til å plassere dyret i MR magnet og for å levere sonikering er avbildet (A). Sledeenheten vises satt inn i 7T MR magnet (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kontrollrom for magnetisk resonans (MR) bildebehandling og MR-guidet fokusert ultralyd (FUS). Kontrollrommet består av to primære stasjoner. Stasjonen der etterforskeren sitter er planleggingsområdet for målretting av FUS (A). Den andre stasjonen er kontrollområdet for MR-systemet (B). Det kobberforsterkede vinduet bak MR-stasjonen ser inn i rommet som huser 7T-magneten. Skjermen på FUS-stasjonen viser programvaren som styrer veiledningen og parametrene for sonikering (C). Dette eksemplet viser en sonikering rettet mot striatum lagt på et T2-vektet MR-bilde (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: PING produserer nevronalt tap i dysplastisk neocortex av tish rotte hjernen. T2-vektede MR-bilder (A, B) ble oppnådd en dag etter PING. Neocortex [N], heterotopia [H] og laterale ventriklene [LV] er merket med det formål å orientering (A). Områder av hyperintensitet [hvite og gule piler], som indikerer vevsskade, kan ses i de målrettede områdene av heterotopien på begge sider av hjernen (B). Post-mortem farging med Fluoro-Jade(C-F). Lyse grønne celler som representerer degenerating nevroner observeres i regionene som tilsvarer områdene av hyperintensitet på både venstre (C,E; hvite piler) og høyre (D,F; gule piler) sider av hjernen. Vekt stenger: C, D = 1 mm; E, F = 0,5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PING-metoden er designet for å produsere ikke-invasive, målrettede nevronale lesjoner. Metoden stammer fra et sterkt og voksende grunnlag for forskning innen fokusert ultralyd3,4,5,6,7. Evnen til å gi fokal tilgang til bestemte områder av hjernen parenchyma via forbigående åpning av BBB har skapt en vei for å levere et bredt utvalg av agenter som normalt ikke ville få tilgang til hjernen. Denne muligheten blir i stor grad avansert for den sentrale leveringen av terapeutiske midler som har dårlig BBB permeabilitet. PING-metoden utnytter samme mulighet på en annen måte ved å levere et nevrotoksin, med det endelige målet om å ødelegge kretser som bidrar til nevrologisk dysfunksjon. Avvikende nevrale kretser representerer et effektivt mål for kirurgisk inngrep for å dempe virkningen av visse nevrologiskelidelser 2,15. Det langsiktige målet for PING-metoden er å forsterke de tilgjengelige tilnærmingene for å koble fra kretser som bidrar til nevral dysfunksjon.
Utformingen av en omfattende studie ved hjelp av PING-metoden ville innlemme flere kontrollgrupper. Disse gruppene vil omfatte: (a) en ubehandlet gruppe [No FUS/No QA]; (b) en gruppe som kontrollerer de direkte effektene av FUS [FUS/No QA]; c) en gruppe som vurderer de direkte effektene av systemisk nevrotoksin i fravær av FUS [No FUS/QA]. Resultatene i disse gruppene vil bli sammenlignet med den primære PING-gruppen [FUS/QA].
PING-metoden krever grunnleggende ferdigheter for håndtering av små dyr. Disse inkluderer induksjon og vedlikehold av anestesi, plassering av en halevenelinje, intravenøs administrering av flere midler i innstillingen av en MR-enhet, intravenøs infusjon av et stoff og dyrepleie i de operative og postoperative periodene. Det krever også evnen til å utføre intrakarial perfusjon, vevsseksjon, histokjemisk farging og mikroskopiske analyser. Institusjonell opplæring og godkjenning fra en dyreomsorgs- og brukskomité, eller tilsvarende organ, er nødvendig for flere av trinnene i protokollen.
Den første protokollen for PING-prosedyren benyttet repeterende intraperitoneal injeksjon av QA over flere dager8,,9. Denne tilnærmingen er fortsatt levedyktig og effektiv. Gjeldende protokoll endret imidlertid ruten og frekvensen av QA-administrasjon. Spesielt ble QA administrert intravenøst i løpet av en 1 time post-sonikeringsperiode med infusjon. Igjen, enten administrasjonsprotokollen er effektiv. Overlevelsesperioden på 4–5 dager som benyttes i den nåværende protokollen ble vedtatt for å optimalisere bruken av Fluoro-Jade-metoden for å oppdage degenererende nevroner. Hvis lengre overlevelsesperioder er nødvendig, vil alternative vevsfargingsmetoder bli indikert. En slik tilnærming ville være å bruke et nevronspesifikt antistoff (f.eks. anti-NeuN), for å demonstrere immunohistokjemisk hvor overlevende nevroner forble etter en lengre overlevelsesperiode etter sonikering. En rekke utfall, i tillegg til dagens strukturelle analyser, vil også være nyttig. For eksempel vil post-PING-vurderinger av elektrofysiologiske og atferdsmessige resultater betydelig fremme karakteriseringen av virkningen av PING-metoden.
En potensiell komplikasjon av FUS prosedyrer er at temperaturen kan heves i nærheten av skallen, spesielt når rettet mot kortikale områder som ligger i nærheten av skallen. Denne komplikasjonen begrenser for tiden området av steder (behandling konvolutt) mottagelig for termisk lesjonering ved hjelp av høy intensitet FUS (HIFU). I sammenheng med PING kan termiske økninger i nærheten av skallen også representere en begrensning av teknikken. Den lave intensiteten av sonikering som brukes med PING reduserer imidlertid risikoen for termisk skade, og bør utvide behandlingskonvolutten sammenlignet med HIFU.
PING-metoden har flere funksjoner som er både infrastrukturintensive og opplæringsintensive. MR-kompatibelt FUS-utstyr og et MR-anlegg utstyrt for dyreforskning er nødvendig. Dette representerer en betydelig front-end investering, for å gi den nødvendige forskningsinfrastrukturen. Det er imidlertid oppmuntrende å merke seg at antall nettsteder utstyrt med FUS-teknologi raskt ekspanderer for både forskning og kliniske bestrebelser. Dermed, etter hvert som antall tilgjengelige nettsteder for å utføre slikt arbeid øker, vil mulighetene for etterforskning på stedet og/eller samarbeidsundersøkelsen vokse. Når det gjelder opplæring, vil enhver etterforsker som ønsker å gjennomføre FUS-studier ha nytte av opplæring av en forskningsgruppe med erfaring i FUS-eksperimentering. For eksempel er MRgFUS målretting programvare, mens relativt grei, lettere ervervet når anbefalt av en erfaren etterforsker.
Flere, alternative kirurgiske modaliteter eksisterer for fjerning av forstyrret nevronale kretser. Disse inkluderer resective kirurgi, stereotaktisk laserablasjon, radiokirurgi, høy intensitet fokusert ultralyd, og radiofrekvens behandling. Hver av disse tilnærmingene er effektive og kan være av betydelig terapeutisk verdi for visse medisinsk vanskelige lidelser. Imidlertid har disse kirurgiske modalitetene en eller flere spesifikke begrensninger: (a) invasiv prosedyre, (b) pannekrotisk innvirkning på målvev, (c) skade på tilstøtende, ikke-målvev (f.eks. aksoner i passasjen) og (d) forsinkelse i å oppnå effektive resultater. Betydelige fordeler med PING-metoden er at den: (a) er ikke-invasiv, (b) er ikke panorkrotisk, (c) begrenser effekter på tilstøtende ikke-målvev, og (d) bør gi raske resultater.
Det finnes flere potensielle fremtidige retninger for PING-metoden, inkludert både prekliniske og kliniske anvendelser. Med hensyn til dyreeksperimentering gir metoden et middel for å produsere fokale nevronale lesjoner i prekliniske modeller av nevrologisk sykdom. For eksempel har vi nylig brukt denne tilnærmingen til å teste effekten av PING i en gnagermodell av limbisk epilepsi19. Behandling med PING reduserte hyppigheten av kroniske, spontane anfall i en pilokarpinmodell av limbisk epilepsi. Denne studien ga det første, prekliniske beviset på konseptet for bruk av PING i behandling av en nevrologisk lidelse.
Quinolinic acid ble valgt av PING-prosedyren av to primære årsaker. For det førsteindikerer eksisterende litteratur 11 at nevronale cellelegemer kan produseres mens du sparer andre ikke-målvev, for eksempel aksoner i passasjen. For det andre, selv om QA er en nevrotoksisk når den leveres direkte til hjernen, tolereres det godt når det administreres systemisk på grunn av begrenset permeabilitet gjennom BBB. De andre toksinene som tolereres godt perifert, for eksempel mononatriumglutamat (MSG), kan betraktes som alternativer for QA. En viktig fordel med MSG ville være at det finnes en betydelig litteratur om bruk av denne forbindelsen av mennesker. Et viktig mål for fremtidig forskning vil være å definere spesifisiteten av skade produsert av QA eller andre systemisk administrerte nevrotoksiner når det gjelder potensiell celletype spesifisitet. En annen potensiell preklinisk anvendelse for denne generelle tilnærmingen ville være å administrere en perifert tolerert forbindelse som er giftig for andre celletyper i hjernen parenchyma, som glialceller. For eksempel kan perifer injeksjon av et toksin som påvirker oligodendroglia tillate fokal demyelinasjon i et område med hvit materie. Dette ville tillate målrettet demyelination av en del av en målrettet vei. Videre kan tilnærmingen tenkes tillate vurderinger av seriell demyelinasjon av samme sted, som er et kjennetegn på tilbakefall-remittering multippel sklerose.
Med hensyn til mulige fremtidige anvendelser av PING hos mennesker, kan nevrologiske lidelser der forstyrrede nevrale kretser er et mål være mottagelig for behandling med PING. Basert på våre første prekliniske funn19,Drug Resistant Epilepsy (DRE) er et lovende eksempel på en lidelse som kan ha nytte av PING. Kirurgisk behandling av DRE kan være svært gunstig, men er fortsatt en av de mest underutnyttede behandlingene som faktisk er effektive for en stor nevrologisk lidelse. En fordel med PING i denne innstillingen er at volumet av målområdet kan være konform og forstørret ved å bruke serielle sonikeringer på flere steder. Dette ville tillate mer presis målretting av uregelmessig formede og uregelmessig størrelse mål i hjernen parenchyma. Den translasjonelle prosessen for PING ville nødvendigvis innebære testing for sikkerheten til systemisk administrasjon av QA i ikke-menneskelige primater, og til slutt hos mennesker. Kynurenin metabolitter er vanligvis fjernet fra blodet gjennom nyrene og elimineres via vannlating20,21; Skjebnen til injisert QA er imidlertid ikke vurdert i denne modellen. Likevel er det viktig å merke seg i denne sammenhengen at høye nivåer av systemisk administrert QA tolereres godt hos gnagere. Viktigere, bruk av PING ville ikke utelukke Standard of Care behandling. Var enkle eller flere PING-behandlinger for å vise seg ineffektive hos en gitt pasient, ville andre prosedyrer, som resective eller ablativ kirurgi, forbli levedyktige alternativer. Det er også viktig å erkjenne at det kliniske miljøet der PING ville dukke opp er ideelt klar for oversettelse og implementering22,23,24,25,26. Strukturelle og funksjonelle bildemodaliteter blir raskt mer raffinerte, noe som bedre vil tillate identifisering av passende mål for presise intervensjoner. Det er heller ikke behov for design, konstruksjon eller godkjenning av et nytt medisinsk utstyr for PING. MR-guidet, høyintensitets FUS er allerede en etablert og godkjent modalitet for flere indikasjoner, inkludert nevrologiske applikasjoner. Og, som nevnt tidligere, har de siste årene vært vitne til en spredning av steder der FUS allerede er i klinisk bruk. Sammen foreslår disse fordelene et lovende utviklingsforløpet for PING for flere applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Rene Jack Roy for sin utmerkede tekniske støtte på MR-området. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01 NS102194 til KSL og R01 CA217953-01 til MW), Chester Fund (KSL) og Focused Ultrasound Foundation (KSL og JW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T-ClinScan MRI System | Bruker Biospin, Ettinglen, Germany | MR Image Acquisition | |
| Acoustic Gel | Litho CLEAR | 11-601 | High Viscosity Accoustic Transmission Gel |
| DPX Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 13512 | Resin Based Cover Glass Mountant |
| Fluoro-Jade B | EDM Millipore | AG310 | High Affinity Stain For Degenerating Neurons |
| Fluovac anesthetic adsorber | Harvard Apparatus | 34-0388 | Organic Anaesthesia Scavenger |
| FUS System | Image Guided Therapy, Pessac, France | LabFUS | MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System |
| Gadodiamide | GE Healthcare AS, Oslo, Norway | Omniscan | MR Contrast Agent |
| Heparin | SAGENT | NDC2502140010 | Anti-Coagulant |
| Hypodermic needle 30G x 1/2 | Becton-Dickinson | 26027 | Tail Vein Catheterization |
| Insulin syringe 28G1/2 (1ml) | EXEL | 26027 | Administration of Injectables to Tail Vein Catheter |
| Isofluorane atomizer | SurgiVet | VCT302 | Anaesthesia Administration |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC1169567762 | Anaesthesia |
| KMnO4 | Sigma | 223468 | Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining |
| Microbubbles | Produced internally: A. Klibanov | 305106 | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Microbubbles (commercial source) | Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA | Definity microbubbles | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments | Model 1030 | Respiration Monitoring |
| Multisizer 3 Coulter counter | Beckman-Coulter, Hialeah, FL | Multisizer 3 | Used to Determine Average Size of Microbubbles |
| Optixcare EYE LUBE | CLC MEDICA, Ontario, Canada | 11611 | Corneal Protectant-Eye Lube |
| PE10 tubing | Becton-Dickinson | 427401 | Tail Vein Catheter Component |
| Quinolinic Acid | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | CAS 89-00-9 | Neurotoxin |
| Sprague-Dawley Rats | Taconic Biosciences | SD-M | Rat Model |
| Syringe Pump | Carnegie Medicin | CMA 100 | Controlled Delivery of Quinolinic Acid |
| Thermoguide Software | Image Guided Therapy, Pessac, France | Thermoguide | Drives Lab FUS System |
| Tish Rats | In-house colony | Rat Model | |
| Veet depilatory cream | Reckitt Benckiser | Removal of Scalp Hair |
References
- Wiebe, S., Eliasziw, M., Matijevic, S. I. Changes in quality of life in epilepsy: How large must they be to be real. Epilepsia. 42, 113-118 (2001).
- McClelland, S., Guo, H., Okuyemi, K. S. Population-based analysis of morbidity and mortality following surgery for intractable temporal lobe epilepsy in the United States. Archives of Neurology. 68, 725-729 (2011).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhotseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: histological findings in rabbits. Ultrasound in Medicine & Biology. 31, 1527-1537 (2005).
- Park, J., Zhang, Y., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A., McDannold, N. J. The kinetics of blood brain barrier permeability and targeted doxorubicin delivery into brain induced by focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 162 (1), 134-142 (2012).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in the presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30, 979-989 (2004).
- Vlachos, F., Tung, Y. S., Konofagou, E. E. Permeability assessment of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using dynamic contrast-enhanced MRI. Physics in Medicine and Biology. 55 (18), 5451-5466 (2010).
- Zhang, Y., et al. focal disconnection of brain circuitry using magnetic resonance-guided low-intensity focused ultrasound to deliver a Neurotoxin. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (9), 2261-2269 (2016).
- Zhang, Y., et al. Testing different combinations of acoustic pressure and doses of quinolinic acid to induce focal-neuron loss in mice using transcranial low-intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 45, 129-136 (2018).
- Foster, A. C., Miller, L. P., Oldendorf, W. H., Schwarcz, R. Studies on the disposition of quinolinic acid after intracerebral or systemic administration in the rat. Experimental Neurology. 84, 428-440 (1984).
- Beskid, M., Różycka, Z., Taraszewska, A. Quinolinic acid: effect on the nucleus arcuatus of the hypothalamus in the rat (ultrastructural evidence). Experimental and Toxicologic Pathology. 49, 477-481 (1997).
- Schwarcz, R., Köhler, C. Differential vulnerability of central neurons of the rat to quinolinic acid. Neuroscience Letters. 38, 85-90 (1983).
- Schwarcz, R., Whetsell, W. O., Mangano, R. M. Quinolinic acid: an endogenous metabolite that produces axon-sparing lesions in rat brain. Science. 219, New York, N.Y. 316-318 (1983).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Agari, T., et al. Successful treatment of epilepsy by resection of periventricular nodular heterotopia. Acta Medica Okayama. 66 (6), 487-492 (2012).
- Lee, K. S., et al. A genetic animal model of human neocortical heterotopia associated with seizures. The Journal of Neuroscience. 17 (16), 6236-6242 (1997).
- Schottler, F., Couture, D., Rao, A., Kahn, H., Lee, K. S. Subcortical connections of normotopic and heterotopic neurons in sensory and motor cortices of the tish mutant rat. The Journal of Comparative Neurology. 395 (1), 29-42 (1998).
- Schottler, F., et al. Normotopic and heterotopic cortical representations of mystacial vibrissae in rats with subcortical band heterotopia. Neuroscience. 108 (2), 217-235 (2001).
- Zhang, Y., et al. Effects of non-invasive, targeted, neuronal lesions on seizures in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Ultrasound in Medicine and Biology. 46, 1224-1234 (2020).
- Holmes, E. W. Determination of serum kynurenine and hepatic tryptophan dioxygenase activity by high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 518-525 (1988).
- Shibata, K., Ohno, T., Sano, M., Fukuwatari, T. The urinary ratio of 3-hydroxykynurenine/3-hydroxyanthranilic acid is an index of predicting the adverse effects of D-trytophan in rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminology. 60, 261-268 (2014).
- Aubry, J. -F., Tanter, M. MR-guided transcranial focused ultrasound. Therapeutic Ultrasound. , 97-111 (2016).
- Elias, W. J., et al. A Randomized trial of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 375, 730-739 (2016).
- Ghanouni, P., et al. Transcranial MR-guided focused ultrasound: a review of the technology and neuro applications. American Journal of Roentgenology. 205, 150-159 (2015).
- Martin, E., Jeanmonod, D., Morel, A., Zadicario, E., Werner, B. High-intensity focused ultrasound for noninvasive functional neurosurgery. Annals of Neurology. 66, 858-861 (2009).
- Monteith, S., et al. Transcranial magnetic resonance-guided focused ultrasound for temporal lobe epilepsy: a laboratory feasibility study. Journal of Neurosurgery. 12, 1-8 (2016).
