Summary
Protokolün amacı beyinde non-invaziv nöronal lezyonlar üretmek için bir yöntem sağlamaktır. Yöntem manyetik rezonans güdümlü Odaklı Ultrason kullanır (MRgFUS) geçici ve odak noktası olarak Kan Beyin Bariyeri açmak için, beyin parankim dolaşan bir nörotoksin sunmak için.
Abstract
Cerrahi müdahale tıbbi olarak inatçı nörolojik hastalıkların bazı türleri tedavisinde oldukça etkili olabilir. Bu yaklaşım özellikle tanımlanabilir nöronal devrelerin epilepsi ve hareket bozuklukları gibi önemli bir rol oynadığı bozukluklar için yararlıdır. Şu anda mevcut cerrahi yöntemler, etkili iken, genellikle invaziv bir cerrahi işlem içerir, hangi olmayan hedef dokularda cerrahi yaralanmaya neden olabilir. Sonuç olarak, hem non-invaziv hem de nörotoksik bir teknik içerecek şekilde cerrahi yaklaşımların yelpazesini genişletmek için değerli olacaktır.
Burada beyinde non-invaziv bir şekilde fokal, nöronal lezyonlar üretmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım, kan beyin bariyerini (BBB) geçici ve odaksal olarak açmak için intravenöz mikrokabarcıklarla birlikte düşük yoğunluklu odaklı ultrason uyguluyor. Geçici BBB açılış dönemi daha sonra odaklı hedeflenen bir beyin bölgesine sistematik olarak yönetilen nörotoksin sunmak için istismar edilir. Nörotoksin kinolinik asit (QA) normalde BBB-geçirimsizdir ve intraperitoneal veya intravenöz olarak uygulandığında iyi tolere edilir. Ancak, QA beyin dokusuna doğrudan erişim kazandığında, nöronlar için toksiktir. Bu yöntem belirli beyin bölgelerini hedeflemek için sıçan ve sıçanlarda kullanılmıştır. MRgFUS'tan hemen sonra, BBB'nin başarılı bir şekilde açılması kontrastlı T1 ağırlıklı görüntüleme kullanılarak doğrulanır. İşlemden sonra, T2 görüntüleme beynin hedeflenen alanı ile sınırlı yaralanma gösterir ve hedeflenen alanda nöronların kaybı histolojik teknikler kullanılarak post-mortem doğrulanabilir. Özellikle, QA yerine salin enjekte edilen hayvanlar BBB'nin açılmış olduğunu gösterirler, ancak yaralanma veya nöronal kayıp göstermezler. Bu yöntem, Precise Intracerebral Non-invaziv Güdümlü cerrahi (PING) olarak adlandırılan nöral devre bozuklukları ile ilişkili nörolojik bozuklukların tedavisinde non-invaziv bir yaklaşım sağlayabilir.
Introduction
Bu yöntemin amacı beynin hedeflenen bir bölgede non-invaziv nöronal lezyonlar üretmek için bir araç sağlamaktır. Böyle bir yaklaşım geliştirmek için mantığı nörolojik bozukluklara katkıda nöronal devre kesmek için. Örneğin, cerrahi ilaç dirençli epilepsi (DRE)1gibi bazı tıbbi inatçı nörolojik hastalıkların tedavisinde oldukça etkili olabilir. Ancak, mevcut cerrahi yöntemlerin her biri beyne istenmeyen ikincil hasar üreten açısından sınırlamalar sahip. Geleneksel rezeke cerrahisi kanama riski ile son derece invaziv olabilir, enfeksiyon, kan pıhtıları, inme, nöbetler, beyin şişmesi, ve sinir hasarı2. Minimal invaziv veya non-invaziv rezeke cerrahisi alternatifleri lazer interstisyel termal tedavi ve radyocerrahi, aynı zamanda DRE nöbetleri bastırmada etkili olduğu kanıtlanmıştır içerir. Daha yakın zamanlarda, yüksek yoğunluklu odaklı ultrason (HIFU) tarafından üretilen termal lezyonlar nöbetlerin azaltılmasında umut göstermiştir. HIFU non-invaziv; ancak, tedavi penceresi şu anda kafatası çevresinde bulunan olmayan hedef doku termal yaralanma riski nedeniyle beynin daha merkezi alanları ile sınırlıdır. Bu tür sınırlamalar rağmen, cerrahi yararları genellikle potansiyel riskleri ağır basar. Örneğin, DRE için cerrahi ikincil beyin hasarı üretebilir rağmen, nöbetleri bastırmak ve yaşam kalitesini artırmak yararlı etkileri genellikle cerrahi riskler üzerinde hakim.
Burada açıklanan yöntem, Hassas İntraserebral Non-invaziv Güdümlü cerrahi (PING), nöral devrelerin kesilmesi amacıyla geliştirilmiştir, ikincil beyin hasarı sınırlayıcı iken. Yöntem bbb açmak için mikrokabarcıklar intravenöz enjeksiyon ile birlikte düşük yoğunluklu odaklı ultrason kullanır, bir nörotoksin sunmak için. Bu yaklaşım beyin3termal lezyonlar üretmez3 ,4,5,6,7, ve BBB açılış dönemi beyin parankim BBB geçirimsiz bileşikler sunmak için istismar edilebilir. BBB'nin açılması geçicidir ve manyetik rezonans görüntüleme kılavuzu kullanılarak hedefli bir şekilde üretilebilir. Çalışmalarımızda, BBB açılış dönemi sıçan ve sıçanlarda beyin parankim hedeflenen bir alana dolaşan bir nörotoksin sunmak için kullanılmıştır8,9. Kinolinik asit intravenöz uygulandığında iyi tolere edilen bir nörotoksindir 10, intraarteriyel10, veya intraperitoneally8,9,11. QA toksisite eksikliği ihmal edilebilir olduğu bildirilmiştir onun kötü BBB geçirgenlik nedeniyle10. Buna karşılık, beyin parankim içine QA doğrudan enjeksiyonu komşu aksonları yedek nöronal lezyonlar üretir12,13. Böylece, QA BBB açılması hedeflenen alanda beyin parankim erişim kazançları dolaşan zaman, nöronal ölüm8üretilir,9. Bu nedenle mevcut yöntem, tam hedefli ve non-invaziv bir şekilde fokal nöronal kayıp üretir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Virginia Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktiflerin hazırlanması
- Ameliyat günü, enjekte edilebilir kinolinik asit 6.0 mL hazırlamak (QA). 4.0 mL 1.0 N NaOH'da 450 mg QA çözünür. 0,6 mL 10x PBS, pH 7,4 ekleyin ve 0,22 μm şırınga filtresi ile dH2O. Filtre ile 6,0 mL son hacmine getirmek. Çözelti 4 °C'de 2 hafta stabildir.
- Decaflorobutane gazdan sonda sonication tarafından normal tuzlu mikrokabarcıklar bir sulu dağılım hazırlayın ve DSPC / PEG stearate monolayer kabuk12ile stabilize .
- Normal yerçekiminde yüzdürme ile boyut mikrokabarcıkları. Multisizer III sayacı kullanarak elektrozone algılayarak mikrokabarcık konsantrasyonu ve boyutunu belirleyin. Mikrokabarcık konsantrasyonu ve boyut dağılımı sırasıyla 6 x 108/mL ve ~2 μm (ortalama parçacık çapı) olmalıdır. En büyük kabarcıklar yüzdürme dışlama/ayırma ile kaldırılır.
- Alternatif olarak, ticari olarak kullanılabilir microbubbles satın alın.
2. Hayvanların hazırlanması
- Doğumdan sonra 3 gün boyunca hayvanı (fare veya fare) alıştırın. Burada açıklanan deneylerde Sprague-Dawley sıçanları (5-6 haftalık yaş) veya telensefalik iç yapısal heterotopi (tish) sıçanları (yerel koloni) kullanılmıştır.
- 12 saat ışık altında ev hayvanları: 12 saat karanlık döngüsü.
- Hayvanların ağırlıklarını kaydedin. Bu bilgiler yordam boyunca önemlidir.
- Ameliyat öncesi temel görüntüleri oluşturmak için FUS işleminden bir gün önce T2 ağırlıklı MR görüntüleri alın. T2 görüntüleme için aşağıdaki parametreleri kullanın: tekrarlama süresi/yankı süresi [TR/TE] =3,000/138 milisaniye, 3 ortalama, görüş alanı=29 x 45 mm2, matris boyutu = 125 x 192, dilim kalınlığı = 0,23 mm.
- Isoflurane (%4 indüksiyon, %2 bakım) ile hayvanı anestezi altına alabilirsiniz. Bir parmak tutam kullanarak anestezi yeterli derinliği onaylayın. Gözlere oftalmik merhem uygulayın.
- Hayvanın kafa derisi tıraş ve tüy dökücü krem ile kalan saç çıkarın.
- Mikrokabarcıklar, kontrast madde ve QA infüzyonu için bir kuyruk ven kateter kullanın. Kateterler 30 G x 1/2 inç iğne ile donatılmış PE10 boru uzunluğu oluşur. Hat infüzyonlar için kullanıldığında kaldırılacak ve yeniden dikilecek şekilde, 1 mL'lik bir şırınga yıkın.
3. MR ve PING prosedürleri
- MRG'yi 600 mT/m/ms degrade mukavemeti olan 7 T MR ünitesinde gerçekleştirin (Şekil 1 ve Şekil 2). FUS sistemine dahil olan bir yüzey bobini kullanarak MRI alımlarını gerçekleştirin.
NOT: Deneyler için kullanılan FUS sistemi üç bölümden oluşmaktadır: (i) sonication sistemi MR uyumlu bir ön odaklı, 8 elemanlı anüler dizi, 1.5 MHz transdüser (küresel yarıçap = 20 mm ± 2 mm, aktif çap = 25 mm (f-sayı = 0,8), %80 elektrik-akustik verimliliği ile aşamalı bir dizi ve RF güç amplifikatörüne bağlıdır; (ii) anterior-posterior yönde ve medio-lateral yönde transdüser taşımak için MR uyumlu motorlu konumlandırma aşaması; (iii) odak derinliğini ayarlamak için faz modülasyonu yoluyla elektronik odaklama da dahil olmak üzere sonication teslim kontrol etmek için bir Thermoguide iş istasyonu(Şekil 2). - MR uyumlu FUS sisteminin bobin kızağı montajına(Şekil 1)anestezili hayvanı yatkın konuma yerleştirin. Kızanın beşiğinde bulunan kesici çubuğu ve kulak çubuklarını kullanarak hayvanı hareketsiz hale getirin.
- Su ile ıslanmış kafa derisine akustik jel uygulayın; kabarcıkların bulunmamasını sağlamak, transdüser tertibatının su sirkülasyon kısmının membran bariyerini hayvanın kafatasının üzerine yerleştirin ve transdüser tertibatını kafatası plakasına göre paralel düzlemsel bir yönde mümkün olduğunca düşürün. Dönüştürücünün diyaframını hayvanın traşlı kafa derisine sıkıca bastırın.
- Solunumu izlemek için vücuda cerrahi bantla pnömatik bir sensör takın. Pnömatik sensörü sol alt göğüs kafesinin üzerine yerleştirin.
- FUS kol tertibatını bobin, kızak ve hayvan ile 7T MRI ünitesine taşıyın(Şekil 1).
- Dönüştürücü montajın hayvanın kafasına göre genel fiziksel konumunu belirlemek ve gerektiğinde mekanik ayarlamalar yapmak için bir T2-izci dizisi çalıştırın(Şekil 2). T2 görüntüleme parametreleri şunlardır: tekrarlama süresi/yankı süresi [TR/TE] = 3.000/138 milisaniye, 3 ortalama, görüş alanı = 29 x 45 mm2, matris boyutu = 125 x 192, dilim kalınlığı = 0.23 mm. Termometri genellikle bu protokolde kullanılmaz.
- Transdüser konumlandırmayı hassaslaştırmak için T2 görüntüleri edinin. Tam olarak, transdüser konumunu tanımlayın ve yazılımın hedefleme işlevini kullanarak sonication odak noktasını (lar) belirtin. T2 görüntüleme parametreleri şunlardır: tekrarlama süresi/yankı süresi [TR/TE] = 3.000/138 milisaniye, 3 ortalama, görüş alanı = 29 x 45 mm2, matris boyutu = 125 x 192, dilim kalınlığı = 0.23 mm.
- Sonication hemen önce, kuyruk damarı ile mikrokabarcıklar14 300 μL / kg enjekte.
- Sonications (30 ms dalga paketi, 3% görev döngüsü, 1 Hz patlama tekrarlama frekansı, 240 s süresi / sonication) üretmek için 1,5 MHz dönüştürücü kullanın.
- Sonication hemen sonra, kuyruk damar ı üzerinden gadodiamid kontrast ajan enjekte, ve sonra BBB açılması ve hedefleme doğruluğunu onaylamak için T1 ağırlıklı artı kontrast taramaları gerçekleştirmek. T1 ağırlıklı görüntüleme parametreleri: TR/TE = 900/12 milisaniye, 2 ortalama, görüş alanı = 24 x 30 mm2, matris boyutu = 208 x 256, dilim kalınlığı = 0,7 mm. Genellikle, tek bir T1 tcan gerçekleştirilir.
- FUS kolunu ve kızağı MRG'den çıkarın ve hayvanı %2 izofluran anestezisini korurken 40 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığına yerleştirin.
- Sonication sonra 30 dakika başlayarak, 225 mg / kg (q.s. için 1.0 mL tuzlu nihai bir doz elde etmek için 16.8 μL/dk bir oranda 1 saat kuyruk damarı ile QA (75 mg / mL stok çözeltisi) aşılamak için bir şırınga pompası kullanın.
- İnfüzyon tamamlandığında, anesteziyi durdurun, uyarı kadar bir ısıtma yastığı üzerinde hayvan tutarak. Bir kafese hayvan yerleştirin ve işlemden sonra birkaç saat boyunca, her 15 dakikada bir aktivitesi için rutin kontroller yapmak.
- Canlı hayvan dönün ve sıkıntı veya düzensiz aktivite için ilk gün için her 6 saat kontrol edin.
- Bir gün post-sonication, sonication alanında herhangi bir zarar değerlendirmek için T2 ağırlıklı MR görüntüleme gerçekleştirin. T2 görüntüleme parametreleri: tekrarlama süresi/yankı süresi [TR/TE] = 3.000/138 milisaniye, 3 ortalama, görüş alanı = 29 x 45 mm2, matris boyutu = 125 x 192, dilim kalınlığı = 0.23 mm. Olası doku hasarı/ödemini belirlemek için hiperyoğunluk lu bölgeler için görüntüler değerlendirilir.
4. Nöronal kaybın post-mortem analizi
- Floro-Yeşim histokimyası ile nöronal kaybı değerlendirmek için 4-5 günlük bir post-sonication, sağkalım süresine izin verin.
- Hayvanı izofluran ile derinlemesine anestezi edin ve 0,1 M fosfat tamponu (pH 7.4) ile intrakardiyal perfüzyon yoluyla ötenazi ve ardından fosfat tamponundaki %4 paraformaldehit.
- Kafatası ndan beyin çıkarın ve post-fix için 2 gün boyunca% 4 paraformaldehit.
- Kriyokoruma için beyni %30 sakaroza batırın ve kriyostat ile 20-30 μm kalınlığında kesin.
- Jelatinize slaytlar üzerine Mount cryostat bölümleri ve hava-kuru gecede.
- Distile suda rehydrate slaytlar, ve sonra artan dereceli etanollerde dehydrate. Dehidratasyon sonra, azalan dereceli etanollerde slaytlar rehydrate.
- Orbital shaker üzerinde 15 dakika boyunca %0.06 potasyum permanganat çözeltisine aktarın.
- Distile suda 1 dk kaydırakları durulayın ve %0,1 asetik asitle Floro-Yeşim B'nin %0,001 çözeltisine aktarın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nazik ajitasyon altında kuluçka. Distile suda 1 dakika boyunca üç kez durulayın.
- Slaytları bir slayt ısıtıcısında kurulayın, ksilenes'te 3 dakika boyunca dengeleyin ve DPX montaj ortamını kullanarak kapak kaydırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölümde PING'in neokortikal displazide bulunan nöronlar üzerindeki etkisi açıklanmaktadır. Doku displazisi ilaca dirençli epilepsi hastalarının beyinlerinde sık görülen bir özelliktir ve nöbet-jenik displazilerin cerrahi olarak çıkarılması nöbetlerin mükemmel kontrolünü sağlayabilir15. Bu nedenle PING'in displastik beyin dokusu üzerindeki etkisinin tanımlanması önemli bir önceliktir. Genetik kortikal displazi bir sıçan modeli, tish sıçan, tish beyin normalde konumlandırılmış neokorteks altında bulunan displastik doku sergiler çünkü bu sorunu incelemek için seçildi(Şekil 3)16. Hem displazi ve örten neokorteks fonksiyonel ve karakteristik neokortikal bağlantı sergileyen nöronlar içerir17,18.
Tish sıçan beyninin heterotopisini hedefleyen PING, displastik nöronların fokal nöronal kaybının üretilmesinde etkili oldu(Şekil 3). T2 ağırlıklı görüntüler bir gün ping sonrası hiperyoğunluk sergi alanları alınan, sonication hedeflenen alanlarda doku hasarı ile tutarlı. 5 günlük ping sonrası sağkalım döneminden sonra Fluoro-Jade kullanılarak yapılan post-mortem boyama, T2-hiperyoğunluk alanlarında dejeneratif nöronlar göstererek PING'in hedeflenen displastik neokortikal dokuda nöronal kayıp üretme yeteneğini doğruladı.
Şekil 1: Manyetik rezonans (MR) uyumlu kızak ve 7T MR mıknatıs. Hayvanı MR mıknatısına yerlendirmek ve sonication sağlamak için kullanılan kızalık temel özellikleri tasvir edilmiştir (A). Kızak montajı 7T MR mıknatısı(B)içine takılı olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Manyetik Rezonans (MR) görüntüleme ve MR güdümlü Odaklı Ultrason (FUS) için kontrol odası. Kontrol odası iki ana istasyondan oluşmaktadır. Araştırmacının oturduğu istasyon FUS(A)hedeflemesi için planlama alanıdır. İkinci istasyon MRI sistemi için kontrol alanıdır (B). MR i istasyonuarkasındaki bakır takviyeli pencere 7T mıknatıs ı barındıran odaya bakar. FUS istasyonundaki monitör, sonication(C)kılavuzve parametrelerini kontrol eden yazılımı görüntüler. Bu örnek, T2 ağırlıklı MR görüntüsüne(D)yerleştirilmiş striatumu hedefleyen bir sonication gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PING tish sıçan beyninin displastik neokorteks nöronal kayıp üretir. Ping'den bir gün sonra T2 ağırlıklı MR görüntüleri(A,B)alındı. Neokorteks [N], heterotopya [H], ve lateral ventriküller [LV] oryantasyon amacıyla etiketlenir (A). Hiperyoğunluk alanları [beyaz ve sarı oklar], doku hasarı göstergesi, beynin her iki tarafında heterotopya hedeflenen alanlarda görülebilir(B). Floro-Yeşim(C-F)ile post-mortem boyama. Beynin sol(C,E; beyaz oklar) ve sağ(D,F; sarı oklar) yanlarında hiperyoğunluk alanlarına karşılık gelen bölgelerde dejeneratif nöronları temsil eden parlak yeşil hücreler gözlenir. Ölçek çubukları: C,D = 1 mm; E,F = 0,5 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PING yöntemi non-invaziv, hedefli nöronal lezyonlar üretmek için tasarlanmıştır. Yöntem odaklı ultrason alanında araştırma güçlü ve büyüyen temeltinden türetilmiştir3,4,5,6,7. BBB geçici açılış yoluyla beyin parankim belirli alanlara odak erişim sağlamak için yeteneği normalde beyne erişim elde olmaz ajanların geniş bir yelpazede teslim etmek için bir cadde yarattı. Bu fırsat büyük ölçüde kötü BBB geçirgenliği olan terapötik ajanların merkezi teslimat için gelişmiş ediliyor. PING yöntemi nörolojik disfonksiyonkatkıda devreleri yok nihai hedefi ile, bir nörotoksin sunarak farklı bir şekilde aynı fırsatı yararlanır. Anormal nöral devre bazı nörolojik bozuklukların etkisini zayıflatmak için cerrahi müdahale için etkili bir hedef temsileder 2,15. PING yönteminin uzun vadeli hedefi, nöral disfonksiyona katkıda bulunan devrelerin kesilmesi için mevcut yaklaşımları artırmaktır.
PING yöntemini kullanarak kapsamlı bir çalışmanın tasarımı birden fazla kontrol gruplarını içerir. Bu gruplar şunlardır: (a) işlenmemiş bir grup [No FUS/No QA]; (b) FUS [FUS/No QA] doğrudan etkilerini kontrol eden bir grup; (c) FUS [Fus/QA yok] yokluğunda sistemik nörotoksinin doğrudan etkilerini değerlendiren bir grup. Bu gruplardaki sonuçlar birincil PING grubu [FUS/QA] ile karşılaştırılacak.
PING yöntemi küçük hayvanların kullanımı için temel beceriler gerektirir. Bunlar arasında anestezinin indüksiyonu ve bakımı, kuyruk damar hattının yerleştirilmesi, MRI ünitesinin ayarında birden fazla ajanın intravenöz uygulaması, bir ilacın intravenöz infüzyonu ve ameliyat sonrası dönemlerde hayvan bakımı sayılabilir. Ayrıca intrakardiyal perfüzyon, doku kesiti, histokimyasal boyama ve mikroskobik analizler yapabilmek için de gereklidir. Bir Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi veya eşdeğer ajansı, kurumsal eğitim ve onay, protokoldeki adımların birkaçı için gereklidir.
PING prosedürü için ilk protokol birden fazlagün8,9üzerinde QA tekrarlayan intraperitoneal enjeksiyon kullanılmıştır. Bu yaklaşım hala uygulanabilir ve etkilidir. Ancak, mevcut protokol QA yönetiminin rotasını ve hızını değiştirdi. Özellikle, QA infüzyon 1 saat sonrası-sonication döneminde intravenöz uygulandı. Yine, her iki yönetim protokolü etkilidir. Mevcut protokolde kullanılan 4-5 günlük sağkalım süresi dejeneratif nöronları tespit etmek için Floro-Yeşim yönteminin kullanımını optimize etmek için kabul edilmiştir. Daha uzun sağkalım süreleri gerekiyorsa, alternatif doku boyama yöntemleri belirtilir. Böyle bir yaklaşım nöron spesifik bir antikor kullanmak olacaktır (örneğin, anti-NeuN), immünohistochemically nerede hayatta nöronlar uzun bir post-sonication sağkalım döneminden sonra kaldı göstermek için. Mevcut yapısal analizlere ek olarak çeşitli sonuçlar da yararlı olacaktır. Örneğin, elektrofizyolojik ve davranışsal sonuçların PING sonrası değerlendirmeleri PING yönteminin etkisinin karakterizasyonunu önemli ölçüde ilerletecektir.
FUS prosedürlerinin olası komplikasyonlarından biri, özellikle kafatasının yakınında bulunan kortikal bölgeleri hedef alırken sıcaklıkların kafatası çevresinde yükselmiş olmasıdır. Bu komplikasyon şu anda yüksek yoğunluklu FUS (HIFU) kullanarak termal lezyon için uygun sitelerin aralığı (tedavi zarfı) kısıtlar. PING bağlamında, kafatası yakınında termal artışlar da tekniğin bir sınırlama temsil edebilir. Ancak, PING ile kullanılan sonication düşük yoğunluğu termal yaralanma riskini azaltır, ve HIFU ile karşılaştırıldığında tedavi zarfı genişletmek gerekir.
PING yöntemi, hem altyapı yoğun hem de eğitim yoğun olan çeşitli özelliklere sahiptir. MR-uyumlu FUS ekipmanı ve hayvan araştırmaları için donatılmış mr i tesisi gereklidir. Bu, gerekli araştırma altyapısını sağlamak için önemli bir ön uç yatırımını temsil eder. Ancak, FUS teknolojisi ile donatılmış sitelerin sayısının hem araştırma hem de klinik çabalar için hızla genişlediğini belirtmek cesaret vericidir. Böylece, bu tür işleri gerçekleştirmek için mevcut sitelerin sayısı arttıkça, yerinde ve/veya işbirlikçi araştırma fırsatları artacaktır. Eğitim açısından, FUS çalışmalarını üstlenmek isteyen herhangi bir araştırmacı FUS deney deneyimli bir araştırma grubu tarafından eğitim yararlanacaktır. Örneğin, MRgFUS hedefleme yazılımı, nispeten basit olsa da, deneyimli bir araştırmacı tarafından tavsiye edildiğinde daha kolay elde edilir.
Rahatsız nöronal devrelerin çıkarılmasında çoklu, alternatif cerrahi yöntemler mevcuttur. Bunlar arasında rezeksiyon cerrahisi, stereotaktik lazer ablasyon, radyocerrahi, yüksek yoğunluklu odaklı ultrason ve radyofrekans tedavisi sayılabilir. Bu yaklaşımların her biri etkili dir ve bazı tıbbi olarak inatçı bozukluklar için önemli terapötik değeri olabilir. Ancak, bu cerrahi yöntemler bir veya daha fazla özel sınırlamalara sahiptir: (a) invaziv prosedür, (b) hedef doku üzerindeki pannekrotik etkisi, (c) bitişik, hedef olmayan dokuda hasar (örn. geçiş aksonları) ve (d) etkili sonuçlarelde etmede gecikme. PING yönteminin önemli avantajları şudur: (a) non-invaziv, (b) pannekrotik değildir, (c) komşu hedef olmayan doku üzerindeki etkileri sınırlar ve (d) hızlı sonuçlar vermelidir.
PING yöntemi için hem klinik hem de klinik uygulamalar da dahil olmak üzere birçok potansiyel gelecekteki yön vardır. Hayvan deneyi ile ilgili olarak, yöntem nörolojik hastalığın preklinik modellerinde fokal nöronal lezyonlar üretmek için bir araç sağlar. Örneğin, son zamanlarda limbik epilepsi bir kemirgen modeliping etkisini test etmek için bu yaklaşımı kullandık19. PING ile tedavi limbik epilepsi bir pilocarpine modelinde kronik, spontan nöbetlerin sıklığını azalttı. Bu çalışma, bir nörolojik bozukluk tedavisinde PING programı için kavramın ilk, preklinik kanıt sağladı.
Quinolinic asit ping prosedürü için iki temel nedenden dolayı seçildi. İlk olarak, mevcut literatür11 nöronal hücre lisi lezyonlarının diğer hedef olmayan dokuları, örneğin aksonlar gibi keseleri ayrışırken üretilebileni göstermektedir. İkincisi, QA doğrudan beyne teslim edildiğinde bir nörotoksik olmasına rağmen, iyi BBB ile sınırlı geçirgenliği nedeniyle sistemsel olarak uygulandığında tolere edilir. Monosodyum glutamat (MSG) gibi periferik olarak iyi tolere edilen diğer toksinler QA için alternatif olarak düşünülebilir. MSG önemli bir avantajı insanlar tarafından bu bileşiğin kullanımı ile ilgili önemli bir literatür var olacaktır. Gelecekteki araştırmalar için önemli bir hedef, QA veya diğer sistematik olarak uygulanan nörotoksinler tarafından üretilen yaralanmanın özgüllüğünü potansiyel hücre tipi özgüllük açısından tanımlamak olacaktır. Bu genel yaklaşım için başka bir potansiyel preklinik uygulama beyin parankim diğer hücre tipleri için toksik bir periferik tolere bileşik yönetmek olacaktır, glial hücreler gibi. Örneğin, oligodendroglia etkileyen bir toksin periferik enjeksiyon beyaz madde bir alanda fokal demiyelinasyon izin verebilir. Bu, hedeflenen yolun bir kısmının hedefli demiyelininin yok edilmesine olanak sağlayacaktır. Ayrıca, bu yaklaşım, nükseden multipl sklerozun nüksetme-geri alma özelliği olan aynı sitenin seri demyelination değerlendirmelerine olanak sağlayabilir.
İnsanlarda PING'in gelecekteki olası uygulamaları ile ilgili olarak, rahatsız nöral devrelerin hedef olduğu nörolojik bozukluklar PING ile tedaviye uygun olabilir. İlk preklinik bulgularımıza dayanarak19, İlaç Dirençli Epilepsi (DRE) PING yararlanabilir bir bozukluk umut verici bir örnektir. DRE cerrahi tedavi son derece yararlı olabilir, ama aslında önemli bir nörolojik bozukluk için etkili olan en az kullanılan tedavilerden biri olmaya devam etmektedir. Bu ayarda PING'in bir avantajı, hedef alanın hacminin birden fazla sitede seri sonications kullanılarak konformal ve büyütülebilir olmasıdır. Bu beyin parankim düzensiz şekilli ve düzensiz büyüklükteki hedeflerin daha kesin hedefleme sağlayacak. PING için çeviri süreci mutlaka insan olmayan primatlarda QA sistemik yönetiminin güvenliği için test içerecektir, ve sonuçta insanlarda. Kynurenine metabolitleri genellikle böbrekler aracılığıyla kantemizlenir ve idrara çıkma yoluyla ortadan kaldırılır20,21; ancak, enjekte qa kaderi bu modelde değerlendirilmemiştir. Bununla birlikte, bu bağlamda sistemik olarak yönetilen QA yüksek düzeyde iyi kemirgenler tolere olduğunu belirtmek önemlidir. Daha da önemlisi, PING kullanımı Bakım Standardı tedavi engel olmaz. Belirli bir hastada etkisiz olduğunu kanıtlamak için tek veya birden fazla PING tedavileri olsaydı, rezeksiyon veya ablatif cerrahi gibi diğer prosedürler, uygun seçenekler olmaya devam edecekti. Ping'in ortaya çıkacağı klinik ortamın çeviri ve uygulama için ideal olarak hazır olduğunu kabul etmek de önemlidir22,23,24,25,26. Yapısal ve fonksiyonel görüntüleme yöntemleri hızla daha rafine hale gelmektedir, hangi daha iyi hassas müdahaleler için uygun hedef (ler) belirlenmesi için izin verecektir. Ayrıca, tasarım, inşaat veya PING için yeni bir tıbbi cihazın onayı için gerek yoktur. MR güdümlü, yüksek yoğunluklu FUS zaten nörolojik uygulamalar da dahil olmak üzere birden fazla endikasyon için kurulmuş ve onaylanmış bir yöntemdir. Ve, daha önce de belirtildiği gibi, son yıllarda FUS klinik kullanımda olan sitelerin çoğalmasına tanık olduk. Birlikte, bu avantajlar birden fazla uygulama için PING için umut verici bir geliştirme kursu öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar MRI alanında yaptığı mükemmel teknik destek için Rene Jack Roy tanımak. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 NS102194'den KSL'ye ve R01 CA217953-01'den MW'ye), Chester Fonu (KSL) ve Odaklanmış Ultrason Vakfı (KSL ve JW) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T-ClinScan MRI System | Bruker Biospin, Ettinglen, Germany | MR Image Acquisition | |
| Acoustic Gel | Litho CLEAR | 11-601 | High Viscosity Accoustic Transmission Gel |
| DPX Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 13512 | Resin Based Cover Glass Mountant |
| Fluoro-Jade B | EDM Millipore | AG310 | High Affinity Stain For Degenerating Neurons |
| Fluovac anesthetic adsorber | Harvard Apparatus | 34-0388 | Organic Anaesthesia Scavenger |
| FUS System | Image Guided Therapy, Pessac, France | LabFUS | MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System |
| Gadodiamide | GE Healthcare AS, Oslo, Norway | Omniscan | MR Contrast Agent |
| Heparin | SAGENT | NDC2502140010 | Anti-Coagulant |
| Hypodermic needle 30G x 1/2 | Becton-Dickinson | 26027 | Tail Vein Catheterization |
| Insulin syringe 28G1/2 (1ml) | EXEL | 26027 | Administration of Injectables to Tail Vein Catheter |
| Isofluorane atomizer | SurgiVet | VCT302 | Anaesthesia Administration |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC1169567762 | Anaesthesia |
| KMnO4 | Sigma | 223468 | Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining |
| Microbubbles | Produced internally: A. Klibanov | 305106 | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Microbubbles (commercial source) | Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA | Definity microbubbles | Blood Brain Barrier Disrupting Agent |
| Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments | Model 1030 | Respiration Monitoring |
| Multisizer 3 Coulter counter | Beckman-Coulter, Hialeah, FL | Multisizer 3 | Used to Determine Average Size of Microbubbles |
| Optixcare EYE LUBE | CLC MEDICA, Ontario, Canada | 11611 | Corneal Protectant-Eye Lube |
| PE10 tubing | Becton-Dickinson | 427401 | Tail Vein Catheter Component |
| Quinolinic Acid | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | CAS 89-00-9 | Neurotoxin |
| Sprague-Dawley Rats | Taconic Biosciences | SD-M | Rat Model |
| Syringe Pump | Carnegie Medicin | CMA 100 | Controlled Delivery of Quinolinic Acid |
| Thermoguide Software | Image Guided Therapy, Pessac, France | Thermoguide | Drives Lab FUS System |
| Tish Rats | In-house colony | Rat Model | |
| Veet depilatory cream | Reckitt Benckiser | Removal of Scalp Hair |
References
- Wiebe, S., Eliasziw, M., Matijevic, S. I. Changes in quality of life in epilepsy: How large must they be to be real. Epilepsia. 42, 113-118 (2001).
- McClelland, S., Guo, H., Okuyemi, K. S. Population-based analysis of morbidity and mortality following surgery for intractable temporal lobe epilepsy in the United States. Archives of Neurology. 68, 725-729 (2011).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhotseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: histological findings in rabbits. Ultrasound in Medicine & Biology. 31, 1527-1537 (2005).
- Park, J., Zhang, Y., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A., McDannold, N. J. The kinetics of blood brain barrier permeability and targeted doxorubicin delivery into brain induced by focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 162 (1), 134-142 (2012).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in the presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30, 979-989 (2004).
- Vlachos, F., Tung, Y. S., Konofagou, E. E. Permeability assessment of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using dynamic contrast-enhanced MRI. Physics in Medicine and Biology. 55 (18), 5451-5466 (2010).
- Zhang, Y., et al. focal disconnection of brain circuitry using magnetic resonance-guided low-intensity focused ultrasound to deliver a Neurotoxin. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (9), 2261-2269 (2016).
- Zhang, Y., et al. Testing different combinations of acoustic pressure and doses of quinolinic acid to induce focal-neuron loss in mice using transcranial low-intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 45, 129-136 (2018).
- Foster, A. C., Miller, L. P., Oldendorf, W. H., Schwarcz, R. Studies on the disposition of quinolinic acid after intracerebral or systemic administration in the rat. Experimental Neurology. 84, 428-440 (1984).
- Beskid, M., Różycka, Z., Taraszewska, A. Quinolinic acid: effect on the nucleus arcuatus of the hypothalamus in the rat (ultrastructural evidence). Experimental and Toxicologic Pathology. 49, 477-481 (1997).
- Schwarcz, R., Köhler, C. Differential vulnerability of central neurons of the rat to quinolinic acid. Neuroscience Letters. 38, 85-90 (1983).
- Schwarcz, R., Whetsell, W. O., Mangano, R. M. Quinolinic acid: an endogenous metabolite that produces axon-sparing lesions in rat brain. Science. 219, New York, N.Y. 316-318 (1983).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Agari, T., et al. Successful treatment of epilepsy by resection of periventricular nodular heterotopia. Acta Medica Okayama. 66 (6), 487-492 (2012).
- Lee, K. S., et al. A genetic animal model of human neocortical heterotopia associated with seizures. The Journal of Neuroscience. 17 (16), 6236-6242 (1997).
- Schottler, F., Couture, D., Rao, A., Kahn, H., Lee, K. S. Subcortical connections of normotopic and heterotopic neurons in sensory and motor cortices of the tish mutant rat. The Journal of Comparative Neurology. 395 (1), 29-42 (1998).
- Schottler, F., et al. Normotopic and heterotopic cortical representations of mystacial vibrissae in rats with subcortical band heterotopia. Neuroscience. 108 (2), 217-235 (2001).
- Zhang, Y., et al. Effects of non-invasive, targeted, neuronal lesions on seizures in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Ultrasound in Medicine and Biology. 46, 1224-1234 (2020).
- Holmes, E. W. Determination of serum kynurenine and hepatic tryptophan dioxygenase activity by high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 518-525 (1988).
- Shibata, K., Ohno, T., Sano, M., Fukuwatari, T. The urinary ratio of 3-hydroxykynurenine/3-hydroxyanthranilic acid is an index of predicting the adverse effects of D-trytophan in rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminology. 60, 261-268 (2014).
- Aubry, J. -F., Tanter, M. MR-guided transcranial focused ultrasound. Therapeutic Ultrasound. , 97-111 (2016).
- Elias, W. J., et al. A Randomized trial of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 375, 730-739 (2016).
- Ghanouni, P., et al. Transcranial MR-guided focused ultrasound: a review of the technology and neuro applications. American Journal of Roentgenology. 205, 150-159 (2015).
- Martin, E., Jeanmonod, D., Morel, A., Zadicario, E., Werner, B. High-intensity focused ultrasound for noninvasive functional neurosurgery. Annals of Neurology. 66, 858-861 (2009).
- Monteith, S., et al. Transcranial magnetic resonance-guided focused ultrasound for temporal lobe epilepsy: a laboratory feasibility study. Journal of Neurosurgery. 12, 1-8 (2016).
