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Summary

Este protocolo describe tres pasos para preparar los lóbulos ópticos de larvas y adultos de Drosophila para la obtención de imágenes: 1) disecciones cerebrales, 2) inmunohistoquímica y 3) montaje. Se hace hincapié en el paso 3, ya que se requieren distintas orientaciones de montaje para visualizar estructuras específicas de lóbulos ópticos.

Abstract

El lóbulo óptico de Drosophila , compuesto por cuatro neuropilas: la lámina, la médula, la lóbula y la placa de lóbula, es un excelente sistema modelo para explorar los mecanismos de desarrollo que generan la diversidad neuronal e impulsan el ensamblaje de circuitos. Dada su compleja organización tridimensional, el análisis del lóbulo óptico requiere que se comprenda cómo se colocan sus neurópilos adultos y sus progenitores larvarios en relación con el cerebro central. Aquí, describimos un protocolo para la disección, inmunotinción y montaje de cerebros de larvas y adultos para la obtención de imágenes del lóbulo óptico. Se hace especial hincapié en la relación entre la orientación del montaje y la organización espacial del lóbulo óptico. Describimos tres estrategias de montaje en la larva (anterior, posterior y lateral) y tres en el adulto (anterior, posterior y horizontal), cada una de las cuales proporciona un ángulo de imagen ideal para una estructura de lóbulo óptico distinta.

Introduction

El sistema visual de Drosophila, compuesto por el ojo compuesto y el lóbulo óptico subyacente, ha sido un excelente modelo para el estudio del desarrollo y la función de los circuitos neuronales. En los últimos años, el lóbulo óptico en particular ha surgido como un poderoso sistema en el que estudiar los procesos del neurodesarrollo como la neurogénesis y el cableado de circuitos 1,2,3,4,5,6,7,8. Está formado por cuatro neurópilas: la lámina, la médula, la lóbula y la placa de lóbula (estas dos últimas forman parte del complejo lóbula)1,2,3,4,5,6. Los fotorreceptores del ojo, se dirigen a las neuronas de la lámina y la médula, que procesan las entradas visuales y las transmiten a los neuropilos del complejo lóbulo 1,2,3,4,5,6. Las neuronas de proyección en el complejo lóbulo envían posteriormente información visual a los centros de procesamiento de orden superior en el cerebro central ^1,5,9. La compleja organización del lóbulo óptico, necesaria para mantener la retinotopía y procesar diferentes tipos de estímulos visuales, lo convierte en un sistema atractivo para estudiar cómo se ensamblan circuitos neuronales sofisticados. En particular, la médula comparte sorprendentes similitudes tanto en su organización como en su desarrollo con la neurorretina, que ha sido durante mucho tiempo un modelo para el desarrollo de circuitos neuronales de vertebrados ^3,8.

El desarrollo del lóbulo óptico comienza durante la embriogénesis, con la especificación de ~ 35 células ectodérmicas que forman la placa óptica 2,4,5,6,7,8. Después de la eclosión de las larvas, la placa óptica se subdivide en dos primodios distintos: 1) el centro de proliferación externa (OPC), que genera las neuronas de la lámina y la médula externa y 2) el centro de proliferación interna (IPC), que genera neuronas del complejo de médula y lóbula^interna 4,5,6,10 . En la larva de segundo estadio tardío, las células neuroepiteliales de OPC e IPC comienzan a transformarse en neuroblastos que posteriormente generan neuronas a través de células madre ganglionares intermedias 4,5,11,12. Los neuroblastos del lóbulo óptico están modelados por factores de transcripción restringidos espacial y temporalmente, que actúan juntos para generar diversidad neuronal en su progenie 11,12,13,14. En la pupa, los circuitos de los neuropilos del lóbulo óptico se ensamblan a través de la coordinación de varios procesos, incluida la muerte celular programada ^11,15, la migración neuronal^12,16, la orientación axonal/dendrítica^10,17, la formación de sinapsis^18,19 y las rotaciones de neuropilas^10,17.

Aquí, describimos la metodología por la cual los cerebros de larvas y adultos son diseccionados, inmunoteñidos y montados para obtener imágenes del lóbulo óptico. Dada su compleja organización tridimensional, el análisis del lóbulo óptico requiere que se comprenda cómo se colocan sus neurópilos adultos y sus progenitores larvarios en relación con el cerebro central. Por lo tanto, ponemos especial énfasis en cómo la orientación del montaje se relaciona con la organización espacial de las estructuras de los lóbulos ópticos. Describimos tres estrategias de montaje para cerebros de larvas (anterior, posterior y lateral) y tres para cerebros adultos (anterior, posterior y horizontal), cada una de las cuales proporciona un ángulo óptimo para obtener imágenes de una población específica de progenitores del lóbulo óptico o neuropilo.

Protocol

1. Preparación de cerebros de larvas para la obtención de imágenes confocales

1. Disecciones
   NOTA: Antes de comenzar la disección, prepare las soluciones fijas (4% de formaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) y PBT (0.1-0.3% de Triton en PBS). La solución fija debe colocarse sobre hielo durante la disección. Aunque en este protocolo se utiliza un fijador de paraformaldehído (PFA), se han descrito estrategias de fijación alternativas (utilizando PLP²⁰ o PEM²¹) para epítopos específicos. Para las disecciones de larvas, se necesitan dos pares de pinzas (Dumont #5 o #55s). Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles.
   1. Comience llenando cada pocillo de la placa de disección con 400 μL de 1x PBS. Use un par de pinzas para recoger suavemente las larvas errantes del tercer estadio que se arrastran por el interior del vial. Coloque las larvas en el primer pocillo del plato lleno de PBS.
   2. Tome una larva y transfiérala al pozo del medio. Con la mano no dominante, sostenga el cuerpo de la larva en la base del pozo.
   3. Con la mano dominante, agarre suavemente el gancho de la boca de la larva y aléjelo del cuerpo. El cerebro de la larva debe estar unido al gancho bucal y a otro tejido accesorio y se desprenderá a medida que se retire el tejido.
   4. Retire los discos imaginales accesorios y transfiera el cerebro de la larva al tercer pocillo de la placa de disección. Los discos imaginales son tejidos epiteliales que rodean el cerebro de las larvas, que generan estructuras adultas como las antenas, los ojos, las patas y las alas²⁰. Si se dejan en el tejido, los discos imaginales pueden obstruir la inmunotinción adecuada del cerebro de las larvas.
      1. Para extraer los discos imaginales, use un par de pinzas para agarrar firmemente el cerebro a través del cordón nervioso ventral. Con otro par de pinzas, retire suavemente los discos.
      2. Retire el disco ocular con cuidado, ya que se envuelve sobre la superficie de los lóbulos cerebrales. Para extraer el disco ocular, use un par de pinzas para sostener el cerebro contra la base del plato. En lugar de sostener el cerebro a través del cordón nervioso ventral, use las pinzas para agarrar ligeramente el lóbulo del cerebro teniendo cuidado de no apretar el lóbulo. Con otro par de pinzas, retire suavemente el disco ocular.
         NOTA: El disco imaginal del ojo eventualmente dará lugar a los fotorreceptores de la retina. Para aquellos interesados en estudiar la conectividad neuronal entre la retina y el lóbulo óptico, el disco ocular se puede dejar en el cerebro. Sin embargo, para aquellos interesados únicamente en las estructuras del lóbulo óptico, se recomienda extirpar el disco ocular, ya que puede dificultar la calidad de la imagen debido a su ubicación en la superficie del cerebro.
   5. Repita los pasos 1.1.2-1.4 hasta que se haya recogido un número suficiente de cerebros (o hayan transcurrido 30 minutos de tiempo de disección). Las disecciones no deben durar más de 30 minutos para garantizar que la integridad del tejido no se vea comprometida.
   6. Una vez finalizado el período de disección, utilice una pipeta P200 para retirar con cuidado el PBS del tercer pocillo. Asegúrese de que quede un pequeño volumen de líquido en el pozo para mantener los cerebros sumergidos.
      NOTA: Es crucial mantener el cerebro sumergido en líquido en todos los puntos del protocolo. Si el tejido se seca, la calidad de la tinción puede verse comprometida por la autofluorescencia no deseada en la imagen confocal.
   7. Agregue 500 μL de la solución de solución fría en el tercer pocillo. Use un par de pinzas para revolver el líquido suavemente, permitiendo que los cerebros se arremolinen en el plato. Cubra el plato con un portaobjetos de vidrio y colóquelo sobre hielo durante 30 minutos para permitir la fijación del tejido.
   8. Retire la solución de fijación y lave los sesos con 400 μL de PBT, 5 veces.
      NOTA: Triton es un detergente en PBT que evita que los cerebros se peguen entre sí o al plato, y prepara el tejido para una penetración óptima de los anticuerpos.
2. Inmunohistoquímica
   NOTA: Hay varios anticuerpos primarios disponibles en el Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DSHB) que se pueden usar para marcar estructuras específicas del lóbulo óptico o tipos de células. DE-Cadherin marca el neuroepitelio IPC y OPC, Bruchpilot (Brp) marca el neuropilo en desarrollo y Dachshund etiqueta las neuronas de la lámina y la lóbula (así como un pequeño subconjunto de neuronas de médula). Además, Elav se puede utilizar para etiquetar neuronas, Prospero para marcar células madre ganglionares y Repo para identificar la glía.
   1. Prepare la solución de anticuerpos primarios añadiendo anticuerpos contra el PBT hasta un volumen total de 100 μL. Se puede utilizar un agente bloqueante (10% de suero normal de cabra) para evitar la unión inespecífica entre el anticuerpo primario y el tejido 20,22,23. Los anticuerpos utilizados en este protocolo marcan específicamente el tejido cerebral sin necesidad de agentes bloqueantes.
   2. Retire el lavado final posterior a la fijación y agregue la solución de anticuerpos primarios. Asegúrese de que solo haya una pequeña cantidad de PBT en el pocillo antes de agregar la solución de anticuerpos. Después de agregar la solución, revuelva suavemente los sesos con pinzas de 5 a 10 veces. Cubrir con un portaobjetos de vidrio, sellar con film de laboratorio e incubar a 4 °C durante la noche.
      1. Alternativamente, si se dispone de un agitador orbital refrigerado, coloque el plato en el agitador para optimizar la incubación durante la noche.
         NOTA: La incubación primaria de anticuerpos y todos los pasos posteriores se pueden realizar alternativamente en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. El volumen de incubaciones primarias y secundarias puede permanecer en 100 μL, pero los pasos de lavado deben realizarse con 800 μL o más de PBT.
   3. Después de la incubación, lave los anticuerpos primarios con PBT como en el paso 1.1.8 de la sección anterior.
      NOTA: La solución de anticuerpos primarios debe guardarse y almacenarse a 4 °C, ya que puede reutilizarse para experimentos posteriores. Muchos anticuerpos primarios se pueden reutilizar hasta cuatro veces.
   4. Agregue 400 μL de PBT a los cerebros para un lavado final. Cubra el plato con un portaobjetos, selle con film de laboratorio y colóquelo en un agitador orbital a baja velocidad (100 rpm) y temperatura ambiente (RT) durante ~4 h.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los sesos se pueden dejar lavar durante 2-3 días a 4 °C.
   5. Prepare la solución de anticuerpos secundarios en un volumen total de 100 μL.
      NOTA: En este protocolo, todos los anticuerpos secundarios se utilizan a una dilución de 1:500, sin agentes bloqueantes.
   6. Retire el lavado de PBT del pocillo y agregue la solución de anticuerpos secundarios. Mezcle el tejido en la solución con un par de pinzas. Cubra el plato con un portaobjetos y una película de laboratorio. Coloque el plato en un agitador orbital a RT durante un período de incubación mínimo de 2 h. Dado que los anticuerpos secundarios contienen fluoróforos sensibles a la luz, cubra el plato con papel de aluminio.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los cerebros pueden dejarse en una solución secundaria de anticuerpos durante la noche a 4 °C.
   7. Lave los anticuerpos secundarios como se describe en el paso 1.2.3. Agregue 400 μL de PBT a los cerebros para un lavado final. Cubra el plato con un portaobjetos, selle con film de laboratorio y papel de aluminio. Coloque los cerebros en una coctelera a RT durante 4 h.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los sesos se pueden dejar lavar durante 2-3 días a 4 °C.
3. Montura
   1. Retire el lavado final de PBT y reemplácelo con dos gotas de medios de montaje seguros para fluorescencia. Coloque una gota del medio de montaje en el centro de una guía.
   2. Transfiera los cerebros del pozo a la gota en el portaobjetos con fórceps. Para evitar dañar los lóbulos ópticos, los cerebros pueden ser sostenidos por el cordón nervioso ventral mientras se transfieren al portaobjetos.
   3. Monte los cerebros según las estrategias de montaje que siguen (Figura 1A).
      1. Cara anterior hacia arriba
         NOTA: Para aquellos interesados en visualizar la médula anterior, la lámina o el tapón de la lóbula, esta orientación de montaje es ideal. La mejor manera de distinguir las monturas anteriores de las posteriores es examinando la posición del cordón nervioso ventral en relación con los lóbulos cerebrales.
         1. Utilice la orientación anterior, para observar el cordón nervioso ventral que se proyecta sobre los lóbulos (Figura 1B).
      2. Lado posterior hacia arriba
         NOTA: Esta orientación se recomienda para aquellos interesados en visualizar las puntas posteriores de la OPC (pOPC) o IPC ^10,11.
         1. Utilice la orientación posterior para ver el cordón nervioso ventral que se proyecta desde debajo de los lóbulos cerebrales (Figura 1C).
      3. Vista lateral
         NOTA: Se utiliza una orientación de montaje lateral para visualizar la media luna de las neuronas del tapón de la lámina, la médula o la lóbula en los ejes dorsal-ventral y antero-posterior en un solo plano (Figura 1G).
         1. Para una montura lateral, separa los lóbulos cerebrales entre sí para que caigan planos de lado, con la lámina y el tapón de lóbulo hacia arriba.
         2. Con dos pares de pinzas afiladas, divida el cordón nervioso ventral por la mitad, comenzando desde donde el cordón se une a los lóbulos. Tenga en cuenta que los dos lóbulos ya están separados entre sí, con el cordón nervioso ventral que los mantiene intactos. Por lo tanto, divida el cordón nervioso ventral desde el punto de escisión entre los lóbulos, para separarlos. A continuación, voltee cada lóbulo del cerebro y el cordón nervioso ventral adjunto a sus lados con las superficies laterales hacia arriba.
            NOTA: Para el montaje de vista lateral, se recomienda utilizar una aguja de tungsteno con una punta fina para orientar el lóbulo cerebral de lado. Para visualizar claramente la orientación de los lóbulos y la dirección del cordón nervioso ventral durante el montaje, se puede ajustar la iluminación del microscopio. Si utiliza una fuente de luz LED de cuello de cisne, los cuellos de cisne deben colocarse paralelos a la superficie del portaobjetos para una visibilidad clara. Además, la intensidad de la iluminación se puede aumentar o disminuir para mejorar el contraste entre las estructuras cerebrales y proporcionar claridad durante el montaje.
   4. Coloque una pequeña gota de PBS a cada lado del medio de montaje que contiene los cerebros. Coloque un cubreobjetos en cada gota y un cubreobjetos final sobre los sesos. Los bordes derecho e izquierdo del cubreobjetos superior deben descansar sobre los otros dos cubreobjetos (Figura 1A).
      NOTA: Antes de colocar un cubreobjetos sobre los cerebros, se debe construir un puente. Los cerebros de las larvas tienen un grosor aproximado de 200 μm y, por lo tanto, para mantener la integridad del tejido, se crea un puente que aumenta la distancia entre el cubreobjetos y la superficie del portaobjetos.
   5. Sella los bordes del puente con esmalte de uñas para asegurar los sesos montados.
   6. Toma de imágenes de los cerebros mediante microscopía confocal.

2. Preparación de cerebros adultos para la obtención de imágenes confocales

1. Disecciones
   NOTA: Las disecciones de cerebros de adultos son más desafiantes que los cerebros de larvas y requieren un manejo cuidadoso. Se recomienda encarecidamente utilizar al menos un par de pinzas ultrafinas (Dumont #55) para esta parte del protocolo.
   1. Anestesiar a las moscas con CO₂, usando una aguja o una almohadilla para moscas, y colóquelas en una toallita de laboratorio o una toalla de papel sobre hielo (para mantenerlas anestesiadas).
   2. Agregue 400 μL de PBS a los tres pocillos del plato de vidrio. Use un par de pinzas para agarrar suavemente una mosca adulta por las alas y colóquela en el primer pozo del plato.
   3. Use un par de pinzas sostenidas en la mano no dominante para sostener el tórax de la mosca contra la base del pozo. Con la mano dominante, separa suavemente la cabeza del resto del cuerpo.
   4. Transfiera la cabeza al segundo pozo. A menudo, la cabeza flotará en el PBS y puede ser difícil de manipular. Use un par de pinzas para sostenerlo contra la base del pozo por la probóscide.
   5. Retire una región de la cutícula entre los ojos con ambas pinzas. Dado que el cerebro se encuentra justo debajo de la cutícula, sea lo más suave posible para evitar dañar el tejido subyacente. Continúe pelando la cutícula una pieza a la vez, hasta que el cerebro quede expuesto. Retire cualquier tejido accesorio (es decir, retina, tráquea, sacos aéreos) que pueda permanecer adherido al cerebro.
      NOTA: La extirpación de la retina ha sido descrita en protocolos previos^22,24, pero también se puede separar la lámina del resto del lóbulo óptico. Esto es útil para aquellos que desean estudiar el complejo de la médula o la lóbula, ya que la lámina se encuentra en la superficie y puede obstruir la visualización de estos otros neuropilos del lóbulo óptico durante la obtención de imágenes. Para extirpar la lámina, use un par de pinzas afiladas para tirar suavemente de la hendidura entre la lámina y los neurópilos del bulbo raquídeo. La lámina comenzará a desprenderse lentamente de la médula. Repita este movimiento hasta que se retire toda la lámina. Durante este proceso, es importante mantener un agarre firme del cerebro. Use otro par de pinzas para sostener el cerebro contra la base del plato colocándolo de manera que la parte superior e inferior del cerebro central encajen perfectamente entre las puntas de las pinzas. Un agarre firme alrededor del cerebro central evitará daños no deseados en el lóbulo óptico.
   6. Transfiere el cerebro limpio al tercer pozo. Repita los pasos 2.1.2-2-1.6 hasta que se obtenga un número suficiente de cerebros o haya transcurrido un período máximo de disección de 30 minutos.
   7. Retire el PBS en el tercer pocillo y agregue 500 μL de solución fija. Asegúrese de que los cerebros no se sequen aquí o durante cualquier paso de lavado, ya que esto provocará fluorescencia de fondo en las imágenes confocales. Cubra el plato con un portaobjetos de vidrio y deje que los cerebros se incuben en forma fija durante 20 minutos a RT.
   8. Después de la fijación, lavar los cerebros con 400 μL de PBT, 5 veces.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los cerebros pueden cubrirse con un portaobjetos de vidrio y una película de laboratorio y dejarse lavar durante 2 a 3 días a 4 °C. Para los investigadores nuevos en el sistema, puede ser más fácil dejar tejido accesorio en el cerebro antes y durante la fijación. Esto permitirá a los investigadores maximizar el número de muestras de cerebro obtenidas en un período de disección determinado. Después de que el tejido se ha fijado y lavado, los cerebros se pueden limpiar cuidadosamente antes de agregar la solución primaria de anticuerpos. Los cerebros adultos con tejido accesorio tienden a flotar y, por lo tanto, corren el riesgo de secarse. Como resultado, se recomienda usar un par de fórceps para agrupar cuidadosamente todos los cerebros en el centro del plato al agregar la solución fija, y limpiar los cerebros inmediatamente después de la fijación.
2. Inmunohistoquímica
   1. Realizar la inmunohistoquímica como se describe para los cerebros de las larvas en la sección 1.2.
   2. Los anticuerpos primarios útiles del DSHB incluyen los que se mencionan en el protocolo de inmunohistoquímica larvaria en la sección 1.2. Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista completa de anticuerpos y las diluciones correspondientes.
      NOTA: Se debe tener especial cuidado durante los pasos de lavado para los cerebros adultos, ya que pueden flotar hasta la superficie de la solución de lavado y correr el riesgo de secarse en los lados del pocillo cuando se retire la solución (lo que provocará una fluorescencia de fondo). Una buena práctica es sostener la pipeta en una mano para agregar o extraer líquido, y un par de pinzas en la otra para mantener el cerebro sumergido.
3. Montura
   1. Antes del paso de montaje, realice un lavado final con PBS (en lugar de PBT). El PBS hace que los cerebros se vuelvan ligeramente pegajosos, lo que les permite permanecer en la orientación deseada durante el montaje.
   2. Retire el lavado final y reemplácelo con tres gotas de medios de montaje seguros para fluorescencia. Coloque una gota del medio de montaje en el centro de un portaobjetos de microscopio.
   3. Transfiera los cerebros del pozo a la gota en el portaobjetos con fórceps. Para evitar dañar los lóbulos ópticos y evitar que el tejido se seque, recupere cuidadosamente un cerebro mediante la acción capilar. Cierre lentamente un par de pinzas alrededor de un cerebro hasta que un pequeño volumen de líquido que contiene el cerebro se extraiga entre las puntas.
      NOTA: Al transferir el cerebro al portaobjetos, tenga cuidado de no cerrar las pinzas, ya que esto dañará el cerebro. Alternativamente, se puede utilizar una pipeta P200 para transferir los cerebros. Corta el extremo de la punta para ensanchar la abertura y enjuaga previamente con PBT para evitar que los sesos se peguen al interior de la punta.
   4. Monte los cerebros según las siguientes estrategias (Figura 2A).
      1. Cara anterior hacia arriba
         NOTA: Para visualizar las neuronas de la lámina y la médula, oriente el cerebro con el lado anterior hacia arriba (Figura 2B). Esto se puede lograr examinando la anatomía y la curvatura de los lóbulos antenales centrales.
         1. Con un par de fórceps, gire suavemente el cerebro de lado para examinar los lados anterior y posterior. Observe que en la cara anterior, la curvatura del cerebro es pronunciada y los lóbulos antenales sobresalen ligeramente hacia afuera del centro.
      2. Lado posterior hacia arriba
         1. Coloque los cerebros con el lado posterior (plano) hacia arriba y los lóbulos de las antenas hacia abajo (Figura 2C).
            NOTA: Esto acercará la lóbula y la placa de lóbula a la superficie de la imagen y es ideal para aquellos interesados en visualizar las neuronas del complejo de lóbula.
      3. Vista horizontal
         NOTA: Para visualizar todos los neuropillos del lóbulo óptico simultáneamente, utilice una estrategia de montaje horizontal (Figura 2G). En esta orientación, los cuerpos celulares neuronales, las trayectorias axonales y las arborizaciones dendríticas se pueden visualizar en el mismo plano.
         1. Inicialmente, orienta el cerebro con la parte anterior hacia arriba. Con una aguja de tungsteno, incline suavemente el cerebro 90° hacia arriba para que quede sobre su lado dorsal con los lóbulos de las antenas hacia afuera. Compruebe que tanto el lado anterior como el posterior del cerebro son visibles en esta orientación.
   5. En lugar de un puente de cubierta, use arcilla para elevar la cubierta del tobogán. El uso de arcilla permite volver a montar los cerebros después de la obtención de imágenes (descrito en la sección de discusión).
      1. Coloque un pequeño pedazo de arcilla en cada esquina de un cubreobjetos. Asegúrate de que cada pieza de arcilla tenga relativamente el mismo grosor. Las piezas de arcilla deben tener entre 0,5 y 1 mm de grosor. Coloque suavemente el cubreobjetos sobre los sesos y aplique una ligera presión en las esquinas. El cubreobjetos debe atrapar inmediatamente el líquido y formar un sello. La diapositiva ya está lista para la toma de imágenes.
         NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo del portaobjetos, se recomienda sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas y guardarlo a 4 °C lejos de la luz.

Representative Results

Discussion

En este protocolo, describimos un método para inmunoteñir cerebros de larvas y adultos de Drosophila y montarlos en varias orientaciones. Si bien los métodos para teñir cerebros de larvas y adultos se han descrito previamente 22,23,24,27,28, las estrategias de montaje para la visualización óptima de estructuras específicas del lóbulo óptico han recibido menos atención ²⁸. Se anticipa que el protocolo descrito aquí proporcionará a los investigadores una mayor comprensión de la relación entre la orientación de montaje y las estructuras de lóbulos ópticos visualizadas.

Además de las orientaciones descritas en este protocolo, se pueden lograr ángulos alternativos de visualización del lóbulo óptico adulto y larvario separando el lóbulo óptico del cerebro central. Los lóbulos ópticos se pueden separar del cerebro central con tijeras de insecto, fórceps o una aguja de tungsteno. En el adulto, esta puede ser una estrategia útil en los casos en que la curvatura del cerebro central inhibe el montaje plano de los lóbulos, lo que resulta en ángulos desiguales durante la toma de imágenes. Cabe señalar que un lóbulo aislado será más difícil de montar sin los puntos de referencia proporcionados por el cerebro central (es decir, lóbulos antenas, curvatura cerebral, etcétera) que se utilizan para determinar la orientación de montaje. Esta limitación se puede superar mediante el análisis de lóbulos ópticos bajo un microscopio GFP de fluorescencia (si el cerebro se tiñe para el marcador fluorescente adecuado) para garantizar que se logre la orientación deseada antes de agregar el cubreobjetos. De manera similar, en la larva, la extracción de un lóbulo cerebral del lóbulo contralateral adjunto y el cordón nervioso ventral, permite que el cerebro se monte en cualquier orientación. Se puede utilizar un microscopio GFP para determinar el ángulo de montaje con respecto a las estructuras de los lóbulos ópticos de interés.

Los cerebros también se pueden obtener en múltiples orientaciones quitando el cubreobjetos después de la obtención de imágenes y volviendo a montar el cerebro. Para volver a montar, el puente original debe estar hecho con arcilla y no se debe aplicar esmalte de uñas. Para reorientar el cerebro, se pueden insertar un par de pinzas debajo del cubreobjetos para romper el sello. Una vez que se levanta el cubreobjetos, la mayoría de los cerebros deben permanecer en el medio de montaje. A continuación, se pueden volver a montar los cerebros y se puede colocar un nuevo cubreobjetos encima de los cerebros. Esta técnica se ha utilizado previamente para obtener imágenes de un solo cerebro en múltiples orientaciones para construir una imagen tridimensional de alta resolución de la morfología de una neurona de médula¹⁷. Si bien el remontaje a menudo se realiza con cerebros adultos, la técnica también se puede aplicar a cerebros de larvas, lo que también requeriría construir el puente con arcilla. Es importante manipular las muestras de cerebro de las larvas con cuidado al volver a montarlas, ya que su fragilidad las hace más propensas a romperse cuando se retira el cubreobjetos.

Los protocolos mencionados anteriormente también se pueden aplicar al tejido cerebral de la pupa 10,22,24. Dado que los cerebros de las pupas experimentan cambios morfogénicos rápidos durante el desarrollo, las orientaciones de montaje para las pupas tempranas (0-30 h APF) se asemejan a las de los cerebros de las larvas, mientras que las pupas de etapa media-tardía (>50 h APF) están más cerca de las orientaciones de montaje del cerebro adulto. Los cerebros de las pupas son más frágiles que los cerebros de las larvas y los adultos y, por lo tanto, requieren un cuidado adicional cuando se manipulan.

Por último, además del tejido fijo y teñido, es importante comprender las orientaciones de montaje del cerebro para las aplicaciones de imágenes en vivo. Los cerebros de larvas y adultos pueden cultivarse y obtener imágenes en condiciones reales para seguir las divisiones celulares y los cambios en la morfología y actividad neuronal a lo largo del tiempo 24,27,29. En este caso, la orientación de montaje utilizada es fundamental, ya que la fluorescencia endógena más débil exige que los tipos de células de interés se ubiquen lo más cerca posible de la superficie del cerebro para una detección óptima de la señal durante la obtención de imágenes.

Materials

10x PBS	Bioshop	PBS405
37% formaldehyde	Bioshop	FOR201
Alexa Fluor 488 (goat) secondary	Invitrogen	A-11055	use at 1:500
Alexa Fluor 555 (mouse) secondary	Invitrogen	A-31570	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary	Invitrogen	A-21450	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (rat) secondary	Invitrogen	A-21247	use at 1:500
Cover slips	VWR	48366-067
Dissecting forceps – #5	Dumont	11251-10
Dissecting forceps – #55	Dumont	11295-51
Dissection Dish	Corning	722085
Dry wipes	Kimbery Clark	34155
Goat anti-Bgal primary antibody	Biogenesis		use at 1:1000
Guinea pig anti-Bsh primary antibody	Gift from Claude Desplan		use at 1:500
Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody	Erclik et al. 2008		use at 1:1000
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.600
Microscope slides	VWR	CA4823-180
Mouse anti-dac primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	mabdac2-3	use at 1:20
Mouse anti-eya primary antibody	DSHB	eya10H6	use at 1:20
Mouse anti-nc82 primary antibody	DSHB	nc82	use at 1:50
Mouse anti-svp primary antibody	DSHB	Seven-up 2D3	use at 1:100
Polymer Clay	Any type of clay can be used
Rabbit anti-GFP	Invitrogen	A-11122	use at 1:1000
Rat anti-DE-Cadherin primary antibody	DSHB	DCAD2	use at 1:20
Slowfade mounting medium	Invitrogen	S36967	Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used
Triton-x-100	Bioshop	TRX506