Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor Pseudomonas aeruginosa infectie en faagtherapie toepassing in cystische fibrose (CF) zebravis embryo's.
Abstract
Antimicrobiële resistentie, een belangrijk gevolg van diagnostische onzekerheid en antimicrobiële overprescriptie, is een steeds meer erkende oorzaak van ernstige infecties, complicaties en sterfte wereldwijd met een enorme impact op onze samenleving en op het gezondheidssysteem. In het bijzonder worden patiënten met een gecompromitteerd immuunsysteem of reeds bestaande en chronische pathologieën, zoals cystische fibrose (CF), onderworpen aan frequente antibioticabehandelingen om de infecties te beheersen met het verschijnen en verspreiden van multiresistente isolaten. Daarom is er een dringende noodzaak om alternatieve therapieën aan te pakken om bacteriële infecties tegen te gaan. Het gebruik van bacteriofagen, de natuurlijke vijanden van bacteriën, kan een mogelijke oplossing zijn. Het protocol dat in dit werk wordt beschreven, beschrijft de toepassing van faagtherapie tegen Pseudomonas aeruginosa-infectie in CF-zebravisembryo's. Zebravis embryo's werden besmet met P. aeruginosa om aan te tonen dat faagtherapie effectief is tegen P. aeruginosa infecties als het vermindert letaliteit, bacteriële last en pro-inflammatoire immuunrespons in CF embryo's.
Introduction
Faagtherapie, het gebruik van de natuurlijke vijanden van bacteriën om bacteriële infecties te bestrijden, is garnering hernieuwde belangstelling als bacteriële resistentie tegen antibiotica wordt wijdverbreid1,2. Deze therapie, die al tientallen jaren in Oost-Europa wordt gebruikt, kan worden beschouwd als een aanvullende behandeling van antibiotica bij het genezen van longinfecties bij patiënten met CF en een mogelijk therapeutisch alternatief voor patiënten die besmet zijn met bacteriën die resistent zijn tegen alle antibiotica die momenteel in gebruik zijn2,3. Voordelen van antibioticatherapie zijn dat bacteriofagen zich vermenigvuldigen op de besmettingsplaats, terwijl antibiotica worden gemetaboliseerd en uit het lichaam worden geëlimineerd4,5. De toediening van cocktails van virulente fagen die geïsoleerd zijn in verschillende laboratoria heeft bewezen effectief te zijn bij de behandeling van Pseudomonas aeruginosa-infecties in diermodellen zo verschillend als insecten en zoogdieren6,7,8. Faagtherapie bleek ook in staat te zijn om de bacteriële belasting in brandwonden besmet met P. aeruginosa en Escherichia coli te verminderen in een gerandomiseerde klinische studie9.
Zebravis (Danio rerio) is onlangs naar voren gekomen als een waardevol model om infecties met verschillende ziekteverwekkers te bestuderen, waaronder P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus en Burkolderia cepacia12,13. Door bacteriën rechtstreeks in de embryobloedcirculatie14 te microinjecteren is het gemakkelijk om een systemische infectie op te zetten die wordt tegengegaan door het aangeboren immuunsysteem van zebravissen, dat evolutionair wordt geconserveerd met neutrofielen en macrofaaggeneratie vergelijkbaar met de menselijke tegenhanger. Bovendien, tijdens de eerste maand van het leven, zebravis embryo's missen de adaptieve immuunrespons, waardoor ze ideale modellen voor het bestuderen van de aangeboren immuniteit, dat is de kritische afweermechanisme bij menselijke longinfecties15. Zebravissen ontpopten zich onlangs als een krachtig genetisch modelsysteem om het cf-begin beter te begrijpen en nieuwe farmacologische behandelingen te ontwikkelen10,16,17. Het CF zebrafish model van cftr knock-down gegenereerd met morpholino injectie in zebravissen presenteerde een gedempte ademhalingsuitbarsting respons en verminderde neutrofiele migratie10, terwijl de cftr knock-out leidt tot verminderde interne orgaanpositie en de vernietiging van de exocrine alvleesklier, een fenotype dat de menselijke ziekteweerspiegelt 16,17. Van het grootste belang was de bevinding dat de P. aeruginosa bacteriële last aanzienlijk hoger was in cftr-loss-of-function embryo's dan in controles op 8 uur na infectie (hpi), die parallel loopt met de resultaten verkregen met muizen en menselijke bronchiale epitheliale cellen2,18. cftr
In dit werk tonen we aan dat faagtherapie effectief is tegen P. aeruginosa infecties in zebravis embryo's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Volwassen zebravissen(Danio rerio)van de AB-stam (European Zebrafish Resource Center EZRC) worden onderhouden volgens internationale (EU-richtlijn 2010/63/EU) en nationale richtsnoeren (Italiaans decreet4 maart 2014, nr. 26) betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. In de visfaciliteit worden standaardomstandigheden vastgesteld met een donkere cyclus van 14 uur licht/10 uur en een temperatuur van het tankwater bij 28°C.
1. Voorbereiding van oplossingen en instrumenten
- Bereid een 50x stockoplossing en 1x werkoplossingen voor E3 embryomedium voor het kweken van zebravisembryo's (zie tabel 1).
- Maak pigmentatieblokkeringsoplossing, om de embryopigmentatie te blokkeren vanaf 24 uur na de bevruchting (24 pk) (zie tabel 1).
- Bereid 25x voorraad en 1x werkende Tricane verdovingsoplossing zoals beschreven in tabel 1.
OPMERKING: Om te voorkomen dat de oplossing herhaaldelijk wordt bevroren en ontdooid die de voorraadoplossing kan beschadigen, maakt u aliquots van 2 mL 25x tricaine en bewaar ze op -20 °C. - Bereid sporen voor op embryomicro-injectie door 1 g agarose op te lossen in 100 mL gedistilleerde H2O in een microwavable kolf of fles. Magnetron gedurende 1-3 min tot de agarose volledig is opgelost.
- Plaats zebravis microinjectiemallen (zie Tabel van Materialen)ondersteboven gedraaid in een petrischaal (90 mm x 15 mm) en bedek het gehele oppervlak door de vloeibare agarose gel met een breedte van ongeveer 10 mm te gieten.
- Verwijder de mal zodra de agarose is gestold. Vul de Petri schotel met 1x E3 embryo medium. Dit kan ongeveer een week bij 4 °C worden bewaard. Voor gebruik vervangen door het verse E3-medium dat Tricaine bevat.
OPMERKING: Oudere schimmels kunnen schimmels of bacteriële besmettingen ontwikkelen. - Gebruik vuur gepolijst 10 cm borosilicaat haarvaten om naalden voor te bereiden op microinjectie en zet ze vast aan de micropipet trekker door het aandraaien van de handgrepen. Stel de trekker met de volgende instellingen: warmte 500, snelheid 100, tijd 150, trek 150.
2. P. aeruginosa (PAO1) inoculumpreparaat
- Inenting 1 kolonie GFP+P. aeruginosa stam PAO119 in 5 mL LB bouillon (zie tabel 1) en groeien 's nachts bij 37 °C met schudden (200 rpm).
- Verdun de bovenstaande nachtcultuur tot OD600 = 0,1 in 10 mL LB-bouillon en groei tot OD600 = 0,5 bij 37 °C met schudden (200 rpm).
- Centrifuge 2 mL van de cultuur gedurende 2 min bij 4 °C bij 16.100 x g en resuspend de celpellet tot OD600 = 1, gelijk aan ongeveer 1 x 109 cfu/mL, in 1 mL van de fysiologische oplossing (zie tabel 1).
- Verdun de celsuspensie tot ongeveer 5 x 107cfu/mL in fysiologische oplossing en bewaar bij 4 °C.
3. Preparaat van faagvoorraden
- Inenting 1 kolonie P. aeruginosa stam PAO1 in 5 mL LB bouillon en incubeer 's nachts bij 37 °C met schudden. Verdun de nachtcultuur tot OD600 = 0,01 in 500 mL LB-bouillon en groei bij 37 °C met schudden tot OD600 = 0,05, wat overeenkomt met ongeveer 2,5 x 107 cfu/mL.
- Aan de verdunde cultuur van P. aeruginosa, voeg ongeveer 1,25 x 107 fagen toe, om de veelheid van infectie (M.O.I.) van 10-3te krijgen. Incubeer bij 37 °C met schudden tot de OD600 daalt tot ongeveer 0,1-0,3 (in ongeveer 3 tot 5 uur, afhankelijk van de gebruikte faag).
OPMERKING: Vier fagen werden geselecteerd voor dit experiment dat PAO1-stam infecteert: Twee Podoviridae, GenBank-toetredingsnummers vB_PaeP_PYO2, MF490236 en vB_PaeP_DEV, MF490238 en twee Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 en vB_PaeM_E217, MF490240. Voer de onderstaande stappen voor elke faag afzonderlijk uit. - Incubeer het lysaat met 1 mg/mL DNase en RNase gedurende 30 min bij 37 °C. Centrifuge bij 5.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C en herstel voorzichtig de supernatant (SN). Filter de SN met een filter met een poriediameter van 0,8 μm.
- Voeg aan de SN 58 g/L NaCl en 105 g/L PEG6000 toe. Los op met roeren op RT 20 min en houd het dan 's nachts op 4 °C. Centrifuge bij 20, 000 x g gedurende 30 min bij 4 °C voor faagneerslag. Verwijder de SN en los de faagpellet voorzichtig op in 15 mL TN-buffer (zie tabel 1).
- Zuiver de fagen met cscl-dichtheidsgradiënt zoals beschreven in onderstaande stappen.
- Bereid in een polyallomer ultracentrifugebuizen voor SW41-rotor een CsCl-trapdichtheidsgradiënt voor door 2 mL van de vier CsCl-oplossingen te stratificeren die in tabel 1 zijnbeschreven. Voeg 3,5 mL faagsuspensie toe in elk van de 4 buizen.
OPMERKING: CsCl is giftig, hanteert de juiste veiligheidsprocedures om het te verwerken en weg te gooien. - Introduceer de buizen in de rotor en zorg ervoor dat de buizen in balans zijn (het gewichtsverschil tussen de twee uit de ogen moet ≤ 0,01g zijn).
- Centrifuge voor 2 uur bij 4 °C en 100, 000 x g (25.000 tpm voor SW41 rotor). Na centrifugatie, langzaam verwijderen van de buizen en zorgvuldig immobiliseren ze op een steun. Met behulp van een spuit met 19 G naald, het opstellen van de witte / opalescente band die zich meestal tussen de d = 1,5 en de d = 1,4 dichtheid regio.
- Breng de suspensies van de spuit over in nieuwe polyallomerbuizen voor SW60-rotor en gebruik de d=1.4-oplossing om de buizen nauwkeurig in balans te brengen.
- Verenig de ophanging bij 4 °C en 150.0000 x g (38.000 tpm voor de SW60 rotor) voor ten minste 16 uur.
- Verzamel de zichtbare band zoals hierboven (zie stap 3.3.3) en breng ze over in dialysebuizen met 6.000 Da cut-off. Dialyze de verkregen zichtbare band 2x voor 20 min tegen 500 mL water en 's nachts tegen 500 mL TN buffer. Filter met een poriefilter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C.
- Bereid in een polyallomer ultracentrifugebuizen voor SW41-rotor een CsCl-trapdichtheidsgradiënt voor door 2 mL van de vier CsCl-oplossingen te stratificeren die in tabel 1 zijnbeschreven. Voeg 3,5 mL faagsuspensie toe in elk van de 4 buizen.
4. Faagcocktailbereiding
- Maak een mix van vier fagen die de stam PAO1 infecteren, eerder geïsoleerd en gekenmerkt8. Voor het mengen, schat de titer van elke faagbouillon door plaque test20.
- Monteer de faagcocktail, met een totale titer van 5 ×10 8 pfu/mL, door evengoed vier faagpreparaten vlak voor elk experiment te mengen in dezelfde pfu/mL, om nauwkeurige faagtiters te garanderen.
5. Inzameling en bereiding van embryo's van zebravis voor cftr morpholinos microinjectie
OPMERKING: Verzamel 1-2 celembryo's van wilde type zebravissen voor cftr morpholinos(cftr-MOs) microinjectie.
- Twee dagen voor het bacteriële micro-injectieexperiment, zet zekpaars op en verzamelt embryo's zoals eerder beschreven21. Volwassen zebravissen (Danio rerio) van de AB stam werden gekocht van de Europese Zebrafish Resource Center, EZRC.
- De dag erna verzamelen de embryo's onmiddellijk na de bevruchting met een plastic pipet of met behulp van een fijnmazige zeef. Plaats de verzamelde embryo's in een petrischaaltje met E3-embryomedium en verwijder het puin voorzichtig met een plastic pipet om besmetting te voorkomen die de embryoontwikkeling zou kunnen beschadigen.
- Bereid 5 μL morpholino injectieoplossing voor door de twee morpholino stock oplossingen (1 mM) in steriel water te verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van 0,25 pmol/embryo ATG-MO + 0,25 pmol/embryo splice-MO. Om de embryo-injectie te traceren, voeg 0,5 μL fenolrood toe aan de morpholino-injectieoplossingsmix.
- Laad een microinjectienaald met ongeveer 5 μL van de morpholino-mengoplossing met behulp van een 20 μL micropipet met een fijne gellaadpunt. Bevestig de naald op de micromanipulator aangesloten op een standaard en plaats deze onder een stereomicroscoop.
OPMERKING: Het is niet nodig dat de oplossing de punt van de naald bereikt, omdat de druk van de microinjectorpomp het zal duwen. - Knip de punt van de naald af door de naaldpunt met fijne steriele pincet door te snijden. Meet de diameter van de druppel met behulp van een schaalbalk in de oculaire van de microscoop. U ook een druppel minerale olie op een micrometerdia afschuifen en het microinjectievolume instellen door de oplossing in de oliedruppel te injecteren om de druppelgrootte te evalueren. Gebruik een druppel met een diameter van 156 μm om een volume van 2 nL te injecteren.
- Stel de microinjector in door de compensatiedruk aan te passen op 15 hPa, injectietijd op 0,5 s en injectiedruk tussen 300 en 600 hPa om het juiste injectievolume te verkrijgen, afhankelijk van de gebruikte naald.
- Met een plastic pipet schik je de embryo's van stap 5.2 op een glas in een petrischaal met een diameter van 96 mm.
OPMERKING: Te veel E3-medium voorkomt de juiste penetratie van de micro-injectienaald in de chorion van de embryo's. - Penetreer het chorion en vervolgens de dooier met de naald om 2 nL in het embryo te injecteren zoals eerder beschreven22.
- Plaats geïnjecteerde embryo's in een petrischaaltje met E3-medium en leg ze in een couveuse bij 28 °C om ze te laten ontwikkelen tot de dag erna.
6. Microinjectie van embryo's van zebravis met bacteriën en faagcocktail
OPMERKING: Om een systemische infectie uit te voeren, moet het embryo een bloedcirculatie hebben die meestal begint na 26 pk.
- Na 26 pkf (voor zebravis ontwikkelingsstadia verwijzen naar Kimmel21) dechorionate embryo's met pronaza oplossing bereid door het oplossen van pronaza poeder in E3 medium bij een concentratie van 2 mg/mL. Voorzichtig pipette de embryo's om het chorion te breken. Gooi het pronaza/E3-medium weg en spoel de schotel meerdere malen af met verse E3 om alle pronaza te verwijderen.
- Verdoes zebravisembryo's in E3-medium met Tricaine ongeveer 5 minuten voor injecties.
- Pipette de gesheste embryo's in de baan bereid in stap 1. Gebruik een fijne gel laadtip om de embryo's in de zijdelingse positie te lijnen.
- Laad een microinjectienaald met ongeveer 5 μL van het P. aeruginosa preparaat zoals beschreven in deel 5.
- Plaats de naald dorsally aan het beginpunt van het kanaal van Cuvier waar het begint te verspreiden over de dooier zak. Injecteer een volume van 1-3 nL en zorg ervoor dat het volume direct in het kanaal uitzet en in het verkeer komt.
- Ongeveer na elke 50 geïnjecteerd-embryo, injecteer een druppel van de bacteriën in een 1,5 mL centrifuge buis met 100 μL steriele PBS om te controleren of het injectievolume hetzelfde blijft. Plaats het entmateriaal op LB agar (zie tabel 1) op 37 °C 's nachts om de CFU te beoordelen.
- Breng de microinjected embryo's in twee schone petrischaaltjes met vers E3-medium + PTU en broed ze uit op 28 °C.
- Op twee geselecteerde tijdstippen: 30 min of 3 uur na de bacteriële injectie, neem een van de petrischaaltjes met bacteriële geïnjecteerde embryo's uit de couveuse en lijn ze uit in het spoor zoals beschreven in 6.3 voor de faagcocktailinjectie.
- Laad een microinjectienaald met ongeveer 5 μL van de faagcocktail (bereid in stap 4) met een fijne gellaadpunt en bevestig deze aan de microinjector (zie stap 5).
- Injecteer de faagcocktail in het kanaal van Cuvier van de embryo's die eerder met bacteriën werden geïnjecteerd.
- Breng de microinjected embryo's in twee schone petrischaaltjes met vers E3-medium + PTU en broed ze uit op 28 °C.
7. Evaluatie van de bacteriële last van embryo's geïnjecteerd met PAO1 en fagen
- Met 8 pk, pipet 15 verdoofde embryo's van de Petri schotel tot een 1,5 mL centrifuge buis.
- Vervang de verdovingsoplossing door 300 μL van 1% Triton X-100 in PBS (PBSTritonX) en homogeniseer de embryo's door ze minstens 15x door een insulinespuit met een steriele 27-G naald te laten passeren.
- Bereid seriële verdunningen van homogenaten in steriele PBS door 100 μL van het verdunde homogenaat over te brengen in 900 μL steriele PBS.
- Om te kiezen voor de natuurlijk resistente PAO1-stam, plaat 100 μL van de verdunningen op LB agar toegevoegd met ampicilline (100 μg/mL), en incubeer bij 37 °C 's nachts.
- De dag erna, tel het aantal kolonies, vermenigvuldig met de verdunningsfactor om het totale aantal CFU te bepalen, en deel door het aantal embryo's gehomogeniseerd om het gemiddelde aantal CFU / geïnfecteerde embryo te verkrijgen.
8. Evaluatie van de dodelijkheid van embryo's geïnjecteerd met PAO1 en fagen
- Om de dodelijkheid van de PAO1-infectie te evalueren, scoort u de geïnjecteerde embryo's op 20 hpi onder een stereomicroscoop en telt u voor de dode embryo's (wit/niet transparant).
- Bereken de half-maximale dodelijke concentratie 50 (LD50) dosis PAO1 die de dood van 50% van de geïnjecteerde embryo's bij 20 hpf bepaalt.
9. Embryovoorbereiding voor stereomicroscoop time-lapse beeldvorming van GFP+ PAO1 infectie
- Bereid de mal voor live-embryo beeldvorming door het oplossen van 1,5% laag smelten agarose in 100 mL van E3 oplossing.
- Voeg 1% Tricaine (zie tabel 1)toe om de embryo's te verdoven.
- Bij 4 hpi breng je een embryo met een plastic pipet in een glazen bodemschaal en voeg je de warme laag-smeltpuntagarose-oplossing toe.
- Plaats de glazen bodemschaal onder een stereomicroscoop en plaats het embryo met een tip in de gewenste richting. Gebruik een plastic pipet om voorzichtig een druppel agarose op het embryo toe te voegen.
- Laat de agarose 5-10 minuten afkoelen en vul de glazen bodemschaal voorzichtig met E3 met de verdovingsoplossing om het embryo vochtig te houden.
- Plaats de glazen bodemschotel met het embryo onder de fluorescerende stereomicroscoop met een fluorescerend filter (kanaal 488 nm) voor GFP+ bacteriën. Verwijder de petrischaal pas bij verdere aanwinsten met dezelfde parameters op 9, 14 en 18 hpi.
10. Expressie-analyses van pro-inflammatoire cytokinen
- Verdoof de embryo's met 20 hpi met tricaine 1x-oplossing en breng ze van de Petri schotel naar een 1,5 mL centrifugebuis.
- Verwijder onder een rookkap de verdovingsoplossing en vervang deze door 200 μL guanidiumhydrochloridereagens.
- Homogeniseer embryo's door ze eerst herhaaldelijk door een pipet van 200 μL te pipetten en vervolgens minstens 15x met een insulinespuit met een steriele 27 G naald.
- Haal het totale RNA uit gehomogeniseerde zebravisembryo's met behulp van een commercieel verkrijgbaar guanidiumhydrchloridereagentia volgens de instructies van de fabrikant.
- Behandel 1 μg van elk monster RNA met 2 μL 1U/μL DNase I (RNase-vrij), volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik 1 μg DNase I behandeld RNA voor reverse-transcriptie reactie (RT) met behulp van commercieel beschikbare kit (zie Tabel van Materialen), in een totaal volume van 20 μL volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer RT qPCR-reactie uit in een totaal volume van 10 μL met 1x SYBR Green mastermix met behulp van 1,5 μL van een 1:6 verdunning van rt-reactie. Gebruik voor normalisatiedoeleinden de primers voor de huishoudgenen rpl8 en voor pro-inflammatoire cytokinen primers voor TNF-α en IL-1β (zie tabel 2). qPCR protocol was: cyclus 1 stap 1: 95 °C, 2 min, herhaal een keer; cyclus 2: stap 1 95 °C, 10 s, stap 2 55 °C, 30 s, herhaal 40x; cyclus 3: stap 1 72 °C, 15 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier gepresenteerde resultaten en cijfers worden verwezen naar CF-embryo's die worden gegenereerd door de injectie van cftr-morfoos zoals eerder beschreven10 en in stap 5. Om het CF-fenotype te valideren, werd de verminderde positie van inwendige organen zoals hart, lever en alvleesklier in aanmerking genomen zoals eerder beschreven17 (figuur 1). Soortgelijke resultaten werden verkregen in het geval van de WT embryo's zoals gerapporteerd in onze vorige publicatie19.
Bacteriële belasting werd verminderd door faagtherapie in CF embryo's besmet met PAO1. Bovendien hebben we de bacteriële belasting op 8 hpi geëvalueerd door groepen van 15 embryo's te homogeniseren: het gemiddelde aantal bacteriën (cfu/embryo) dat in de PAO1 besmette embryo's aanwezig was, werd teruggebracht tot ongeveer 20% na een behandeling met faagtoediening, waardoor een minder ernstige infectie in aanwezigheid van de faagcocktail werd bevestigd (figuur 2).
Letaliteit werd verminderd door faagtherapie in CF embryo's besmet met GFP+ bacteriën PAO1. CF zebrafish embryo's op 48 hpf werden geïnjecteerd met GFP+ bacteriën van de PAO1 stam bij een dosis die 50% dodelijkheid veroorzaakt na 20 hpi (30 cfu / embryo, Figuur 3A). De plaats van injectie was de dooier of het kanaal van Cuvier om een systemische infectie te genereren. Faagtherapie tegen PAO1-infectie werd getest door 2 nL van de even gemengde faagcocktail (300-500 pfu/embryo) te injecteren. De injectie werd uitgevoerd op twee verschillende tijdstippen: 30 min (vroeg) en 7 uur (te laat) na bacteriële injectie. In beide gevallen werd de letaliteit verminderd met 20 hpi, wat aangeeft dat faagtherapie effectief is (figuur 3B).
Met live beeldvorming, met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop, volgden we ook de progressie van de infectie in CF-embryo's geïnjecteerd met GFP+ PAO1 en toonden we de werkzaamheid van faagtherapie bij het verminderen van de verspreiding van fluorescerende bacteriën over de dooierzak. Het CF+PAO1 geïnjecteerd embryo met GFP+ bacteriënvermenigvuldiging op 4, 9, 14 en 18 hpi wordt weergegeven in de bovenzijde van figuur 4, terwijl het CF+PAO1+faagbryo met verminderde fluorescentie als gevolg van faagactie tegen bacteriën in het onderste deel wordt weergegeven(figuur 4).
Faagtherapie verminderde de ontstekingsreactie die wordt gegenereerd door PAO1-infectie in CF-embryo's. We, ook, geëvalueerd de immuunrespons gegenereerd door PAO1 en PAO1 + fagen injectie op 8 hpi. Zoals verwacht werd de expressie van de pro-inflammatoire cytokinen TNF-a en IL-1β geanalyseerd door qPCR-technieken aanzienlijk verhoogd na pao1-injectie in vergelijking met controles, terwijl deze werd verminderd met de co-injectie van de faagcocktail(figuur 5A,B).
Figuur 1: Generatie en validatie van CF-embryo's op cftr morpholinos(cftr-MOs)injectie. aA) Verminderde positie en lussen van het hart in CF geïnjecteerde embryo's in vergelijking met wild-type (WT) embryo's. Hart wordt gevisualiseerd met cmlc2 expressie door in situ hybridisatietechniek. (B) Verminderde positie van de lever (pijlen) en alvleesklier in CF embryo's in vergelijking met WT. Lever en alvleesklier worden gevisualiseerd met prox1a expressie door in situ hybridisatie technieken. Schaalbalken geven 100 μm aan. liv: lever; p: alvleesklier. De figuur is herdrukt vanaf19 Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Bacteriële belasting in CF-embryo's die besmet zijn met PAO1- of PAO1+-fagen. Het relatieve percentage cfu/embryo in PAO1+fagen vs PAO1 embryo's wordt gegeven. Het gemiddelde en de SD van drie onafhankelijke experimenten wordt gerapporteerd. Het cijfer wordt herdrukt vanaf19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Letaliteit van CF zebravis embryo's besmet met PAO1 en met PAO1+fagen. aA) Bepaling van LD50 in 48 hpf zebravisembryo's die in het stadium van 1 cel (CF-embryo's) met cftr-MOzijn gemicroinjecteerd en met 48 pkf zijn besmet met 2 nL van een pao1-cultuur die een toenemend aantal bacteriën bevat (cfu/embryo). Letaliteit van de embryo's werd waargenomen bij 20 hpi. (B) Letaliteit bij 20 pk c cf embryo's besmet met PAO1 op 48 pkf en behandeld met de faagcocktail (PAO1+ Φ). De gemiddelde en SD gemeld zijn van zes en vier experimenten, respectievelijk, elk met 25-40 embryo's. Hoekige transformatie werd toegepast op het percentage van de letaliteit en one-way ANOVA gevolgd door Duncan's test werd gebruikt. Het cijfer wordt herdrukt vanaf19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Beeldvorming van de werkzaamheid van faagtherapie bij zebravissen. Progressie van de infectie in CF embryo's na PAO1-injectie (bovenste embryo) en werkzaamheid van de faagtherapie in PAO1+fagen injecteerde embryo's (bodemembryo) op 4, 9, 14 en 18 hpi. Schaalbalk geeft 100 micron aan. Het cijfer wordt herdrukt vanaf19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Expressie van pro- en ontstekingsremmende cytokinen na PAO1 en PAO+faagtoediening. Expressieniveaus van de TNF-a (A) en IL-1β genen gemeten door RT-qPCR bij 8 hpi in CF embryo's geïnjecteerd met PAO1 en PAO1+Φ bij 48 pkf en genormaliseerd met behulp van rpl8. Het gemiddelde en de SD van vier experimenten worden gerapporteerd. De statistische significantie werd beoordeeld door ANOVA, gevolgd door duncan's test: voor TNF- a (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,015*; (CF) vs (CF+PAO1+Φ) p = 0,019*; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,77 n.s.; voor IL-1β (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,00014***; (CF) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,00068***; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,031*. Het cijfer wordt herdrukt vanaf19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Oplossingen | Voorbereiding |
| Anesthetische voorraadoplossing 25X | 4 mg/mL Tricaine in gedistilleerde H2O. |
| Anesthesiewerkoplossing 1X | verdun in gedistilleerde H2O de Tricaine stock oplossing 25X preparaat om de 1X concentratie (0,16 mg/mL) Tricaine van gedistilleerde H2O te bereiken. |
| CsCl d=1.3 | 20,49 g in 50 mL TN |
| CsCl d=1.4 | 20,28 g in 50 mL TN |
| CsCl d=1.5 | 34,13 g in 50 mL TN |
| CsCl d=1.6 | 41,2 g in 50 mL TN |
| E3 embryo medium voor zebravis embryo | 1 L 1 van E3 (verdun de 50X voorraad met gedistilleerde H2O) + 200 μl van 0,05% methylblauw . Store bij RT. |
| E3 embryo medium stock oplossing (50X) | 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl , 9,15 g CaCl2 en 9,95 g MgSO4 in 5 L gedistilleerde H2O. Store bij RT. |
| LB agar | 10 g/L tryptone, 5 g/L gistextract, 5 g/L NaCl, 10 g/L agar |
| LB bouillon | voor 1L: 950 mL H2O, 10 g Tryptone, 10 g NaCl, 5 g Gistextract |
| PBST (PBST) | PBS 1X + Triton X 1% |
| Fysiologische oplossing | 0,9% NaCl |
| Pigmentatie blokkeren voorraad oplossing 10X | 0,3 mg/mL fenyl thiourea (PTU) poeder in E3 embryo medium voor zebravis embryo |
| Pronaza voorraadoplossing 5X | 5 mg/mL pronazapoeder in E3 embryo medium voor zebravis embryo |
| TN-buffer | 10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl |
Tabel 1: Voorbereiding van oplossingen.
| De naam van het gen | Primer-reeks |
| TNF-alpha Fw | 5'-TGCTTCACGCTCCATAAGACC-3' |
| TNFalpha Rev | 5'-CAAGCCACCTGAAGAAAAGG-3' |
| IL1-bèta Fw | 5'-TGGACTTCGCAGCAAAATG-3' |
| IL1-bèta Rev | 5'-CGTTCACTTCACGCTCTTGGATG-3' |
| rpl8 Fw | 5'-CTCCGTCTTCAAAGCCCAT-3' |
| rpl8 Rev rpl8 Rev rpl8 Rev | 5'-TCCTTCACGATCCTTGAT-3' |
Tabel 2: Primers die worden gebruikt voor RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript beschreven we het protocol om P. aeruginosa (PAO1) infectie uit te voeren in zebravisembryo's en hoe faagtherapie toe te passen met een cocktail van fagen die eerder was geïdentificeerd als in staat om PAO1 te infecteren om het op te lossen. Het gebruik van bacteriofagen als alternatief voor antibioticabehandelingen is de laatste jaren steeds meer in het oog. Dit is voornamelijk te wijten aan de verspreiding van multiresistente (MDR) bacteriële infecties, die een ernstig probleem vormen voor de volksgezondheid. Natuurlijk is de reikwijdte van dit werk beperkt tot de toepassing van faagtherapie op een diermodel en niet op mensen. We genereerden echter een cystische fibrose zebravismodel met de injectie van een morfoino gericht op het cftr-gen, wat de werkzaamheid van faagtherapie ook aantoont in een pathogenetisch model dat bijzonder gevoelig is voor P.aeruginosa-infectie.
Het is op te merken dat we gemakkelijk faagtherapie kunnen bereiken, zoals in een eerder werk, we geïsoleerd en gekenmerkt verschillende fagen in staat om P. aeruginosa infecteren zowel in vitro en in vivo8. Deze stap is van fundamenteel belang om de antimicrobiële activiteit van de fagen te verkrijgen. De isolatie en karakterisering van fagen in staat om een specifieke bacteriële stam te infecteren zijn kritische stappen van faagtherapie toepassing. Om nadelige effecten van fagen op de gastheer van het dier/de mens te voorkomen, is het namelijk noodzakelijk om lytische fagen te gebruiken in plaats van die lysogeen. Het belangrijkste is dat het noodzakelijk is om de faagbenoomen te controleren op de aanwezigheid van schadelijke genen als die voor antibioticaresistentie, virulentie en genoverdracht.
Faagtherapie is al met succes gebruikt in andere diermodellen. We zijn ons ervan bewust dat zebravissen geen zoogdiermodel is en dat sommige effecten van fagen anders kunnen zijn. Aangezien zebravissen echter een aangeboren immuunsysteem bezitten dat vergelijkbaar is met het menselijke systeem met een geconserveerde populatie neutrofielen en macrofagen23,speculeren we dat de gegevens over de immuunrespons reproduceerbaar kunnen zijn bij de mens. Bovendien, zebravis is goed beoordeeld voor bacteriële infectie studies, het gebruik ervan als een tester voor faagtherapie werkzaamheid kan veelbelovend zijn voor therapeutische benaderingen. Inderdaad, de infectie kan systemisch zijn als bacteriën worden geïnjecteerd in de circulatie via het kanaal van Cuvier, of gelokaliseerd zoals gemeld17. We voerden zowel systemische als gelokaliseerde infecties uit en toonden aan dat ze op dezelfde manier verhoogde letaliteit en bacteriële lasten genereerden die beide werden verminderd na toepassing van faagtherapie. Bovendien, aangezien GFP+ fluorescerende PAO1-bacteriën werden geïnjecteerd, was het gemakkelijk om de infectie te volgen op verschillende tijdstippen van de embryoontwikkeling die de vermindering van fluorescerende bacteriën bevestigde wanneer fagen werden geïnjecteerd.
Voor zover wij weten, is dit de eerste beschrijving van faagtherapie toepassing bij zebravissen, met de toegevoegde waarde voor de demonstratie van fagen antimicrobiële activiteit tegen P. aeruginosa in een CF achtergrond, die bijzonder gevoelig is voor deze bacteriële infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Italiaanse Cystic Fibrosis Foundation (FFC#22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo en FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
