Summary
여기에 제출된 것은 낭포성 섬유증(CF) 제브라피시 배아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염 및 파지 치료 응용 프로그램에 대한 프로토콜이다.
Abstract
항균 저항, 진단 불확실성및 항균 과처방의 주요 결과, 우리 사회와 건강 시스템에 큰 영향을 미치는 전 세계적으로 심각한 감염, 합병증 및 사망의 점점 인식되는 원인입니다. 특히, 면역 체계가 손상되거나 낭포성 섬유증(CF)과 같은 기존 및 만성 병리를 가진 환자는 다약물 내성 분리물의 출현 및 확산으로 감염을 제어하는 빈번한 항생제 치료를 받게 된다. 따라서 세균 감염에 대처하기 위한 대체 요법을 해결해야 할 긴급한 필요성이 있습니다. 박테리아의 자연적인 적인 박테리오파지의 사용은 가능한 해결책이 될 수 있습니다. 이 작품에 자세히 설명 된 프로토콜은 CF 제브라피시 배아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염에 대한 파지 치료의 적용을 설명합니다. Zebrafish 배아는 CF 배아에서 치사성, 세균성 부담 및 염증성 면역 반응을 감소시키기 때문에 파지 치료가 P. aeruginosa 감염에 효과적이라는 것을 증명하기 위해 P. aeruginosa에 감염되었습니다.
Introduction
파지 요법은 세균 감염과 싸우기 위해 박테리아의 자연적인 적의 사용으로 항생제에 대한 세균 저항이 널리 퍼지면서 새로운 관심을 얻고 있다1,,2. 동유럽에서 수십 년 동안 사용되는 이 치료법은 CF 를 사용한 환자에서 폐 감염을 경화시키는 항생제에 대한 보완적 치료법으로 간주될 수 있으며 현재 사용 중인 모든 항생제에 내성이 있는 박테리아에 감염된 환자에 대한 가능한 치료 대안으로 간주될 수 있다2,,3. 항생제 치료의 장점은 세균세포가 감염 부위에서 증식하는 반면 항생제는 대사되고4신체4,5에서제거된다는 것이다. 실제로, 다른 실험실에서 분리된 악성 파지의 칵테일의 투여는 곤충과 포유류6,67,7,8과다른 동물 모델의 슈도모나스 아루기노사 감염을 치료하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다. 파지 요법은 또한 P. aeruginosa 및 Escherichia 대장균에 감염된 화상 상처에 있는 세균성 부담을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다 9 무작위 임상 시험9.
Zebrafish(Danio rerio)는최근 P. aeruginosa10,,11, Mycobacterium 농양 및 버콜데리아 세파시아,12,13을포함하여 여러 병원균으로 감염을 연구하는 귀중한 모델로 부상했습니다. 배아 혈액 순환에 직접 박테리아를 마이크로 주입함으로써제브라피시 선천적 면역 계통에 의해 상쇄되는 전신 감염을 확립하기 쉬우며, 이는 인간과 유사한 호중구 및 대식세포 생성과 함께 진화적으로 보존된다. 더욱이, 생활의 첫번째 달 도중, 제브라피시 태아는 적응성 면역 반응이 결여되어, 인간 폐 감염에 있는 중요한 방어 기계장치인 선천적인 면역을 공부하기 위한 이상적인 모형을 만들기(15). Zebrafish는 최근에 CF 개시를 더 잘 이해하고 새로운 약리학적 치료를 개발하기 위해 강력한 유전 모델 시스템으로 등장10,,16,,17. 제브라피시에서 모르폴리노 주입으로 생성된, CFTR 노크다운CF제브라시 모델은 호흡 버스트 반응과 호중구 이동감소(10)를제시했으며, cftr 녹아웃은 내부 장기 위치및 외신 췌장의 파괴로 이어지며, 인간 질환을 반영하는 표현형인 외신 췌장의 파괴로 이어진다.1617 가장 큰 관심사는 P. aeruginosa 세균성 부담이 마우스와 인간 기관지 상피 세포2,,18로얻은 결과를 평행하게 하는 8시간 후 감염(hpi)에서 대조군에서 보다 cftr-손실-기능배아에서 현저히 높았다는 것을 발견하였다.
이 작품에서, 우리는 파지 치료가 제브라피시 배아에 있는 P. aeruginosa 감염에 대하여 효과적이다는 것을 보여줍니다.
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Protocol
AB 균주(유럽 제브라피시 자원 센터 EZRC)의 성인 제브라피쉬(Daniorerio)는국제(EU 지침 2010/63/EU) 및 국가 지침(2014년 3월4일, n.26)에 따라 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 따라 유지됩니다. 표준 조건은 28 ° C에서 빛 / 10 h 어두운 주기와 탱크 수온의 14 h와 물고기 시설에서 설정됩니다.
1. 솔루션 및 도구 준비
- 성장하는 제브라피시 배아를 위한 E3 배아 배지에 대한 50배 스톡 솔루션과 1배 작동 용액을 준비한다(표 1참조).
- 색소 침착 차단 용액을 만들고, 배아 색소 침착을 24 시간 후 수정 (24 hpf)에서 차단합니다 (표 1참조).
- 표 1에설명된 대로 25배 스톡 및 1배 작동 트리케인 마취용액을 준비한다.
참고: 재고 용액을 손상시킬 수 있는 용액의 반복된 동결 및 해동을 피하기 위해 25x 트리카인 2mL의 알리쿼트(aliquots)를 만들어 -20°C에 보관하십시오. - 마이크로 웨이브 플라스크 또는 병에 증류 된 H2O의 100 mL에서 아가로즈 1 g을 용해하여 배아 미세 주입을위한 트랙을 준비합니다. 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 1-3분 간 전자레인지에 조리합니다.
- 페트리 접시(90mm x 15mm)에서 제브라피쉬 미세 주입 금형(재료 표참조)을 배치하고 약 10mm 너비의 액체 아가로즈 젤을 부어 표면 전체를 덮습니다.
- 아가로즈가 고화되면 금형을 제거합니다. 페트리 접시를 1x E3 배아 배지로 채웁니다. 이는 약 1주일 동안 4°C로 저장할 수 있다. 사용하기 전에 트리카인을 함유한 신선한 E3 배지로 교체하십시오.
참고: 오래된 곰팡이는 곰팡이 또는 세균 오염을 일으킬 수 있습니다. - 10cm 의 보로실리케이트 모세혈관을 사용하여 미세 주입을 위한 바늘을 준비하고 손잡이를 조여 마이크로 피펫 풀러에 고정하십시오. 다음 설정으로 풀러를 설정 : 열 500, 속도 100, 시간 150, 당기 150.
2. P. 아에루기노사 (PAO1) 접종 준비
- GFP+P. aeruginosa 균주 PAO119 의 5 mL에서 (표 1참조) 및 흔들림 (200 rpm)으로 37 °C에서 하룻밤 성장한다.
- 위의 하룻밤 배양을 LB 국물의 10mL에서 OD600 = 0.1로 희석하고 흔들림(200 rpm)으로 37°C에서 OD600 = 0.5로 자랍니다.
- 원심분리기 2mL은 16,100 x g에서 4°C에서 2분 동안 배양하고 세포 펠릿을 OD600 =1로 재보설하고, 약 1 x 109 cfu/mL에 상응하는 1mL의 생리용액(표 1참조).
- 생리용액에 약 5 x 107cfu/mL로 세포 현탁액을 희석하고 4°C에 보관하십시오.
3. 파지 재고 준비
- P. aeruginosa 균주 PAO1의 접종 1 콜로니 5 mLLB 국물의 5 mL에서 및 흔들림과 함께 37 °C에서 하룻밤 배양. 하룻밤 문화를 500mLLB 국물에600 = 0.01로 희석하고 37°C에서 OD600 = 0.05로 흔들리면 약 2.5 x 107 cfu/mL에 해당한다.
- P. aeruginosa의희석 된 배양에,10-3의감염 (M.O.I.)의 복합성을 얻기 위해 약 1.25 x 107 파지를 추가합니다. 37°C에서 OD600이 약 0.1-0.3으로 떨어질 때까지 흔들어 서 배양한다(사용된 파지에 따라 약 3~5시간).
참고: PAO1 균주를 감염시키는 이 실험에는 포도비리대 2개, 젠뱅크 가입 번호 vB_PaeP_PYO2, MF490236, vB_PaeP_DEV, MF490238, vB_PaeP_DEV, MF490238, 2개의 묘비리대, vB_PaeM_E215, MF490241, vB_PaeM_E217, MF490240을 감염시키는 실험에 4개의 파오가 선정되었습니다. 각 파지에 대해 아래 단계를 개별적으로 수행합니다. - 37°C에서 30분 동안 DNase 및 RNase의 1 mg/mL로 용해를 배양합니다. 원심분리기는 5,000 x g에서 4°C에서 30분 동안 조심스럽게 상류체(SN)를 복구합니다. 0.8 μm 모공 직경을 갖는 필터로 SN을 필터링합니다.
- SN에 58 g/L의 NaCl과 105 g/L의 PEG6000을 추가하십시오. RT 20분에서 교반하여 녹인 다음 밤새 4°C로 유지하십시오. 파지 강수량에 대한 4 °C에서 30 분 동안 20, 000 x g에서 원심 분리기. SN을 제거하고 TN 버퍼의 15mL에서 파지 펠릿을 조심스럽게 용해하십시오(표 1참조).
- 아래 단계에 설명된 대로 CsCl 밀도 그라데이션으로 파지를 정화합니다.
- SW41 로터용 폴리알로머 초원심분리기 튜브에서 표 1에설명된 4개의 CsCl 솔루션 중 2mL를 계층화하여 CsCl 단계 밀도 그라데이션을 준비한다. 4개의 튜브 각각에 3.5mL의 파지 서스펜션을 추가합니다.
참고 : CsCl은 독성, 처리하고 폐기하는 적절한 안전 절차를 채택한다. - 튜브를 로터에 도입하고 튜브가 균형을 이루도록 하십시오(두 개의 면관 간의 중량 차이는 0.01g≤).
- 4°C 및 100xg(SW41 로터의 경우 25,000rpm)에서 2시간 동안 원심분리기. x g 원심 분리 후 튜브를 천천히 제거하고 조심스럽게 지지에 고정시하십시오. 19 G 바늘주사기를 사용하여 일반적으로 d=1.5와 d=1.4 밀도 영역 사이에 위치한 흰색/오팔레센트 밴드를 그립니다.
- 주사기에서 SW60 로터의 새로운 폴리알로머 튜브로 서스펜션을 전송하고 d=1.4 솔루션을 사용하여 튜브의 균형을 정밀하게 조정합니다.
- 적어도 16h에 대해 4°C 및 150,000xg(SW60 로터의 경우 38,000rpm)에서 서스펜션을 원심분리한다. x g
- 위와 같이 보이는 밴드를 수집하고(3.3.3 단계 참조) 6,000 Da 컷오프로 투석 튜브로 옮길 수 있습니다. 얻어진 가시대2x는 500mL의 물에 대해 20분, TN 버퍼 500mL에 대해 하룻밤 동안 2배나 투석을 한다. 0.22 μm 모공 필터로 필터링하고 4 °C에서 저장합니다.
- SW41 로터용 폴리알로머 초원심분리기 튜브에서 표 1에설명된 4개의 CsCl 솔루션 중 2mL를 계층화하여 CsCl 단계 밀도 그라데이션을 준비한다. 4개의 튜브 각각에 3.5mL의 파지 서스펜션을 추가합니다.
4. 파지 칵테일 준비
- 이전에 격리되고 특징인8인변형 PAO1을 감염시키는 4개의 파지를 혼합합니다. 혼합하기 전에 각 파지 스톡의 티터를 플라크분석20으로추정한다.
- 파지 칵테일을 5× 108 pfu/mL의 전체 티터로 조립하여 각 실험 직전에 동일한 pfu/mL에서 4개의 파지 제제를 동등하게 혼합하여 정확한 파지 티터를 보장합니다.
5. cftr morpholinos 미세 주입을위한 제브라피시 배아의 수집 및 준비
참고: cftr 모르폴리노스(cftr-MOs) 미세 주입을cftr위해 야생형 제브라피시로부터 1-2세포 배아를 수집합니다.
- 세균성 미세 주입 실험 이틀 전에, 번식 쌍을 설정하고 이전에 설명된 바와 같이 배아를수집21. AB 균주의 성인 제브라피쉬(Daniorerio)는유럽 의 제브라피시 자원 센터, EZRC에서 구입하였다.
- 다음 날, 플라스틱 파이펫으로 수정 직후 또는 미세 메쉬 여과기를 사용하여 배아를 수집합니다. 수집된 배아를 E3 배아 배지를 함유한 페트리 접시에 놓고 플라스틱 파이펫으로 이물질을 조심스럽게 제거하여 배아 발달을 손상시킬 수 있는 오염을 피하십시오.
- 멸균수에 2개의 모르폴리노 주식 용액(1mM)을 최종 농도0.25 pmol/embryo ATG-MO +0.25 pmol/embryo 스플라이스-MO로 희석하여 모르폴리노 주입 용액 5μL을 준비한다. 배아 주입을 추적하려면, 모르폴리노 주입 용액 믹스에 페놀 레드의 0.5 μL을 추가한다.
- 미세 젤 로딩 팁이 있는 20 μL 마이크로피펫을 사용하여 모르폴리노 믹스 용액의 약 5μL로 마이크로 주입 바늘을 적재합니다. 스탠드에 연결된 미세 조작기에 바늘을 고정하고 스테레오 현미경 으로 배치합니다.
참고 : 마이크로 인젝터 펌프의 압력이 밀어 붙이기 때문에 용액이 바늘 끝에 도달 할 필요가 없습니다. - 바늘 끝을 미세한 멸균 핀셋으로 절단하여 바늘 끝을 잘라냅니다. 현미경의 안구에 있는 스케일 바를 사용하여 낙하의 직경을 측정합니다. 또는, 마이크로미터 슬라이드에 미네랄 오일 한 방울을 만들고 액수를 오일 드롭에 주입하여 미세 주입 량을 설정하여 액적 크기를 평가합니다. 직경 156μm의 낙하를 사용하여 2nL의 부피를 주입하십시오.
- 보상 압력을 15hPa로 조정하여 마이크로인젝터를 설정하고, 주입 시간0.5초로, 300~600hPa 사이의 사출 압력을 사용하여 사용되는 바늘에 따라 정확한 사출 량을 얻을 수 있다.
- 플라스틱 파이펫으로 배아는 5.2 단계에서 96mm 직경의 페트리 접시에 놓인 유리에 배아를 배치합니다.
참고: 너무 많은 E3 배지는 배아의 초리온으로 미세 주입 바늘의 적절한 침투를 방지할 수 있습니다. - 이전에설명된 바와 같이 2nL을 배아에 주입하는 바늘로 초리온및 노른자를 관통한다.
- 주입된 배아를 E3 배지로 페트리 접시에 넣고 28°C의 인큐베이터에 넣어 다음 날까지 개발할 수 있도록 합니다.
6. 박테리아와 파지 칵테일을 곁들인 제브라피시 배아의 미세 주입
참고: 전신 감염을 수행하기 위해 배아는 일반적으로 26 hpf 후에 시작되는 혈액 순환이 있어야합니다.
- 후 26 hpf (제브라피시 발달 단계는 Kimmel21을참조) pronase 용액을 가진 비반향 배아 는 2 mg / mL의 농도에서 E3 배지에서 pronase 분말을 용해하여 제조. 배아를 부드럽게 피펫하여 초리온을 부러뜨린다. pronase/E3 매체를 버리고 신선한 E3로 접시를 여러 번 헹군모든 pronase를 제거합니다.
- 주사 전에 트리카인을 함유하는 E3 배지에서 제브라피시 배아를 마취시킵니다.
- 마취배아를 1단계에서 준비한 트랙으로 피펫한다. 미세 겔 로딩 팁을 사용하여 배아를 측면 위치에 배치합니다.
- 5부에 설명된 바와 같이 P. aeruginosa 제제의 약 5 μL을 가진 미세 주입 바늘을 적재한다.
- 바늘을 큐비어 덕트의 시작점에 등대 삽입하여 노른자 낭 위로 퍼지기 시작합니다. 1-3 nL의 부피를 주입하고 볼륨이 덕트 내에서 직접 확장하고 순환으로 들어가는지 확인합니다.
- 매 50개의 주입 배아 후에, 1.5mL 원심분리기 관에 100 μL의 멸균 PBS를 주입하여 주사 부피가 동일하게 유지되었는지 확인합니다. LB 한천에 접종을 플레이트 (표 1참조) 37 °C 하룻밤 CFU를 평가하기 위해.
- 마이크로 주입 된 배아를 신선한 E3 배지 + PTU로 두 개의 깨끗한 페트리 접시에 옮기고 28 ° C에서 배양하십시오.
- 두 개의 선택된 시간 지점에서: 세균 주사 후 30 분 또는 3 시간, 인큐베이터에서 세균 주입 배아와 페트리 접시 중 하나를 꺼내 파지 칵테일 주입에 대한 6.3에 설명 된 대로 트랙에 정렬.
- 파지 칵테일의 약 5 μL(4단계에서 제조)을 미세한 젤 로딩 팁으로 마이크로 주입 바늘을 적재하고 마이크로 인젝터에 고정시킵니다(5단계 참조).
- 이전에 박테리아로 주입 된 배아의 Cuvier덕트에 파지 칵테일을 주입하십시오.
- 마이크로 주입 된 배아를 신선한 E3 배지 + PTU로 두 개의 깨끗한 페트리 접시에 옮기고 28 ° C에서 배양하십시오.
7. PAO1 및 파지주입된 배아의 세균 부담 평가
- 8마피에서 페트리 15개의 마취배아를 페트리 접시에서 1.5mL 원심분리기 튜브로 처리합니다.
- 마취용액을 PBS(PBSTritonX)에서 트리톤 X-100의 1% 트리톤 X-100의 300 μL로 대체하고 멸균 27-G 바늘로 인슐린 주사기를 통해 최소 15배 이상 전달하여 배아를 균질화한다.
- 희석된 균주100 μL을 멸균 PBS의 900 μL로 전송하여 멸균 PBS에서 균질화의 직렬 희석을 준비합니다.
- 자연적으로 amp-내성 PAO1 균주를 선택하려면, LB 한천에 희석제의 100 μL을 암피실린(100 μg/mL)으로 첨가하고, 밤새 37°C에서 배양한다.
- 다음날, 콜로니수를 카운트하고, 희석계에 곱하여 CFU의 총 수를 결정하고, CFU/감염된 배아의 평균 수를 얻기 위해 균질화된 배아의 수로 나눕니다.
8. PAO1 및 파지로 주입된 배아의 치사성 평가
- PAO1 감염의 치사성을 평가하기 위해, 스테레오 현미경의 밑에 20 hpi에서 주입된 태아를 점수하고 죽은 태아를 계산합니다 (백색/ 투명하지 않음).
- 20hpf에서 주입된 배아의 50%의 죽음을 결정하는 PAO1의 반 최대 치명적인 농도 50(LD50) 복용량을 계산합니다.
9. GFP+ PAO1 감염의 스테레오 현미경 경과 이미징을위한 배아 준비
- E3 용액 100mL에서 1.5% 낮은 녹는 아가로즈를 용해하여 살아있는 배아 이미징을 위한 금형을 준비합니다.
- 1% 트리카인을 첨가(표 1참조)를 첨가하여 배아를 마취시합니다.
- 4hpi에서 유리 바닥 접시에 플라스틱 파이펫으로 하나의 배아를 전달하고 따뜻한 저융 점 아가로즈 용액을 추가합니다.
- 유리 바닥 접시를 스테레오현미경아래에 배치하고 팁 위치로 배아를 원하는 방향으로 배치합니다. 플라스틱 파이펫을 사용하여 배아에 아가로즈 한 방울을 조심스럽게 추가하십시오.
- 아가로즈를 5-10분 동안 식히고 마취용액을 함유한 E3로 유리 바닥 접시를 부드럽게 채우어 배아를 촉촉하게 유지합니다.
- GFP+ 박테리아용 형광 필터(채널 488 nm)를 형광 스테레오현미경 아래에 배아와 함께 유리 바닥 접시를 놓습니다. 9, 14 및 18 마력에서 동일한 매개 변수를 추가로 수집 할 때까지 페트리 접시를 제거하지 마십시오.
10. 프로 염증 성 사이토카인의 표현 분석
- 20마피에서 트리카인 1x 용액으로 배아를 마취시키고 페트리 접시에서 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮기습니다.
- 연기 후드 에서 마취 용액을 제거하고 과니듐 염산염 시약의 200 μL로 대체합니다.
- 배아를 200 μL 파이펫을 통해 반복적으로 배관을 한 다음 멸균 27 G 바늘을 가진 인슐린 주사기로 적어도 15배 이상 배아를 균질화합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 시판되는 가미염 시약을 사용하여 균질화된 제브라피시 배아로부터 총 RNA를 추출합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 DNase I(RNase-free)의 1U/μL 2μL로 각 RNA 샘플의 1 μg를 처리합니다.
- DNase I의 1 μg를 사용하여 제조 업체의 지시에 따라 20 μL의 총 부피에서 시판 가능한 키트 (재료 표 참조)를사용하여 역전사 반응 (RT)을 치료했습니다.
- RT 반응의 1:6 희석의 1.5 μL을 사용하여 1x SYBR 그린 마스터믹스를 포함하는 10 μL의 총 부피에서 RT qPCR 반응을 수행한다. 정상화를 위해, 집 유지 유전자 rpl8 및 프로 염증 성 사이토카인에 대한 프라이머를 사용, TNF-α 및 IL-1β에 대한 프라이머를 사용합니다 (표 2참조). qPCR 프로토콜은 : 사이클 1 단계 1 : 95 ° C, 2 분, 한 번 반복; 사이클 2: 단계 1 95°C, 10s, 단계 2 55°C, 30s, 40x 반복; 사이클 3: 1 단계 72 °C, 15 분.
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Representative Results
여기에 제시된 결과 및 수치는이전에 설명된 바와 같이 cftr 모르폴리노스의 주입을 통해 생성된 CF 배아를 참조하고 5단계에서. CF 표현형을 검증하기 위해, 이전에 설명된바와 같이 심장, 간 및 췌장과 같은 내부 장기의 손상된 위치(도1)가고려되었다. 이전간행물(19)에보고된 바와 같이 WT 배아의 경우 유사한 결과를 얻었다.
PAO1에 감염된 CF 배아에서 파지 요법에 의해 세균부담이 감소하였다. 더욱이, 15개의 배아의 군을 균질화시킴으로써 8마피에서 세균부담을 평가하였다: PAO1 감염배아에 존재하는 박테리아(cfu/embryo)의 평균 수는 파지 투여 후 약 20%로 감소하여 파지 칵테일의 존재시보다 덜 심각한 감염을 확인하였다(도2).
치사성은 GFP+ 박테리아 PAO1에 감염된 CF 배아에서 파지 치료에 의해 감소되었다. 48hpf에서 CF 제브라피쉬 배아는 20마피(30cfu/embryo, 도 3A)이후50%의 치사성을 유발하는 용량으로 PAO1 균주의 GFP+ 박테리아를 주입하였다.+ 주사부위는 전신 감염을 일으키기 위해 노른자 또는 쿠비에르덕트였다. PAO1 감염에 대한 파지 치료는 동등하게 혼합 된 파지 칵테일 (300-500 pfu / 배아)의 2 nL을 주입하여 테스트하였다. 주사는 두 개의 다른 시간 지점에서 수행되었다: 30 분 (초기) 및 7 시간 (늦은) 세균 주사 후. 두 경우 모두, 치사도가 20마력으로 감소하여 파지 치료가 효과적이라는 것을나타낸다(도 3B).
실시간 이미징을 통해 형광 성 입체 현미경을 사용하여 GFP+ PAO1로 주입된 CF 배아의 감염 진행을 따르고 노른자 낭에 형광균의 확산을 줄이는 파지 요법의 효능을 보여주었습니다. CF+PAO1 주입배아는 4, 9, 14 및 18마피에서 GFP+ 박테리아 곱셈을 도 4의상부에 나타내고, 반면, 박테리아에 대한 파지 작용으로 인해 형광이 감소된 CF+PAO1+파지 배아(도4)에나타난다.
파지 요법은 CF 배아에서 PAO1 감염에 의해 생성 된 염증 반응을 감소. 우리는 또한 PAO1 및 PAO1 + 파지 주입에 의해 생성 된 면역 반응을 8 hpi에서 평가했습니다. 예상대로, qPCR 기술에 의해 분석된 프로 염증성 사이토카인 TNF-a 및 IL-1β의 발현은 파오1 주입 후 대조군에 비해 현저히 증가하였고, 파지 칵테일(그림5A,B)의공동 주입으로 감소하였다.
그림 1: cftr morpholinos(cftr-MOs)주입시 CF 배아의 생성 및 검증. (A)CF에서 심장의 위치 및 루핑장애는 야생형(WT) 배아에 비해 배아를 주입하였다. 심혼은 시투 혼성화 기술에 의해 cmlc2 발현으로시각화된다. (B) WT. 간 및 췌장에 비해 CF 배아의 간(arrows) 및 췌장의 손상된 위치는 시투 혼성화 기술에 의해 prox1a 발현으로 시각화된다. 스케일 바는 100 μm을 나타냅니다. 리브: 간; p : 췌장. 그림은19에서재인쇄되어 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PAO1 또는 PAO1+파지에 감염된 CF 배아의 세균 부담.. PAO1+파지 대 PAO1 배아의 cfu/배아의 상대적 비율이 주어집니다. 3개의 독립적인 실험의 평균 및 SD는 보고됩니다. 그림은19에서재인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PAO1에 감염된 CF 제브라피시 배아와 PAO1+파지의 치사성. (A)1세포 단계(CF 배아)에서 cftr-MO로마이크로주입된 48hpf 제브라피쉬 배아에서 LD50을 측정하고, 48hpf에서 감염되어 파오1 배양의 배양(cfu/embryo)을 함유하고 있다. 배아의 치사성은 20마치에서 관찰되었다. (B)48hpf에서 PAO1에 감염된 CF 배아의 20마피에서 치사성(PAO1+ Φ)으로치료하였다. 보고된 평균 및 SD는 각각 25-40개의 배아를 가진 6그리고 4개의 실험에서, 각각입니다. 각 변환은 치사율의 비율에 적용되었고 단방향 ANOVA가 던컨의 테스트를 사용했습니다. 그림은19에서재인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 제브라피시 파지 요법의 효능을 이미징합니다. PAO1 주사 (상부 배아) 다음 CF 배아에서 감염의 진행 및 PAO1 +파지 주입 배아 (바닥 배아) 4, 9, 14 및 18 hpi. 스케일 바는 100미크론을 나타냅니다. 그림은19에서재인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: PAO1 및 PAO+파지 투여에 따른 프로 및 항염증성 사이토카인의 발현. 48hpf에서 PAO1 및 PAO1+Φ로 주입된 CF 배아에서 8hpi에서 RT-qPCR에 의해 측정된 TNF-a(A) 및 IL-1β 유전자의 발현 수준은 rpl8의발현을 이용하여 정규화된다. 4개의 실험의 평균 및 SD는 보고됩니다. 통계적 유의성은 ANOVA에 의해 평가되었고, 덩컨의 테스트는 TNF-a(CF) 대 (CF+PAO1) p = 0.015*; (CF) vs (CF+PAO1+Φ) p = 0.019*; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0.77 n.s.; IL-1β (CF) 대 (CF + PAO1) p = 0.00014 ***; (CF) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0.00068***; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0.031*. 그림은19에서재인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 솔루션 | 준비 |
| 마취 육수 용액 25X | 4 증류 H2O에서 트리카인의 mg / mL. |
| 마취 작업 솔루션 1X | 증류H2O 트리카인 재고 용액 25X에 희석하여 증류된H2O의 1X 농도(0.16 mg/mL) 트리카인에 도달할 수 있습니다. |
| CsCl d=1.3 | 50mL TN20.49 g |
| CsCl d=1.4 | 50mL TN20.28 g |
| CsCl d=1.5 | 50mL TN에서 34.13 g |
| CsCl d=1.6 | TN 50mL에서 41.2 g |
| 제브라피시 배아용 E3 배아 배지 | 1 L 1of E3 (증류 H2O로50배 재고를 희석) + 0.05% 메틸 블루의 200 μl. RT에 저장합니다. |
| E3 배아 중형 스톡 솔루션(50X) | 73.0 g NaCl, 3.15 g KCl, 9.15 g CaCl2, 9.95 g MgSO4 5 L 에서 증류 H2O. RT. |
| LB 한천 | 트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g, 나Cl 5g, 10g/L 한천 |
| LB 국물 | 1L: 950mL H2O, 트립톤 10g, NaCl 10g, 효모 추출물 5g |
| PBST | PBS 1X + 트리톤 X 1% |
| 생리적 용액 | 0.9% NaCl |
| 착색 차단 스톡 솔루션 10배 | 얼룩말 피시 배아를 위한 E3 배아 배지에서 0.3 mg/mL 페닐 티오레아(PTU) 분말 |
| Pronase 스톡 솔루션 5X | 제브라피시 배아용 E3 배아 배지에 5 mg/mL pronase 분말 |
| TN 버퍼 | 10mM 트라이스 HCl pH 8.0, 150m MM NaCl |
표 1: 솔루션 준비.
| 유전자 이름 | 프라이머 시퀀스 |
| TNF 알파 Fw | 5'-TGCTTCACGCTCCATAAGACC-3' |
| TNFalpha 레브 | 5'-CAAGCCACCTGAAAAAAAG-3' |
| IL1 베타 Fw | 5'-TGGACTTCGCAGCACAAATG-3' |
| IL1 베타 레브 | 5'-CGTTCACTTCACTCCTGGATG-3' |
| rpl8 Fw | 5'-CTCCGTCTTCAAAGCCCAT-3' |
| rpl8 레브 | 5'-TCCTTCACGATCCTTGAT-3' |
표 2: RT-qPCR에 사용되는 프라이머.
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Discussion
이 원고에서, 우리는 제브라피시 배아에 있는 P. aeruginosa (PAO1) 감염을 능력을 발휘하는 프로토콜을 설명하고 그것을 해결하기 위하여 PAO1를 감염시킬 수 있는 이전에 확인된 파지의 칵테일으로 파지 치료를 적용하는 방법을 기술했습니다. 항생제 치료에 대 한 대안으로 박 테리 오 파 지의 사용은 지난 몇 년 이후 증가 관심의 되었습니다. 이것은 주로 공중 보건을 위한 심각한 문제점을 구성하는 다중 약 저항하는 (MDR) 세균성 감염의 확산 때문입니다. 물론, 이 작품의 범위는 인간이 아닌 동물 모델에 파지 요법을 적용하는 것으로 제한됩니다. 그러나, 우리는 CFtr 유전자를 표적으로 하는 모르폴리노의 주입을 가진 낭포성 섬유증 제브라피시 모형을 생성했습니다, 또한 P.aeruginosa 감염에 영향을 받기 쉬운 병리 유전학 모형에서 파지 치료의 효험을 보여주는.
전작과 마찬가지로 파지 요법을 쉽게 달성할 수 있었고, 시험관 내및 생체 내 P. aeruginosa를 감염시킬 수8있는 다른 파지를 분리하고 특성화하였다. 이 단계는 파지의 항균 활성을 얻기 위한 기본이다. 특정 세균균을 감염시킬 수 있는 파지의 격리 및 특성화는 파지 치료 적용의 중요한 단계입니다. 실제로, 동물 / 인간 호스트에 파지의 부작용을 피하기 위해, 대신 그 lysogenic의 lytic 파지를 사용할 필요가있다. 가장 중요한 것은, 항생 저항, 독성 및 유전자 전송을 위한 것과 같이 유해한 유전자의 존재를 위한 파지 게놈을 검사할 필요가 있습니다.
파지 치료는 이미 성공적으로 다른 동물 모델에서 사용되었습니다. 우리는 제브라피쉬가 포유류 모델이 아니며 파지의 일부 영향이 다를 수 있다는 것을 의식하고 있습니다. 그러나, 제브라피쉬는 호중구와 대식세포23의보존된 인구를 가진 인간에 필적하는 타고난 면역 계통을 가지고 있기 때문에, 우리는 면역 반응에 대한 데이터가 인간에서 재현될 수 있었다는 것을 추측합니다. 더욱이, 제브라피쉬는 세균성 감염 연구를 위해 잘 평가되고, 파지 치료 효능을 위한 테스터로서의 사용은 치료 접근법에 유망할 수 있습니다. 실제로, 박테리아가 쿠비에르덕트를 통해 순환으로 주입되거나, 또는17에보고된 바와 같이 국소화되는 경우 감염은 전신일 수 있다. 우리는 전신 및 국소 감염 둘 다 수행하고 파지 치료 응용 프로그램에 따라 둘 다 감소한 증가한 치사및 세균성 부담을 유사하게 생성했다는 것을 보여주었습니다. 더욱이,GFP+ 형광 PAO1 박테리아가 주입되었기 때문에, 파지가 주입되었을 때 형광균의 감소를 확인하는 배아 발달의 다른 시점에서 감염을 따르기 쉬웠다.
우리의 지식에, 이것은 제브라피시에 있는 파지 치료 응용프로그램의 첫번째 설명입니다, CF 배경에 있는 P. aeruginosa에 대하여 파지 항균 활동의 데모를 위한 부가 가치, 즉 이 세균성 감염에 특히 영향을 받기 쉽습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 이탈리아 낭포성 섬유증 재단 (FFC #22/2017)에 의해 지원되었다; 아소시아지오네 "글리 아미치 델라 리티" 카스키고와 FFC #23/2019; 피우 온루스 라 마노 테사 온루스에서 Un respiro).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
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