Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Phage Terapi Ansökan att motverka Pseudomonas aeruginosa infektion i cystisk fibros Zebrafish Embryon

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61275

Summary

Presenteras här är ett protokoll för Pseudomonas aeruginosa infektion och terapi ansökan i cystisk fibros (CF) zebrafisk embryon.

Abstract

Antimikrobiell resistens, en stor följd av diagnostisk osäkerhet och antimikrobiell överprescription, är en alltmer erkänd orsak till allvarliga infektioner, komplikationer och dödlighet över hela världen med en enorm inverkan på vårt samhälle och på hälso-och sjukvårdssystemet. I synnerhet patienter med nedsatt immunförsvar eller redan existerande och kroniska patologier, såsom cystisk fibros (CF), utsätts för täta antibiotika behandlingar för att kontrollera infektioner med utseende och diffusion av multidrug resistenta isolat. Därför finns det ett akut behov av att ta itu med alternativa terapier för att motverka bakteriella infektioner. Användning av bakteriofafer, bakteriernas naturliga fiender, kan vara en möjlig lösning. Protokollet som beskrivs i detta arbete beskriver tillämpningen av terapi mot Pseudomonas aeruginosa infektion i CF zebrafish embryon. Zebrafish embryon var infekterade med P. aeruginosa att visa att terapi är effektivt mot P. aeruginosa infektioner eftersom det minskar dödlighet, bakteriell börda och pro-inflammatoriska immunsvar i CF embryon.

Introduction

Fagen terapi, användningen av naturliga fiender av bakterier för att bekämpa bakteriella infektioner, är garnering förnyat intresse som bakteriell resistens mot antibiotika blir utbredd1,2. Denna terapi, som används i årtionden i Östeuropa, kan betraktas som en kompletterande behandling till antibiotika i bota lunginfektioner hos patienter med CF och ett möjligt terapeutiskt alternativ för patienter infekterade med bakterier som är resistenta mot alla de närvarande i bruk antibiotika2,3. Fördelar med antibiotikabehandling är att bakteriofakom förökar sig på infektionsstället, medan antibiotika metaboliseras och elimineras från kroppen4,5. Faktum är att administrationen av cocktails av virulenta fager isolerade i olika laboratorier har visat sig vara effektiva vid behandling av Pseudomonas aeruginosa infektioner i djurmodeller så olika som insekter och däggdjur6,7,8. terapi visade sig också kunna minska bakteriebördan i brännsår infekterade med P. aeruginosa och Escherichia coli i en randomiserad klinisk prövning9.

Zebrafisk (Danio rerio) har nyligen framträtt som en värdefull modell för att studera infektioner med flera patogener, inklusive P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus och Burkolderia cepacia12,13. Genom att mikroinjicita bakterier direkt i embryotblodcirkulationen 14 är det lätt att etablera en systemisk infektion som motverkas av zebrafisken medfödda immunsystemet, som är evolutionärt bevarat med neutrofiler och makrofaggenerering som liknar den mänskliga motsvarigheten. Dessutom, under den första månaden av livet, zebrafish embryon saknar adaptiv immunsvar, vilket gör dem idealiska modeller för att studera den medfödda immunitet, som är den kritiska försvarsmekanismen i mänskliga lunginfektioner15. Zebrafish uppstod nyligen som ett kraftfullt genetisk modellsystem för att bättre förstå CF-instävlet och för att utveckla nya farmakologiska behandlingar10,16,17. CF-zebrafiskmodellen av CFTR knock-down genererad med morfolininjektion i zebrafisk presenterade ett dämpat andningssprängningssvar och minskad neutrofil migration10, medan cftr knock-out leder till försämrad inre organposition och förstörelsen av den exokrina bukspottkörteln, en fenotyp som speglar människans sjukdom16,17. Av största intresse var konstaterandet att P. aeruginosa bakteriebörda var betydligt högre i cftr-förlust-of-funktion embryon än i kontroller vid 8 timmar efter infektion (hpi), som paralleller de resultat som erhållits med möss och mänskliga bronkial epitelceller2,18.

I detta arbete visar vi att terapi är effektivt mot P. aeruginosa infektioner i zebrafish embryon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vuxna zebrafiskar (Danio rerio) från AB-stammen (European Zebrafish Resource Center EZRC) bibehålls enligt internationell (EU-direktiv 2010/63/EU) och nationella riktlinjer (italienskt dekret 4mars 2014, n. 26) om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål. Standardförhållanden ställs i fiskanläggningen med en 14 h av ljus/10 h mörk cykel och tankvattentemperatur vid 28° C.

1. Beredning av lösningar och verktyg

  1. Bered en 50x stamlösning och 1x arbetslösningar för E3 embryo medium för växande zebrafisk embryon (se tabell 1).
  2. Gör pigmenteringsblockeringslösning, för att blockera embryopigmenteringen från 24 timmar efter befruktningen (24 hpf) (se tabell 1).
  3. Förbered 25x lager och 1x arbets Tricane anestetika lösning enligt beskrivningen i tabell 1.
    OBS: För att undvika att lösningen som kan skada stamlösningen upprepas och tinas upp, gör du alikvoter på 2 mL på 25x trikain och förvara dem vid -20 °C.
  4. Förbered spår för embryomikroinjektion genom att lösa upp 1 g agaros i 100 mL destillerat H2O i en mikrokroverbar kolv eller flaska. Mikrovågsugn i 1-3 min tills agaros är helt upplöst.
  5. Position zebrafisk mikroinjektionsformar (se Tabell of Materials) vänd upp och ner i en Petriskål (90 mm x 15 mm) och täck hela ytan genom att hälla den flytande agarosgel med en bredd på cirka 10 mm.
  6. Ta bort formen när agarose har stelnat. Fyll petriskålen med 1x E3 embryo medium. Denna kan förvaras vid 4 °C i ungefär en vecka. Ersätt före användning med det färska E3-medium som innehåller Trikain.
    OBS: Äldre formar kan utveckla svampar eller bakteriell kontaminationer.
  7. Använd brandpolerade 10 cm borosilikat kapillärer för att förbereda nålar för mikroinjektion och säkra dem till mikropipettedragaren genom att dra åt handtagen. Ställ in pullern med följande inställningar: heat 500, hastighet 100, tid 150, drag 150.

2. P. aeruginosa (PAO1) inokulat beredning

  1. Inokulera 1 koloni av GFP+P. aeruginosa stam PAO119 i 5 mL lb buljong (se tabell 1) och växa över natten vid 37 °C med skakning (200 rpm).
  2. Späd ovanstående övernattningskultur till OD600 = 0,1 i 10 mL lb-buljong och väx till OD600 = 0,5 vid 37 °C med skakning (200 rpm).
  3. Centrifugera 2 mL av kulturen i 2 min vid 4 °C vid 16 100 x g och återanvänd cellpelletsen till OD600 = 1, motsvarande ca 1 x 109 cfu/mL, i 1 mL av den fysiologiska lösningen (se tabell 1).
  4. Späd cellupphängningen till ca 5 x 107cfu/mL i fysiologisk lösning och förvara vid 4 °C.

3. Beredning av fanbestånd

  1. Inokulera 1 koloni av P. aeruginosa stam PAO1 i 5 mL lb buljong och inkubera över natten vid 37 °C med skakningar. Späd över nattens odling till OD600 = 0,01 i 500 mL lb-buljong och väx vid 37 °C med skakning till OD600 = 0,05, motsvarande ca 2,5 x 107 cfu/mL.
  2. Till den utspädda kulturen av P. aeruginosa, tillsätt ca 1,25 x 107 fager, för att få den mångfald av infektion (M.O.I.) av 10-3. Inkubera vid 37 °C med skakning tills OD600 sjunker till ca 0,1-0,3 (i ca 3 till 5 h, beroende på vilken fat som används).
    OBS: Fyra fagen valdes ut för detta experiment som infekterar PAO1-stam: Två Podoviridae, GenBank-anslutningsnummer vB_PaeP_PYO2, MF490236 och vB_PaeP_DEV, MF490238, och två Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 och vB_PaeM_E217, MF490240. Utför stegen nedan för varje fa: ar individuellt.
  3. Inkubera lysate med 1 mg/mL DNase och RNase i 30 min vid 37 °C. Centrifugera vid 5 000 x g i 30 min vid 4 °C och återkräv försiktigt supernatanten (SN). Filtrera SN:t med ett filter som har 0,8 μm pordiameter.
  4. Till SN lägger du till 58 g/L av NaCl och 105 g/L av PEG6000. Lös upp med omrörning vid RT 20 min och håll den sedan över natten vid 4 °C. Centrifugera vid 20, 000 x g i 30 min vid 4 °C för fagfällning. Avlägsna SN:t och lös försiktigt upp fagens pellet i 15 mL TN-buffert (se tabell 1).
  5. Rena fager med CsCl densitet gradient som beskrivs i steg nedan.
    1. I en polyallomer ultracentrifugrör för SW41 rotor, förbereda en CsCl steg densitet gradient genom stratifying 2 mL av de fyra CsCl lösningar som beskrivs i tabell 1.  Tillsätt 3,5 mL falsuspension i vart och ett av de 4 rören.
      OBS: CsCl är giftigt, anta ordentliga säkerhetsrutiner för att hantera och kassera den.
    2. För in rören i rotorn och se till att rören är balanserade (viktskillnaden mellan de två vändvända rören måste ≤ 0,01 g).
    3. Centrifugera i 2 h vid 4 °C och 100, 000 x g (25 000 varv/min för SW41 rotor). Efter centrifugeringen, ta långsamt bort rören och immobilisera dem försiktigt på ett stöd. Med hjälp av en spruta med 19 G-nål, dra upp det vita/opalescent bandet som är beläget vanligen mellan d=1.5 och d=1,4 densitetsregionen.
    4. Överför suspensionerna från sprutan till nya polyallomerrör för SW60-rotorn och använd d=1.4-lösningen för att exakt balansera rören.
    5. Centrifugera upphängningen vid 4 °C och 150,0000 x g (38,000 rpm för SW60 rotorn) i minst 16 h.
    6. Samla det synliga bandet enligt ovan (se steg 3.3.3) och för över dem till dialysrör med 6 000 Da-avklippta. Dialyze det erhållna synliga bandet 2x för 20 min mot 500 mL vatten och över natten mot 500 mL TN buffert. Filtrera med ett 0,22 μm porfilter och förvara vid 4 °C.

4. Phage cocktail förberedelse

  1. Gör en blandning av fyra fas som infekterar stammen PAO1, tidigare isolerade och kännetecknas8. Innan blandning, uppskatta titer av varje faage lager genom plack assay20.
  2. Montera fagen cocktail, med en övergripande titer av 5 × 108 pfu /mL, genom att lika blanda fyra fager preparat på samma pfu / mL omedelbart före varje experiment, för att säkerställa noggranna fager titers.

5. Insamling och beredning av zebrafisk embryon för cftr morpholinos mikroinjection

OBS: Samla in 1-2 cellembryon från vildtyps zebrafisk för cftr morpholinos (cftr-MOs) mikroinjektion.

  1. Två dagar före det bakteriella mikroinjektionsexperimentet, sätt upp avelspar och samla in embryon enligt tidigare beskrivning21. Vuxna zebrafiskar (Danio rerio) av AB-stammen köptes från European Zebrafish Resource Center, EZRC.
  2. Dagen efter, samla embryon omedelbart efter befruktning med en plastpipett eller med hjälp av en finmaskig sil. Placera de insamlade embryona i en petriskål som innehåller E3 embryomedium och försiktigt ta bort skräpet med en plastpipett för att undvika kontaminering som kan skada embryoutvecklingen.
  3. Bered 5 μL morpholino-injektionslösning genom att späda ut de två morfolinolagerlösningarna (1 mM) i sterilt vatten till en slutkoncentration på 0,25 pmol/embryo ATG-MO + 0,25 pmol/embryo skarv-MO. För att spåra embryoinjektionen, tillsätt 0,5 μL fenolrött till morpholino injektionslösningsmixen.
  4. Ladda en mikroinjektionsnål med cirka 5 μL av morpholino mix-lösningen med hjälp av en 20 μL mikropipette med en fin gel lastningsspets. Säkra nålen till mikromanipulatorn som är ansluten till ett stativ och placera den under ett stereomikroskop.
    OBS: Det är inte nödvändigt att lösningen når spetsen på nålen som trycket av microinjector pumpen kommer att driva den.
  5. Klipp av nålspetsen genom att skära nålspetsen med finsteril pincett. Mät diametern på droppen med hjälp av en skala bar i okulär av mikroskopet. Alternativt, skapa en droppe mineralolja på en mikrometer glida och ställa in mikroinjektionsvolymen genom att injicera lösningen i olje-droppen för att utvärdera droppstorleken. Använd en droppe med en diameter på 156 μm för att injicera en volym på 2 nL.
  6. Ställ in mikroinjektorn genom att justera kompensationstrycket till 15 hPa, injektionstid till 0,5 s, och injektionstryck mellan 300 och 600 hPa för att få rätt injektionsvolym beroende på vilken nål som används.
  7. Med en plastpipett ordna embryona från steg 5,2 på ett glas placerad i en 96 mm diameter Petriskål.
    OBS: För mycket E3-medium kommer att förhindra korrekt penetration av mikroinjektionsnålen i embryonas chorion.
  8. Penetrera chorion och sedan äggulan med nålen för att injicera 2 nL i embryot som beskrivits tidigare22.
  9. Placera injicerade embryon i en petriskål med E3-medium och lägg dem i en inkubator vid 28 °C för att låta dem utvecklas till dagen efter.

6. Mikroinjektion av zebrafisk embryon med bakterier och cocktail

OBS: För att utföra en systemisk infektion måste embryot ha blodcirkulation som vanligtvis startar efter 26 hpf.

  1. Efter 26 hpf (för zebrafisk utvecklingsstadier hänvisar till Kimmel21) degreler embryon med pronase lösning beredd genom att lösa upp pronaspulver i E3 medium vid en koncentration av 2 mg/mL. Försiktigt pipettera embryona för att bryta chorion. Kassera pronase/E3-mediet och skölj skålen flera gånger med färsk E3 för att ta bort all pronase.
  2. Söva zebrafisk embryon i E3 medium som innehåller Tricaine cirka 5 min före injektioner.
  3. Pipettera de anestesiserade embryona i spåret som bereds i steg 1. Använd en fin gel lastning spets för att linje embryona i lateral position.
  4. Ladda en mikroinjektionsnål med cirka 5 μL av preparatet P. aeruginosa enligt beskrivningen i del 5.
  5. För in nålen dorsally till startpunkten för kanalen av Cuvier där den börjar sprida sig över gulesäcken. Injicera en volym på 1-3 nL och se till att volymen expanderar direkt inom kanalen och går in i cirkulationen.
  6. Injicera en droppe av bakterierna i ett 1,5 mL centrifugrör med 100 μL steril PBS för att kontrollera om injektionsvolymen förblir densamma, om det är ungefär 1,5 mL centrifugeringsrör med 100 μL steril PBS för att kontrollera om injektionsvolymen förblir densamma. Plätera inokulatet på LB-agar (se tabell 1) vid 37 °C över natten för att bedöma CFU.
  7. Överför de mikroinjekterade embryona i två rena petriskålar med färskt E3 medium + PTU och inkubera dem vid 28 °C.
  8. Vid två valda tidspunkter: 30 min eller 3 h efter bakterieinjektionen, ta ut en av Petriskålarna med bakterieinsprutade embryon från inkubatorn och rikta in dem i spåret enligt beskrivningen i 6.3 för fagcocktailinjektionen.
  9. Ladda en mikroinjektionsnål med cirka 5 μL av fagacocktailen (beredd i steg 4) med en fin gelmatspets och fixera den på mikroinjektorn (se steg 5).
  10. Injicera fagen cocktail i kanalen av Cuvier av embryon som tidigare injicerats med bakterier.
  11. Överför de mikroinjekterade embryona i två rena petriskålar med färskt E3 medium + PTU och inkubera dem vid 28 °C.

7. Utvärdering av bakteriebördan för embryon som injiceras med PAO1 och fagen

  1. Vid 8 hpi, pipett 15 sövda embryon från Petri skålen till en 1,5 mL centrifugrör.
  2. Ersätt anestesilösningen med 300 μL på 1% Triton X-100 i PBS (PBSTritonX) och homogenisera embryona genom att skicka dem minst 15x genom en insulinspruta med en steril 27- G-nål.
  3. Bered serieutspädningar av homogenat i steril PBS genom att överföra 100 μL av det utspädda homogenatet till 900 μL steril PBS.
  4. För att välja för den naturligt amp-resistenta PAO1-stammen, plåt 100 μL av spädningarna på LB-agar tillsatt med ampicillin (100 μg/mL), och inkubera vid 37 °C över natten.
  5. Dagen efter, räkna antalet kolonier, multiplicera med utspädningsfaktorn för att bestämma det totala antalet CFU, och dividera med antalet embryon som homogeniserats för att erhålla det genomsnittliga antalet CFU/smittat embryo.

8. Utvärdering av dödliga embryon som injiceras med PAO1 och fagen

  1. För att utvärdera vådigheten hos PAO1-infektionen, poäng de injicerade embryona vid 20 hpi under ett stereomikroskop och räkna för de döda embryona (vita/inte transparenta).
  2. Beräkna halv-maximal dödliga koncentrationen 50 (LD50) dos av PAO1 som bestämmer död 50% av injicerade embryon vid 20 hpf.

9. Embryopreparering för stereomikroskop timelapse-avbildning av GFP+ PAO1-infektion

  1. Preparate formen för levande-embryo imaging genom att lösa upp 1,5% låg smältning agaros i 100 mL E3-lösning.
  2. Lägg till 1% Tricaine (se tabell 1) för att söva embryona.
  3. Vid 4 hpi överföra ett embryo med en plastpipett i en glasbotten skålen och tillsätt den varma lågsmältning-punkt agaroslösning.
  4. Placera glasbottenskålen under ett stereomikroskop och med en spets placera embryot i önskad orientering. Använd en plastpipett för att noggrant lägga till en droppe agaros på embryot.
  5. Låt agarosen svalna i 5-10 min och fyll försiktigt glasbottenskålen med E3 som innehåller anestesilösningen för att hålla embryot fuktigt.
  6. Placera glasbottenskålen med embryot under det fluorescerande stereomikroskopet med ett fluorescerande filter (kanal 488 nm) för GFP+ bakterier. Ta inte bort Petriskålen förrän ytterligare förvärv med samma parametrar vid 9, 14 och 18 hpi.

10. Uttrycksanalyser av proinflammatoriska cytokiner

  1. Vid 20 hpi bedöva embryona med trikain 1x lösning och överföra dem från Petri skålen till en 1,5 mL centrifug röret.
  2. Under en rökhuv avlägsna narkoslösningen och ersätt med 200 μL guanidiumhydrokloridreagens.
  3. Homogenisera embryon genom att pipettera dem repetitivt genom en 200 μL-pipett först och sedan minst 15x med en insulinspruta med en steril 27 G-nål.
  4. Extrahera totalt RNA från homogeniserade zebrafiskembryon med hjälp av en kommersiellt tillgänglig guanidiumhydrokloridreagens enligt tillverkarens anvisningar.
  5. Behandla 1 μg av varje prov av RNA med 2 μL av 1U/μL DNase I (RNase-fri), efter tillverkarens anvisningar.
  6. Använd 1 μg DNase I behandlat RNA för omvänd transkriptionsreaktion (RT) med användning av kommersiellt tillgänglig sats (se Tabell of Materials), i en total volym av 20 μL enligt tillverkarens anvisningar.
  7. Utför RT qPCR-reaktion i en total volym på 10 μL innehållande 1x SYBR Green mastermix med användning av 1,5 μL av en 1:6 utspädning av RT-reaktion. För normaliseringsändamål, använd grundtalen för de hushållande generna rpl8 och för proinflammatoriska cytokiner, använd primers för TNF-α och IL-1β (se tabell 2). qPCR-protokollet var: cykel 1 steg 1: 95 °C, 2 min, upprepa en gång; cykel 2: steg 1 95 °C, 10 s, steg 2 55 °C, 30 s, upprepa 40x; cykel 3: steg 1 72 °C, 15 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultat och siffror som presenteras här hänvisas till CF embryon som genereras genom injektion av cftr morpholinos som beskrivstidigare 10 och i steg 5. För att validera CF fenotyp, ansågs nedsatt position av inre organ som hjärta, lever och bukspottkörtel som tidigarebeskrivits 17 (Figur 1). Liknande resultat erhölls i fall av WT embryon som rapporterats i vår tidigare publikation19.

Bakteriell börda minskades genom fagen terapi i CF embryon infekterade med PAO1. Vidare utvärderade vi bakteriebördan vid 8 hpi genom att homogenisera grupper om 15 embryon: det genomsnittliga antalet bakterier (cfu/embryo) som förekommer i PAO1-infekterade embryona reducerades till ca 20% efter behandling med fagenad administration, vilket på så sätt bekräftade en mindre allvarlig infektion i närvaro av fagen cocktail (Figur 2).

Dödlighet minskades genom terapi i CF embryon infekterade med GFP+ bakterier PAO1. CF-zebrafiskembryon vid 48 hpf injicerades med GFP+ bakterier av PAO1-stammen vid en dos som orsakade 50% dödlighet efter 20 hpi (30 cfu/embryo, Figur 3A). Injektionsstället var äggulan eller cuviers kanal för att generera en systemisk infektion. Fager terapi mot PAO1 infektion testades genom att injicera 2 nL av den lika blandade fagen cocktail (300-500 pfu/embryo). Injektionen utfördes vid två olika tidpunkter: 30 min (tidigt) och 7 timmar (sent) efter bakteriell injektion. I båda fallen minskades lethality vid 20 hpi, vilket indikerar att fagen terapi är effektiv (Figur 3B).

Med levande imaging, med hjälp av en fluorescerande stereomikroskop, följde vi också utvecklingen av infektionen i CF embryon injiceras med GFP+ PAO1 och visade effekten av terapi för att minska spridningen av fluorescerande bakterier över gulesäcken. CF+PAO1 injicerat embryo med GFP+-bakteriemultiplikation vid 4, 9, 14 och 18 hpi visas i ovansidan av figur 4, medan CF+PAO1+phages embryo med minskad fluorescens på grund av fagverkan mot bakterier visas i bottendelen (bild 4).

Fagen terapi minskade inflammatoriska svar som genereras av PAO1 infektion i CF embryon. Vi utvärderade också immunsvaret som genereras av PAO1 och PAO1 + fagen injektion vid 8 hpi. Som väntat ökades uttrycket av de proinflammatoriska cytokinerna TNF-a och IL-1β som analyserades av qPCR-tekniker signifikant efter PAO1-injektion i jämförelse med kontroller, medan den reducerades med co-injection av fagcocktailen (Figur 5A,B).

Figure 1
Figur 1: Generering och validering av CF-embryon vid injektion av CFTR Morpholinos (cftr-MOs). (A) Försämrad position och looping av hjärtat i CF injicerade embryon i jämförelse med wild-type (WT) embryon. Heart visualiseras med cmlc2-uttryck genom in situ hybridiseringsteknik. (B) Nedsatt position i levern (pilar) och bukspottkörteln i CF embryon i jämförelse med WT. Lever och bukspottkörteln visualiseras med prox1a uttryck genom in situ hybridisering tekniker. Skalstreck indikerar 100 μm. liv: lever; p: bukspottkörtel. Figuren är omtryckt från19 Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Bakteriebörda i CF-embryon som är infekterade med PAO1 eller PAO1+fagen. Den relativa andelen cfu/embryo i PAO1+fager vs PAO1 embryon ges. Medelvärdet och SD för tre oberoende experiment rapporteras. Figuren är omtryckt från19. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Dödlighet hos CF-sebrafiskarmbryor infekterade med PAO1 och med PAO1+fag.  (A) Bestämning av LD50 i 48 hpf zebrafisk embryon microinjected med cftr-MO på 1-cell stadium (CF embryon) och smittade vid 48 hpf med 2 nL av en kultur av PAO1 som innehåller ökande antal bakterier (cfu/embryo). Dödlighet av embryona observerades vid 20 hpi. (B) Dödlighet vid 20 hpi CF-embryon som är infekterade med PAO1 vid 48 hpf och som behandlats med fagen cocktail (PAO1+ Φ). Medelvärdet och SD rapporterade är från sex och fyra experiment, respektive, var och en med 25-40 embryon. Vinkelomvandling tillämpades på andelen dödlighet och enkelriktad ANOVA följt av Duncans test användes. Figuren är omtryckt från19. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Avbildning av effekten av fagterapi hos zebrafisk. Progression av infektionen i CF embryon efter PAO1 injektion (övre embryot) och effekt av terapi i PAO1 +fags injicerade embryon (botten embryo) vid 4, 9, 14 och 18 hpi. Skalstreck indikerar 100 mikrometer. Figuren är omtryckt från19. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Uttryck för pro- och antiinflammatoriska cytokiner efter PAO1 och PAO+fagtillförsel. Uttrycksnivåer av generna TNF-a (A) och IL-1β som uppmätts av RT-qPCR vid 8 hpi i CF-embryon som injicerats med PAO1 och PAO1+Φ vid 48 hpf och normaliserades med hjälp av uttrycket av rpl8. Medelvärdet och SD av fyra experiment rapporteras. Statistisk signifikans bedömdes av ANOVA följt av Duncans test: för TNF- a (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,015*; (CF) vs (CF+PAO1+Φ) p = 0,019*; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,77 n.s.; för IL-1β (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,00014***; (CF) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,00068***; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,031*. Figuren är omtryckt från19. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Lösningar Förberedelser
Anaestsmedel stamlösning 25X 4 mg/mL trikain i destillerat H2O.
Bedövning arbetslösning 1X späd i destillerat H2O trikain stamlösningen 25X beredning för att nå 1X-koncentrationen (0.16 mg/mL) Trikain av destillerat H2O.
CsCl d=1,3 20,49 g i 50 mL TN
CsCl d=1,4 20,28 g i 50 mL TN
CsCl d=1,5 34,13 g i 50 mL TN
CsCl d=1,6 41,2 g i 50 mL TN
E3 embryo medium för zebrafisk embryo 1 L 1of E3 (späd 50X-lagret med destillerat H2O) + 200 μl av 0,05% metylblått . Förvara på RT.
E3 embryo medium stamlösning (50X) 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl , 9,15 g CaCl2 , och 9,95 g MgSO4 i 5 L av destillerat H2O. Förvara på RT.
LB-agar 10 g/L tryptone, 5 g/L jästextrakt, 5 g/L NaCl, 10 g/L-agar
LB buljong för 1L: 950 mL H2O, 10 g Tryptone, 10 g NaCl, 5 g Jästextrakt
PBST PBS 1x + Triton X 1%
Fysiologisk lösning 0,9% NaCl
Pigmentering blockerande stamlösning 10X 0,3 mg/mL phenyl thiourea (PTU) pulver i E3 embryo medium för zebrafisk embryo
Pronase stamlösning 5X 5 mg/mL pronase pulver i E3 embryo medium för zebrafisk embryo
TN-buffert 10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl

Tabell 1: Utarbetande av lösningar.

Genens namn Primer-sekvens
TNF-alfa Fw 5'-TGCTTCACGCTCCATAAGACC-3'
TNFalpha Rev 5'-CAAGCCACCTGAAGAAAAGG-3'
IL1-beta Fw 5'-TGGACTTCGCAGCACAAAATG-3'
IL1-beta Rev 5'-CGTTCACTTCACGCTCTTGGATG-3'
rpl8 Fw 5'-CTCCGTCTTCAAAGCCCAT-3'
rpl8 Rev 5'-TCCTTCACGATCCCCTTGAT-3'

Tabell 2: Grund- och primrar som används för RT-qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta manuskript beskrev vi protokollet att utföra P. aeruginosa (PAO1) infektion i zebrafish embryon och hur man tillämpa terapi med en cocktail av fager som tidigare identifierats som kan infektera PAO1 att lösa det. Användningen av bakteriofafer som ett alternativ till antibiotikabehandlingar har varit av allt större intresse sedan de senaste åren. Detta beror främst på att multiresistenta (MDR) bakterieinfektioner sprids, som utgör en allvarlig fråga för folkhälsan. Naturligtvis är omfattningen av detta arbete begränsad till tillämpningen av fanterapi till en djurmodell och inte till människor. Vi genererade dock en cystisk fibros zebrafisk modell med injektion av en morpholino inriktning cftr genen, visar effekten av terapi också i en patogenetiska modell särskilt mottagliga för P.aeruginosa infektion.

Det är att notera att vi lätt skulle kunna uppnå terapi, som i ett tidigare arbete, vi isolerade och kännetecknas olika fager kunna infektera P. aeruginosa både in vitro och in vivo8. Detta steg är grundläggande för att erhålla den antimikrobiella aktiviteten av fagen. Isoleringen och karakterisering av fagen kunna infektera en specifik bakteriell stam är kritiska steg av fagen terapi ansökan. Indeed, för att undvika negativa effekter av fagen på djur/ människa värd, är det nödvändigt att använda lytiska fagener i stället för de lysogenic. Viktigast är det nödvändigt att kontrollera fagen genom för förekomsten av skadliga gener som de för antibiotikaresistens, virulens och genöverföring.

Faageterapi har redan framgångsrikt använts i andra djurmodeller. Vi är medvetna om att zebrafisk inte är en däggdjursmodell och vissa effekter av kan vara annorlunda. Men eftersom zebrafisk har ett medfött immunsystem jämförbart med det mänskliga med en bevarad population av neutrofiler och makrofager23, spekulerar vi att uppgifterna om immunsvaret kan vara reproducerbara hos människor. Dessutom är zebrafisk väl bedömas för bakteriella infektion studier, dess användning som testare för terapi effekt kan vara lovande för terapeutiska metoder. I själva verket kan infektionen vara systemisk om bakterier injiceras i cirkulationen genom kanalen av Cuvier, eller lokaliserade som rapporterats17. Vi utförde både systemiska och lokaliserade infektioner och visat att de på samma sätt genereras ökad dödlighet och bakteriell börda som var både minskade efter fagen terapi ansökan. Dessutom, eftersom GFP+ fluorescerande PAO1 bakterier injicerades, var det lätt att följa infektionen vid olika tidpunkter för embryoutveckling bekräftar minskningen av fluorescerande bakterier när injicerades.

Vår kunskap är detta den första beskrivningen av terapi ansökan i zebrafisk, med mervärdet för demonstration av fager antimikrobiell aktivitet mot P. aeruginosa i en CF bakgrund, som är särskilt mottagliga för denna bakteriell infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av den italienska cystisk fibros Foundation (FFC# 22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo och FFC#23/2019; Un respiro i più Onlus La Mano tesa Onlus).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Agar BD 214010
Calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
CsCl Sigma-Aldrich 289329
Dulbecco's phospate buffered saline PBS Sigma-Aldrich D8537
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich 886-86-2 common name tricaine
Femtojet Micromanipulator Eppendorf 5247
Fleming/brown P-97 Sutter Instrument Company P-97
LE-Agarose Sigma-Aldrich 11685660001
Low Melting Agarose Sigma-Aldrich CAS 9012-36-6
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Methyl Blue Sigma-Aldrich 28983-56-4
Microinjection needles Harvard apparatus
N-Phenylthiourea >=98% Aldrich-P7629 103-85-5
Oligo Morpholino Gene Tools designed by the researcher
PEG6000 Calbiochem 528877
Phenol Red Solution Sigma-Aldrich CAS 143-74-B
Potassium chloride Sigma-Aldrich 7447-40-7
Pronase Sigma-Aldrich 9036-06-0
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% Sigma-Aldrich S9888
Stereomicroscope Leica S9I
Tris HCl Sigma-Aldrich T5941
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tryptone Oxoid LP0042B
Yeast extract Oxoid LP0021B
Z-MOLDS Microinjection Word Precision Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
  2. Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
  3. Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
  4. Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
  5. Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
  6. Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
  7. McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
  8. Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
  9. Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
  10. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
  11. Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
  12. Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
  13. Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
  14. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  15. Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
  16. Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
  17. Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
  18. Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
  19. Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
  20. Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
  21. Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  23. Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).

Tags

Immunologi och infektion bakteriofag bakterier zebrafisk cystisk fibros Pseudomonas aeruginosa infektion fagterapi immunitet
Phage Terapi Ansökan att motverka <em>Pseudomonas aeruginosa</em> infektion i cystisk fibros Zebrafish Embryon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cafora, M., Forti, F., Briani, F.,More

Cafora, M., Forti, F., Briani, F., Ghisotti, D., Pistocchi, A. Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (159), e61275, doi:10.3791/61275 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter