Summary
قدم هنا هو بروتوكول لSeds pseudomonas aeruginosa العدوى والعلاج phage التطبيق في التليف الكيسي (CF) أجنة حمار وحشي.
Abstract
إن مقاومة مضادات الميكروبات، وهي نتيجة رئيسية لعدم اليقين التشخيصي والإفراط في وصف مضادات الميكروبات، هي سبب معترف به بشكل متزايد للعدوى الحادة والمضاعفات والوفيات في جميع أنحاء العالم مع تأثير كبير على مجتمعنا وعلى النظام الصحي. على وجه الخصوص ، يخضع المرضى الذين يعانون من نقص في جهاز المناعة أو الأمراض المزمنة والمزمنة الموجودة من قبل ، مثل التليف الكيسي (CF) ، لعلاجات المضادات الحيوية المتكررة للسيطرة على العدوى مع ظهور وعزل المقاومات متعددة الأدوية. ولذلك، هناك حاجة ملحة لمعالجة العلاجات البديلة لمواجهة العدوى البكتيرية. استخدام البكتيريا، أعداء الطبيعية للبكتيريا، يمكن أن يكون حلا ممكنا. البروتوكول مفصلة في هذا العمل يصف تطبيق العلاج phage ضد العدوى pseudomonas aeruginosa في الأجنة حمار وحشي CF. أصيبت أجنة حمار وحشي مع P. aeruginosa لإثبات أن العلاج phage فعالة ضد العدوى P. aeruginosa كما أنه يقلل من الفتك, العبء البكتيري والاستجابة المناعية الموالية للالتهابات في الأجنة CF.
Introduction
العلاج Phage، واستخدام الأعداء الطبيعية للبكتيريا لمكافحة الالتهابات البكتيرية، هو كسب تجدد الاهتمام كما المقاومة البكتيرية للمضادات الحيوية يصبح على نطاق واسع1،2. هذا العلاج، وتستخدم لعقود في أوروبا الشرقية، يمكن اعتبار العلاج التكميلي للمضادات الحيوية في علاج التهابات الرئة في المرضى الذين يعانون من CF، ويمكن أن يكون بديلا علاجيا للمرضى المصابين بالبكتيريا التي تقاوم جميع المضادات الحيوية المستخدمة حاليا2،3. مزايا العلاج بالمضادات الحيوية هي أن البكتيريا تتكاثر في موقع العدوى ، في حين يتم استقلاب المضادات الحيوية والقضاء عليها من الجسم4،5. في الواقع ، وقد ثبت أن إدارة الكوكتيلات من phages ضراوة معزولة في مختبرات مختلفة لتكون فعالة في علاج العدوى pseudomonas aeruginosa في نماذج مختلفة مثل الحشرات والثدييات6،7،8. كما تبين أن العلاج Phage تكون قادرة على الحد من العبء البكتيري في حرق الجروح المصابة P. aeruginosa وEscherichia القولونية في التجارب السريرية العشوائية9.
وقد برز حمار وحشي(Danio rerio)مؤخرا كنموذج قيمة لدراسة الالتهابات مع العديد من مسببات الأمراض، بما في ذلك P. aeruginosa10،11، الخراج ميكروباكتيريا وبوركولديريا سيباسيا12،13. بواسطة microinject البكتيريا مباشرة في الدورة الدموية الجنين14 فمن السهل إنشاء عدوى الجهازية التي يتم التصدي لها من قبل نظام المناعة الفطرية حمار وحشي، الذي هو التطورية المحفوظة مع العدلات وتوليد الضامة مماثلة لنظير الإنسان. وعلاوة على ذلك، خلال الشهر الأول من الحياة، تفتقر أجنة الحمار الوحشي إلى الاستجابة المناعية التكيفية، مما يجعلها نماذج مثالية لدراسة المناعة الفطرية، وهي آلية الدفاع الحرجة في التهابات الرئة البشرية15. ظهرت مؤخرا حمار وحشي كنظام نموذج وراثي قوي لفهم أفضل للCF بداية وتطوير علاجات الدوائية جديدة10,16,17. نموذج CF حمار وحشي من cftr الضربة القاضية إلى أسفل ولدت مع حقن مورفولينو في حمار وحشي قدم استجابة انفجار الجهاز التنفسي المثبطة وانخفاض الهجرة العدلات10, في حين أن CFTR خروج المغلوب يؤدي إلى ضعف موقف الجهاز الداخلي وتدمير البنكرياس exocrine, النمط الظاهري الذي يعكس المرض البشري16,17. وكان من أهم ما يثير الاهتمام هو أن عبء البكتيريا P. aeruginosa كان أعلى بكثير في cftr-فقدانمن وظيفة الأجنة مما كانت عليه في الضوابط في 8 ساعات بعد العدوى (hpi), الذي يوازي النتائج التي تم الحصول عليها مع الفئران والخلايا الظهارية القصباتية البشرية2,18.
في هذا العمل، ونحن نثبت أن العلاج phage فعالة ضد العدوى P. aeruginosa في أجنة سمك الحمار الوحشي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم الاحتفاظ حمار وحشي الكبار(Danio rerio)من سلالة AB (الأوروبية حمار البحر مركز الموارد EZRC) وفقا الدولية (الاتحاد الأوروبي توجيه 2010/63/EU) والمبادئ التوجيهية الوطنية (مرسومالايطالية 4th مارس 2014، ن. 26) على حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية. يتم تعيين الشروط القياسية في منشأة الأسماك مع 14 ساعة من ضوء / 10 ساعة دورة داكنة ودرجة حرارة المياه دبابة في 28 درجة مئوية.
1- إعداد الحلول والأدوات
- إعداد حل الأسهم 50x و 1x حلول العمل ل E3 الجنين المتوسطة لزراعة أجنة حمار وحشي (انظر الجدول 1).
- جعل تصبغ منع الحل، لمنع تصبغ الجنين من 24 ساعة بعد الإخصاب (24 حصان) (انظر الجدول 1).
- إعداد 25x الأسهم و 1x عامل محلول التخدير tricane كما هو موضح في الجدول 1.
ملاحظة: لتجنب تكرار التجميد والذوبان من الحل الذي يمكن أن يضر حل الأسهم، وجعل aliquots من 2 مل من tricaine 25x وتخزينها في -20 درجة مئوية. - إعداد المسارات للجنين الحقن المجهري عن طريق حل 1 غرام من agarose في 100 مل من المقطرة H2O في قارورة أو زجاجة microwavable. الميكروويف لمدة 1-3 دقائق حتى يتم حل agarose تماما.
- موضع الحمار الوحشي الذن المجهرية قوالب (انظر جدول المواد)تحولت رأسا على عقب في طبق بيتري (90 مم × 15 ملم) وتغطي السطح كله عن طريق صب هلام agarose السائل بعرض ما يقرب من 10 ملم.
- إزالة القالب مرة واحدة وقد توطد agarose. املأ طبق بيتري بـ 1x E3 من اجنة متوسطة. ويمكن تخزين هذا في 4 درجة مئوية لمدة أسبوع تقريبا. قبل الاستخدام، استبدل بوسيلة E3 الجديدة التي تحتوي على Tricaine.
ملاحظة: قد تتطور القوالب القديمة الفطريات أو التلوث البكتيري. - استخدام النار مصقول 10 سم بوروزيليكات الشعيرات الدموية لإعداد الإبر للininjection وتأمين لهم سحب micropipette عن طريق تشديد المقابض. تعيين سحب مع الإعدادات التالية: الحرارة 500، السرعة 100، الوقت 150، سحب 150.
2- P. aeruginosa (PAO1) إعداد inoculum
- تلقيح 1 مستعمرة من GFP+P. aeruginosa سلالة PAO119 في 5 مل من مرق LB (انظر الجدول 1) وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة).
- تخفيف ثقافة بين عشية وضحاها أعلاه إلى OD600 = 0.1 في 10 مل من مرق LB وتنمو إلى600 OD = 0.5 في 37 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة).
- الطرد المركزي 2 مل من الثقافة لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية في 16100 × ز وإعادة تعليق بيليه الخلية إلى OD600 = 1، أي ما يعادل حوالي 1 × 109 كفو/ مل، في 1 مل من الحل الفسيولوجي (انظر الجدول 1).
- تخفيف تعليق الخلية إلى حوالي 5 × 107cfu / مل في حل الفسيولوجية وتخزينها في 4 درجة مئوية.
3. إعداد الأسهم Phage
- تلقيح 1 مستعمرة P. aeruginosa سلالة PAO1 في 5 مل من مرق LB واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز. تخفيف ثقافة بين عشية وضحاها إلى OD600 = 0.01 في 500 مل من مرق LB وتنمو في 37 درجة مئوية مع اهتزاز لD OD600 = 0.05، أي ما يعادل حوالي 2.5 × 107 cfu/mL.
- إلى ثقافة مخففة من P. aeruginosa، إضافة حوالي 1.25 × 107 phages ، للحصول على تعدد العدوى (M.O.I.) من 10-3. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز حتى600 انخفاض OD إلى حوالي 0.1-0.3 (في حوالي 3 إلى 5 ح، اعتمادا على phage المستخدمة).
ملاحظة: تم اختيار أربعة phages لهذه التجربة التي تصيب سلالة PAO1: Two Podoviridae, أرقام الانضمام GenBank vB_PaeP_PYO2, MF490236, و vB_PaeP_DEV, MF490238, واثنين من Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241, vB_PaeM_E217, MF490240. تنفيذ الخطوات أدناه لكل phage على حدة. - احتضان lysate مع 1 ملغ / مل من DNase وRNase لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 5000 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية واسترداد بعناية فائقة (SN). تصفية SN مع مرشح وجود 0.8 ميكرومتر م م م م م م م م م.
- إلى SN، إضافة 58 غرام / لتر من NaCl و 105 غرام / لتر من PEG6000. يُحلّ مع التحريك في RT 20 دقيقة ثم يبقيه بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 20، 000 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية لهطول الأمطار phage. إزالة SN وحل بعناية بيليه phage في 15 مل من TN العازلة (انظر الجدول 1).
- تنقية phages مع تدرج كثافة CsCl كما هو موضح في الخطوات أدناه.
- في أنابيب متعددة اللومير فائقة الطرد الدوار لSW41 الدوار، وإعداد خطوة CsCl التدرج الكثافة عن طريق تقسيم 2 مل من حلول CsCl الأربعة المبينة في الجدول 1. إضافة 3.5 مل من تعليق phage في كل من 4 أنابيب.
ملاحظة: CsCl هو السامة، اعتماد إجراءات السلامة المناسبة لمعالجة و التخلص منه. - إدخال الأنابيب في الدوار وضمان أن تكون متوازنة الأنابيب (يجب أن يكون الفرق بين الوزن بين أنبوبين تواجه ≤ 0.01g).
- جهاز طرد مركزي لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية و 100، 000 x ز (25000 دورة في الدقيقة لالدوار SW41). بعد الطرد المركزي، وإزالة ببطء الأنابيب وشل حركتها بعناية على الدعم. باستخدام حقنة مع إبرة 19 G، رسم الفرقة البيضاء /أوبينسنت التي تقع عادة بين d = 1.5 و d = 1.4 منطقة الكثافة.
- نقل التعليقات من الحقنة إلى أنابيب بوليلومر جديدة لالدوار SW60 واستخدام حل d = 1.4 لتحقيق التوازن الدقيق في الأنابيب.
- أجهزة الطرد المركزي تعليق في 4 درجة مئوية و 150،000 س ز (38،000 دورة في الدقيقة للدوار SW60) على الأقل 16 ساعة.
- جمع الفرقة المرئية على النحو الوارد أعلاه (انظر الخطوة 3.3.3) ونقلها إلى أنابيب غسيل الكلى مع 6000 دا قطع. Dialyze الفرقة المرئية التي تم الحصول عليها 2x لمدة 20 دقيقة مقابل 500 مل من الماء وبين عشية وضحاها مقابل 500 مل من TN العازلة. فلتر مع مرشح المسام 0.22 ميكرومتر وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
- في أنابيب متعددة اللومير فائقة الطرد الدوار لSW41 الدوار، وإعداد خطوة CsCl التدرج الكثافة عن طريق تقسيم 2 مل من حلول CsCl الأربعة المبينة في الجدول 1. إضافة 3.5 مل من تعليق phage في كل من 4 أنابيب.
4. تحضير كوكتيل Phage
- جعل مزيج من أربعة phages التي تصيب سلالة PAO1، معزولة سابقاوتميزت 8. قبل الاختلاط، تقدير تتر من كل مخزون phage بواسطة البلاك المقايسة20.
- تجميع كوكتيل phage، مع تتر الشاملة من 5 × 108 pfu/mL، عن طريق خلط على قدم المساواة أربعة استعدادات phage في نفس pfu/mL مباشرة قبل كل تجربة، لضمان دقة phage titers.
5. جمع وإعداد أجنة الحمار الوحشي للخافوخ morpholinos cftr
ملاحظة: جمع 1-2 الأجنة الخلية من نوع البرية حمار وحشي لcftr morpholinos(cftr-MOs) microinjection.
- قبل يومين من تجربة الحقن المجهري البكتيرية، قم بإعداد أزواج التربية وجمع الأجنة كما هو موضح سابقًا21. تم شراء حمار وحشي بالغ(Danio rerio)من سلالة AB من مركز موارد حمار وحشي الأوروبية، EZRC.
- في اليوم التالي، جمع الأجنة مباشرة بعد الإخصاب مع ماصة بلاستيكية أو باستخدام مصفاة شبكة غرامة. ضع الأجنة التي تم جمعها في طبق بيتري يحتوي على متوسط جنين E3 وقم بإزالة الحطام بعناية مع ماصة بلاستيكية لتجنب التلوث الذي قد يضر بتطور الجنين.
- إعداد 5 ميكرولتر من محلول حقن مورفولينو عن طريق تمييع اثنين من حلول الأسهم مورفولينو (1 mM) في الماء المعقم إلى تركيز نهائي من 0.25 pmol/embryo ATG-MO + 0.25 pmol/جنين لصق-MO. لتتبع حقن الجنين، أضف 0.5 ميكرولتر من الفينول الأحمر إلى مزيج محلول حقن المورفين.
- تحميل إبرة الحقن المجهري مع ما يقرب من 5 ميكرولتر من حل مزيج مورفولينو باستخدام ميكروبيبت 20 ميكروبليت 20 ميكرولتر مع طرف تحميل هلام غرامة. تأمين الإبرة إلى ميكرومانبولاتور متصلاً بالوقوف ووضعها تحت منظار مجسم.
ملاحظة: ليس من الضروري أن يصل الحل إلى طرف الإبرة حيث أن ضغط مضخة الحقن المجهرية سيدفعها. - قص قبالة غيض من الإبرة عن طريق قطع طرف إبرة مع ملاقط معقمة غرامة. قياس قطر قطرها باستخدام شريط مقياس في العين من المجهر. بدلا من ذلك، إنشاء قطرة من الزيوت المعدنية على شريحة ميكرومتر وتعيين حجم الحقن المجهري عن طريق حقن الحل في قطرة النفط لتقييم حجم قطرات. استخدام قطرة بقطر 156 ميكرومتر لحقن حجم 2 نيولتر.
- تعيين الحقن المجهري عن طريق ضبط ضغط التعويض إلى 15 ه باسكال, وقت الحقن إلى 0.5 s, وضغط الحقن بين 300 و 600 hPa للحصول على حجم الحقن الصحيح اعتمادا على إبرة المستخدمة.
- مع ماصة بلاستيكية ترتيب الأجنة من الخطوة 5.2 على الزجاج المتمركزة في 96 ملم قطر طبق بيتري.
ملاحظة: سوف الكثير من E3 المتوسطة منع الاختراق السليم للإبرة الحقن المجهري في المشيم من الأجنة. - اختراق المشيم ثم صفار مع إبرة لحقن 2 نيولتر في الجنين كما هو موضح سابقا22.
- وضع الأجنة حقن في طبق بيتري مع E3 المتوسطة ووضعها في حاضنة في 28 درجة مئوية للسماح لهم تطوير حتى اليوم التالي.
6. الحقن الدقيق للأجنة حمار وحشي مع البكتيريا وكوكتيل phage
ملاحظة: لإجراء عدوى الجهازية، يجب أن يكون الجنين الدورة الدموية التي تبدأ عادة بعد 26 حصان.
- بعد 26 حصان (لمراحل النمو حمار وحشي تشير إلى كيميل21) مزيل الأجنة مع محلول pronase التي أعدتها حل مسحوق البروناس في E3 المتوسطة بتركيز 2 ملغ / مل. الماصات بلطف الأجنة لكسر المشيمة. تجاهل pronase / E3 المتوسطة وشطف الطبق عدة مرات مع E3 الطازجة لإزالة جميع pronase.
- تخدير أجنة حمار وحشي في E3 المتوسطة التي تحتوي على Tricaine ما يقرب من 5 دقائق قبل الحقن.
- الماصات الأجنة المُقنّغة في المسار المعد في الخطوة 1. استخدم تلميح تحميل هلام ناعم لتعبئة الأجنة في الوضع الجانبي.
- تحميل إبرة الحقن المجهري مع ما يقرب من 5 ميكرولتر من إعداد P. aeruginosa كما هو موضح في الجزء 5.
- أدخل الإبرة dorsally إلى نقطة البداية من القناة من كوفييه حيث يبدأ ينتشر على كيس صفار. حقن حجم من 1-3 نيولتر وضمان أن حجم يوسع مباشرة داخل القناة ويدخل في الدورة الدموية.
- تقريبا بعد كل 50 حقن الجنين، وحقن قطرة من البكتيريا في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم للتحقق مما إذا كان حجم الحقن لا يزال هو نفسه. لوحة inoculum على LB أجار (انظر الجدول 1) في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتقييم CFU.
- نقل الأجنة microinjected في اثنين من أطباق بيتري نظيفة مع E3 المتوسطة الطازجة + PTU واحتضان لهم في 28 درجة مئوية.
- في نقطتين زمنيتين مختارتين: 30 دقيقة أو 3 ساعات بعد الحقن البكتيري ، أخرج أحد أطباق بيتري مع الأجنة التي حقنها بكتيرية من الحاضنة ومحاذاتها في المسار كما هو موضح في 6.3 لحقن كوكتيل الفاجي.
- تحميل إبرة الحقن المجهري مع ما يقرب من 5 ميكرولتر من كوكتيل phage (أعدت في الخطوة 4) مع تلميح تحميل هلام غرامة وإصلاحها إلى الحقن المجهري (انظر الخطوة 5).
- حقن كوكتيل phage في قناة كوفييه من الأجنة التي تم حقنها سابقا مع البكتيريا.
- نقل الأجنة microinjected في اثنين من أطباق بيتري نظيفة مع E3 المتوسطة الطازجة + PTU واحتضان لهم في 28 درجة مئوية.
7- تقييم العبء البكتيري للأجنة التي حقنت بـ PAO1 والفاغات
- في 8 hpi، ماص 15 أجنة تخدير من طبق بيتري إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل.
- استبدل محلول التخدير بـ 300 ميكرولتر من 1% تريتون X-100 في PBS (PBSTritonX) وتجانس الأجنة عن طريق تمريرها 15x على الأقل من خلال حقنة الأنسولين بإبرة معقمة 27-G.
- إعداد المخففات التسلسلية من التجانس في برنامج تلفزيوني عقيمة عن طريق نقل 100 ميكرولتر من المتجانس المخفف إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم.
- لتحديد لسلالة PAO1 مقاومة بشكل طبيعي، لوحة 100 ميكرولتر من التخفيفات على LB agar وأضاف مع أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل)، واحتضان في 37 درجة مئوية أكثر من ليلة.
- في اليوم التالي، عد عدد المستعمرات، وضرب في عامل التخفيف لتحديد العدد الإجمالي للCFU، وقسمة على عدد الأجنة المتجانسة للحصول على متوسط عدد من CFU / الجنين المصاب.
8- تقييم فتك الأجنة التي حقنت بـ PAO1 والفاغات
- لتقييم فتك عدوى PAO1، قم بتسجيل الأجنة المحقونة في 20 حصاناً تحت منظار مُجسم والعد للأجنة الميتة (أبيض/غير شفاف).
- حساب تركيز نصف القصوى القاتلة 50 (LD50) جرعة من PAO1 التي تحدد وفاة 50٪ من الأجنة عن طريق الحقن في 20 حصان.
9. إعداد الجنين للتصوير الزمني الميكروسكوب من GFP+ عدوى PAO1
- إعداد القالب لتصوير الجنين الحي عن طريق حل 1.5٪ ذوبان أغروز منخفضة في 100 مل من محلول E3.
- إضافة 1٪ Tricaine (انظر الجدول 1) ل التخدير الأجنة.
- في 4 hpi نقل جنين واحد مع ماصة بلاستيكية في طبق القاع الزجاج وإضافة الحارة منخفضة ذوبان نقطة حل agarose.
- ضع طبق القاع الزجاجي تحت منظار مجسم ومجسّد مع وضعية التلميح للجنين في الاتجاه المطلوب. استخدم ماصة بلاستيكية لإضافة قطرة من الأغاروز بعناية على الجنين.
- اسمحوا agarose تبرد لمدة 5-10 دقيقة وملء بلطف طبق القاع الزجاجي مع E3 التي تحتوي على حل مخدر للحفاظ على رطوبة الجنين.
- ضع طبق القاع الزجاجي مع الجنين تحت منظار الميكروكروسكوب الفلوري مع فلتر فلوري (قناة 488 نانومتر) لـ GFP+ البكتيريا. لا تقم بإزالة طبق بيتري حتى عمليات الاستحواذ الأخرى مع نفس المعايير في 9 و 14 و 18 حصان.
10. تحليلات التعبير من السيتوكينات الموالية للالتهابات
- في 20 hpi تخدير الأجنة مع محلول tricaine 1x ونقلها من طبق بيتري إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل.
- تحت غطاء الدخان إزالة محلول التخدير واستبدالها مع 200 ميكرولتر من مبيد هيدروكلوريد guanidium.
- التجانس الأجنة عن طريق الأنابيب لهم بشكل متكرر من خلال ماصة 200 ميكرولتر أولا ثم ما لا يقل عن 15x مع حقنة الأنسولين مع إبرة 27 G العقيمة.
- استخراج مجموع RNA من أجنة حمار وحشي متجانسة باستخدام الكواشف هيدروكلوريد غوانيديوم المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- علاج 1 ميكروغرام من كل عينة من RNA مع 2 ميكرولتر من 1U/μL من DNase I (RNase خالية)، بعد تعليمات الشركة المصنعة.
- استخدام 1 ميكروغرام من DNase أنا تعامل RNA لعكس النسخ رد فعل (RT) باستخدام مجموعة المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد)،في حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- تنفيذ رد فعل الرايت qPCR في حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر يحتوي على 1x SYBR Green mastermix باستخدام 1.5 ميكرولتر من تخفيف 1:6 من رد فعل RT. لأغراض التطبيع، استخدم التمهيديات للجينات حفظ المنزل rpl8 و للcytokines الموالية للالتهابات، واستخدام التمهيديات لـ TNF-α و IL-1β (انظر الجدول 2). وكان بروتوكول qPCR: دورة 1 الخطوة 1: 95 درجة مئوية، 2 دقيقة، كرر مرة واحدة؛ دورة 2: الخطوة 1 95 درجة مئوية، 10 ق، الخطوة 2 55 درجة مئوية، 30 S، كرر 40x؛ دورة 3: الخطوة 1 72 درجة مئوية، 15 دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويشار إلى النتائج والأرقام المعروضة هنا إلى أجنة CF التي تم إنشاؤها من خلال حقن cftr morpholinos كما هو موضح سابقا10 وفي الخطوة 5. للتحقق من صحة النمط الظاهري CF، تم النظر في الموقف الضعيف للأعضاء الداخلية مثل القلب والكبد والبنكرياس كما هو موضح سابقا17 (الشكل 1). تم الحصول على نتائج مماثلة في حالة الأجنة WT كما ورد في نشرتنا السابقة19.
تم تخفيض العبء البكتيري عن طريق العلاج phage في الأجنة CF المصابة PAO1. وعلاوة على ذلك، قمنا بتقييم العبء البكتيري في 8 إتش بي من قبل مجموعات التجانس من 15 أجنة: تم تخفيض متوسط عدد البكتيريا (cfu/embryo) الموجودة في أجنة PAO1 المصابة إلى حوالي 20٪ بعد علاج إدارة الففاج، وبالتالي تأكيد عدوى أقل حدة في وجود كوكتيل الفاج(الشكل 2).
تم تقليل الفتك عن طريق العلاج phage في الأجنة CF المصابة GFP+ البكتيريا PAO1. تم حقن أجنة حمار وحشي CF في 48 حصان مع GFP+ البكتيريا من سلالة PAO1 بجرعة التي تسببت في 50٪ فتاكة بعد 20 حصان (30 كفو / جنين، الشكل 3A). وكان موقع الحقن صفار أو القناة من كوفييه لتوليد عدوى الجهازية. تم اختبار العلاج Phage ضد عدوى PAO1 عن طريق حقن 2 nL من كوكتيل الفاج المختلط على قدم المساواة (300-500 بفو / جنين). تم إجراء الحقن في نقطتين زمنيتين مختلفتين: 30 دقيقة (مبكرة) و 7 ساعات (متأخرة) بعد الحقن البكتيري. في كلتا الحالتين، تم تخفيض الفتك في 20 إتش بي، مما يشير إلى أن العلاج phage فعالة(الشكل 3B).
مع التصوير الحي، وذلك باستخدام منظار مجسم الفلوري، وتابعنا أيضا تطور العدوى في الأجنة CF حقن مع GFP+ PAO1 وأظهرت فعالية العلاج phage في الحد من انتشار البكتيريا الفلورية على كيس صفار. يتم عرض الجنين حقن CF + PAO1 مع GFP + البكتيريا في 4 و 9 و 14 و 18 hpi في الجانب العلوي من الشكل 4، في حين أن الجنين CF + PAO1 + phages مع انخفاض الفلورس بسبب عمل phage ضد البكتيريا يظهر في الجزء السفلي(الشكل 4).
العلاج Phage خفض الاستجابة الالتهابية التي تولدها عدوى PAO1 في الأجنة CF. نحن، أيضا، تقييم الاستجابة المناعية التي ولدتها PAO1 و PAO1 + حقن phages في 8 إتش بي. كما هو متوقع، تم زيادة التعبير عن السيتوكينات الموالية للالتهابات TNF-a و IL-1β تحليلها بواسطة تقنيات qPCR بشكل كبير بعد حقن PAO1 بالمقارنة مع الضوابط، في حين تم تخفيضه مع الحقن المشترك للكوكتيل الفاج(الشكل 5A, B).
الشكل 1: توليد وتثبت من الأجنة CF على cftr morpholinos(cftr-MOs) حقن. (A) ضعف الموقف والحلقات من القلب في CF حقن الأجنة بالمقارنة مع البرية من نوع (WT) الأجنة. يتم تصور القلب مع تعبير cmlc2 بواسطة تقنية التهجين فيالموقع. (ب) ضعف وضع الكبد (السهام) والبنكرياس في أجنة CF بالمقارنة مع WT. يتم تصور الكبد والبنكرياس مع التعبير prox1a بواسطة تقنيات التهجين في الموقع. تشير أشرطة المقياس إلى 100 ميكرومتر. ليف: الكبد; ع: البنكرياس. تتم إعادة طبع الرقم من19 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: العبء البكتيري في الأجنة CF المصابة ب PAO1 أو PAO1 + phages. وتعطى النسبة المئوية النسبية من cfu/embryo في PAO1 + phages مقابل أجنة PAO1. تم الإبلاغ عن متوسط و SD من ثلاث تجارب مستقلة. تتم إعادة طبع الرقم من19. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: فتك أجنة حمار وحشي من مركبات الكربون الكلورية فلورية مصابة بـ PAO1 وب PAO1+phages. (أ)تحديد LD50 في 48 حصاناً من أجنة الحمار الوحشي microinjected مع cftr-MOفي مرحلة 1-خلية (الأجنة CF) والمصابة في 48 حصان مع 2 نيولتر من ثقافة PAO1 التي تحتوي على عدد متزايد من البكتيريا (جفو / جنين). ولوحظت فتك الأجنة في 20 hpi. (ب) الفتك في 20 حصانا من الأجنة CF المصابة PAO1 في 48 حصانا وتعامل مع كوكتيل phage (PAO1 + Φ). ومتوسط وSD المبلغ عنها هي من ست وأربع تجارب، على التوالي، كل مع 25-40 الأجنة. تم تطبيق التحول الزاوي على النسبة المئوية من الفتك واستخدمت ANOVA في اتجاه واحد تليها اختبار دنكان. تتم إعادة طبع الرقم من19. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تصوير فعالية العلاج phage في حمار وحشي. تطور العدوى في الأجنة CF بعد حقن PAO1 (الجنين العلوي) وفعالية العلاج phage في PAO1 + phages حقن الأجنة (الجنين السفلي) في 4 و 9 و 14 و 18 إتش بي. شريط مقياس يشير إلى 100 ميكرون. تتم إعادة طبع الرقم من19. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التعبير عن السيتوكينات المؤيدة والمضادة للالتهابات بعد PAO1 وإدارة PAO + phage. مستويات التعبير من الجينات TNF-a (A) و IL-1β تقاس بواسطة RT-qPCR في 8 hpi في الأجنة CF حقن PAO1 و PAO1 + Φ في 48 حصان وتم تطبيع باستخدام التعبير rpl8. يتم الإبلاغ عن متوسط و SD من أربع تجارب. تم تقييم الأهمية الإحصائية من قبل ANOVA تليها اختبار دنكان: لـ TNF- a (CF) مقابل (CF+PAO1) p = 0.015*; (CF) مقابل (CF +PAO1+Φ) ع = 0.019 *؛ (CF + PAO1) مقابل (CF +PAO1 + Φ) ع = 0.77 n.s.; ل IL-1β (CF) مقابل (CF +PAO1) p = 0.00014***؛ (CF) مقابل (CF +PAO1 + Φ) ع = 0.00068***; (CF +PAO1) مقابل (CF +PAO1+ Φ) ع = 0.031 *. تتم إعادة طبع الرقم من19. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حلول | اعداد |
| محلول مخزون مخدر 25X | 4 ملغ/مل من تريكايين في المقطر H2O. |
| التخدير حل العمل 1X | تخفيف في المقطرة H2O Tricaine الأسهم الحل 25X إعداد للوصول إلى تركيز 1X (0.16 ملغ / مل) Tricaine من المقطر H2O. |
| CsCl d=1.3 | 20.49 غ في 50 مل TN |
| CsCl d=1.4 | 20.28 غ في 50 مل TN |
| CsCl d=1.5 | 34.13 غ في 50 مل |
| CsCl d=1.6 | 41.2 غرام في 50 مل من TN |
| E3 الجنين المتوسطة لجنين حمار وحشي | 1 L 1of E3 (تمييع الأسهم 50X مع تقطير H2O) + 200 ميكرولتر من 0.05٪ الميثيل الأزرق. تخزين في RT. |
| E3 الجنين متوسطة الأسهم الحل (50X) | 73.0 ز NaCl, 3.15 ز كلول, 9.15 ز CaCl2, و 9.95 ز MgSO4 في 5 لتر من المقطرة H2O. مخزن في RT. |
| LB أجار | 10 غ/لتر من التربتون، 5 غ/لتر من الخميرة، 5 غ/لتر من الـ NaCl، 10 غ/لتر أجار |
| مرق LB | ل1L: 950 مل H2O, 10 غرام Tryptone, 10 ز NaCl, 5 استخراج الخميرة 5 ز |
| PBST | برنامج تلفزيوني 1X + تريتون X 1٪ |
| حل الفسيولوجية | 0.9% من الـ NaCl |
| تصبغ حجب الأسهم حل 10X | 0.3 ملغ/مل فينيل ثيورا (PTU) مسحوق في E3 الجنين المتوسط للجنين حمار وحشي |
| Pronase حل الأسهم 5X | 5 ملغ / مل مسحوق البروناس في E3 متوسطة الجنين لجنين حمار وحشي |
| المخزن المؤقت لـ TN | 10 mM تريس HCl pH 8.0، 150 mM NaCl |
الجدول 1: إعداد الحلول.
| اسم جين | تسلسل التمهيدي |
| TNF-ألفا وفو | 5'-TGCTTCACGCTCCATAAGACC-3' |
| TNFalpha القس | 5'-CAAGCCACCTGAAGAAAGG-3' |
| IL1-بيتا وواو | 5'-TGGACTTCGCAGCACAAAATG-3' |
| IL1-بيتا القس | 5'-CGTTCACTTCACGCTCTTGG-3' |
| rpl8 Fw | 5'-CTCCGTCTAAAGCCCAT-3' |
| rpl8 القس | 5'-TCCTTCACGATCCCCTTGAT-3' |
الجدول 2: ال التمهيديون المستخدمون في RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المخطوطة، وصفنا البروتوكول الخاص بإجراء عدوى P. aeruginosa (PAO1) في أجنة أسماك الحمار الوحشي وكيفية تطبيق العلاج بالفسيج مع مزيج من الففاج التي تم تحديدها سابقًا على أنها قادرة على إصابة PAO1 لحلها. استخدام البكتيريا كبديل للعلاج بالمضادات الحيوية كان من الاهتمام المتزايد منذ السنوات القليلة الماضية. ويرجع ذلك أساسا إلى انتشار العدوى البكتيرية المقاومة للأدوية المتعددة، والتي تشكل مشكلة خطيرة بالنسبة للصحة العامة. وبطبيعة الحال، يقتصر نطاق هذا العمل على تطبيق العلاج phage لنموذج وليس على البشر. ومع ذلك، قمنا بتوليد نموذج حمار وحشي التليف الكيسي مع حقن مورفولينو يستهدف جين CFTR، مما يدل على فعالية العلاج phage أيضا في نموذج الإمراضية عرضة بشكل خاص للعدوى P.aeruginosa.
ومن الجدير بالذكر أن نتمكن من تحقيق العلاج بسهولة phage، كما هو الحال في العمل السابق، ونحن عزل وتتميز phages مختلفة قادرة على إصابة P. aeruginosa سواء في المختبر وفي الجسم الحي8. هذه الخطوة هي أساسية للحصول على النشاط المضاد للميكروبات من phages. العزل وتوصيف phages قادرة على إصابة سلالة بكتيرية محددة هي خطوات حاسمة من تطبيق العلاج phage. في الواقع ، لتجنب الآثار السلبية للفاجنات على الحيوان / المضيف البشري ، من الضروري استخدام phages اللوائية بدلاً من تلك الحساسية. والأهم من ذلك، من الضروري التحقق من الجينوم الفاجي لوجود جينات ضارة كتلك لمقاومة المضادات الحيوية والفوعة ونقل الجينات.
وقد تم بالفعل استخدام العلاج Phage بنجاح في نماذج الحيوانات الأخرى. ونحن ندرك أن حمار وحشي ليس نموذجا الثدييات وبعض آثار الففاج قد تكون مختلفة. ومع ذلك ، منذ حمار وحشي تمتلك جهاز المناعة الفطرية مماثلة للإنسان واحد مع عدد من الحفاظ على عدد من العدلات و الضامة23، ونحن التكهن بأن البيانات على الاستجابة المناعية يمكن أن تكون قابلة للتكرار في البشر. وعلاوة على ذلك، يتم تقييم جيدا حمار وحشي لدراسات العدوى البكتيرية، واستخدامه كمختبر لفعالية العلاج phage قد تكون واعدة للنهج العلاجية. في الواقع، يمكن أن تكون العدوى النظامية إذا يتم حقن البكتيريا في الدورة الدموية من خلال قناة كوفييه، أو مترجمة كما ذكرت17. قمنا بإجراء كل من العدوى الجهازية والمترجمة وأظهرنا أنها ولدت بالمثل زيادة الفتك والعبء البكتيري الذي انخفض على حد سواء بعد تطبيق العلاج phage. وعلاوة على ذلك، منذ GFP+ البكتيريا الفلورية PAO1 تم حقن، كان من السهل متابعة العدوى في نقاط زمنية مختلفة من تطور الجنين مما يؤكد الحد من البكتيريا الفلورية عندما تم حقن phages.
على حد علمنا، وهذا هو أول وصف لتطبيق العلاج phage في حمار وحشي، مع القيمة المضافة لاظهارة النشاط المضاد للميكروبات phages ضد P. aeruginosa في خلفية CF، التي هي عرضة بشكل خاص لهذه العدوى البكتيرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل مؤسسة التليف الكيسي الإيطالي (FFC#22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo و FFC #23/2019؛ Un respiro في piû Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
