Summary
מוצג כאן פרוטוקול עבור זיהום Pseudomonas aeruginosa ויישום טיפול phage בעוברי דגי זברה סיסטיק פיברוזיס (CF).
Abstract
עמידות מיקרוביאלית, תוצאה גדולה של אי-ודאות אבחונית ויתור יתר מיקרוביאלי, היא גורם מוכר יותר ויותר לזיהומים חמורים, סיבוכים, ותמותה ברחבי העולם עם השפעה עצומה על החברה שלנו ועל מערכת הבריאות. בפרט, חולים עם מערכות חיסוניות בסכנה או פתולוגיות קיימות וכרוניות מראש, כגון סיסטיק פיברוזיס (CF), נתונים לטיפולים אנטיביוטיים תכופים כדי לשלוט בזיהומים עם המראה ופיזור של מבודדים עמידים multidrug. לכן, יש צורך דחוף לטפל טיפולים חלופיים כדי לנטרל זיהומים חיידקיים. שימוש bacteriophages, האויבים הטבעיים של חיידקים, יכול להיות פתרון אפשרי. הפרוטוקול המפורט בעבודה זו מתאר את היישום של טיפול phage נגד זיהום aeruginosa פסאודומונס בעוברי דגי זברה CF. עוברי דגי זברה נדבקו P. aeruginosa כדי להוכיח כי טיפול phage יעיל נגד P. זיהומים aeruginosa כפי שהוא מפחית קטלניות, נטל חיידקי ותגובה חיסונית פרו דלקתית בעוברי CF.
Introduction
טיפול Phage, השימוש באויבים הטבעיים של חיידקים להילחם בזיהומים חיידקיים, הוא צובר עניין מחודש כמו עמידות חיידקים לאנטיביוטיקה הופךנפוץ 1,,2. טיפול זה, המשמש במשך עשרות שנים במזרח אירופה, יכול להיחשב טיפול משלים לאנטיביוטיקה בריפוי דלקות ריאות בחולים עם CF וחלופה טיפולית אפשרית עבור חולים נגועים בחיידקים עמידים בפני כל הנוכחי בשימושבאנטיביוטיקה 2,3. היתרונות של טיפול אנטיביוטי הם bacteriophages להכפיל באתר הזיהום, בעוד אנטיביוטיקה הם מטבוליזם ומבוטלמהגוף 4,5. אכן, ניהול קוקטיילים של phages ארסי מבודד במעבדות שונות הוכיח להיות יעיל בטיפול בזיהומים aeruginosa פסאודומונס במודלים של בעלי חיים שונה כמו חרקים ויונקים6,7,8. טיפול Phage הוכח גם להיות מסוגל להפחית את הנטל החיידקי בפצעי כוויות נגוע P. aeruginosa ו Escherichia קולי בניסוי קליני אקראי9.
דגי זברה (דניו rerio) לאחרונה התגלה כמודל יקר לחקר זיהומים עם מספר פתוגנים, כולל P. aeruginosa10,,11, מורסה Mycobacterium ו Burkolderia cepacia12,13. על ידי microinjecting חיידקים ישירותלתוך מחזור הדם העובר 14 קל להקים זיהום מערכתי כי הוא מנוטרל על ידי מערכת החיסון המולדת של דגי הזברה, אשר אבולוציונית שמר עם נויטרופילים ודור מקרופאג דומה המקביל האנושי. יתר על כן, במהלך החודש הראשון של החיים, עוברי דגי זברה חסרים את התגובה החיסונית אדפטיבית, מה שהופך אותם מודלים אידיאליים ללימוד החסינות המולדת, שהוא מנגנון ההגנה הקריטי בדלקותריאות אנושיות 15. דגי זברה הופיעו לאחרונה כמערכת מודל גנטי רב עוצמה כדי להבין טוב יותר את תחילת CF ולפתח טיפוליםתרופתיים חדשים 10,16,17. מודל דגי הזברה CF של CFTR נוק-דאון שנוצר עם הזרקת מורפולינו בדעי זברה הציג תגובה התפרצות נשימתית לחה והגירהנויטרופיל מופחתת 10, בעוד נוק אאוט CFTR מוביל לתום איברים פנימי לקוי והרס של הלבלב האקסוקריני, פנוטיפהמשקף מחלה אנושית 16,17. העניין הגדול ביותר היה הממצא כי הנטל החיידקי P. aeruginosa היה גבוה באופן משמעותי בעוברים cftr-אובדן של פונקציה מאשר בפקדים ב 8 שעות לאחר הזיהום (hpi), אשר מקביל את התוצאות שהתקבלו עם עכברים ותאי אפיתל הסיפונותהאנושיים 2,,18.
בעבודה זו, אנו מדגימים כי טיפול phage יעיל נגד P. זיהומים aeruginosa בעוברי דגי זברה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגי זברה בוגרים(Danio rerio)מזן AB (מרכז המשאבים האירופי של דגי הזברה EZRC) נשמרים על פי הגנה בינלאומית (הנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU) והנחיות לאומיות (צו איטלקי 4מרץ 2014, נ' 26) על הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. תנאים סטנדרטיים מוגדרים במתקן הדגים עם 14 שעות של אור / 10 שעות מחזור כהה וטמפרטורת מים מיכל ב 28 ° C.
1. הכנת פתרונות וכלים
- הכן פתרון מניות של 50x ופתרונות עבודה של פי 1 עבור מדיום עובר E3 לגידול עוברי דגי זברה (ראה טבלה 1).
- להפוך את פתרון חסימת פיגמנטציה, כדי לחסום את פיגמנטציה העובר מ 24 שעות לאחר הפריה (24 hpf) (ראה טבלה 1).
- הכן מלאי 25x ו1x עובד Tricane הרדמה פתרון כמתואר בטבלה 1.
הערה: כדי למנוע הקפאה חוזרת ונשנית של הפתרון שיכול לפגוע בפתרון המניות, הפוך aliquots של 2 מ"ל של 25x tricaine ולאחסן אותם ב -20 °C. - להכין מסלולים microinjection העובר על ידי המסת 1 גרם של agarose ב 100 מ"ל של מזוקק H2O בבקבוקון או בקבוק microwavable. מיקרוגל במשך 1-3 דקות עד agarose מומס לחלוטין.
- תבניות מיקרו-אינחזציה של דגי זברה (ראה טבלת חומרים)התהפכו בצלחת פטרי (90 מ"מ x 15 מ"מ) ומכסים את כל פני השטח על ידי שפיכת ג'ל אגרוז נוזלי ברוחב של כ-10 מ"מ.
- הסר את התבנית לאחר שהאגרוז התגבש. ממלאים את צלחת פטרי ב-1 מיובר E3 בינוני. ניתן לאחסן זאת ב- 4°C למשך כשבוע. לפני השימוש, החלף במדיום E3 הטרי המכיל Tricaine.
הערה: תבניות ישנות עלולות לפתח פטריות או זיהומים חיידקיים. - השתמש אש מלוטשת 10 ס"מ borosilicate נימים כדי להכין מחטים microinjection ולאבטח אותם למשוך micropipette על ידי הידוק הידיות. הגדר את המשוך עם ההגדרות הבאות: חום 500, מהירות 100, זמן 150, למשוך 150.
2. פ. ארוגינוזה (PAO1) הכנה אינוקולום
- לחסן 1 מושבה של GFP+P. aeruginosa זן PAO119 ב 5 מ"ל של מרק LB (ראה טבלה 1) ולגדוללילה ב 37 ° C עם רועד (200 סל"ד).
- לדלל את תרבות הלילה לעיל כדי OD600 = 0.1 ב 10 מ"ל של מרק LB ולגדול OD600 = 0.5 ב 37 ° C עם רועד (200 סל"ד).
- צנטריפוגה 2 מ"ל של התרבות במשך 2 דקות ב 4 °C ב 16,100 x g ולתוסת מחדש את גלולת התא כדי OD600 = 1, שווה ערך על 1 x 109 cfu / מ"ל, ב 1 מ"ל של הפתרון הפיזיולוגי (ראה טבלה 1).
- לדלל את מתלי התא על 5 x 107cfu / מ"ל בתמיסה פיזיולוגית ולאחסן ב 4 ° C.
3. הכנת מניות Phage
- לחסן 1 מושבה של P. aeruginosa זן PAO1 ב 5 מ"ל של מרק LB דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות. לדלל את תרבות הלילה כדי OD600 = 0.01 ב 500 מ"ל של מרק LB ולגדול ב 37 °C עם רועד OD600 = 0.05, שווה ערך על 2.5 x 107 cfu / מ"ל.
- לתרבות מדוללת של P. aeruginosa, להוסיף על 1.25 x10 7 phages, כדי לקבל את ריבוי הזיהום (M.O.I.) של 10-3. דגירה ב 37 ° C עם רועד עד OD600 יורד על 0.1-0.3 (ב כ 3 עד 5 שעות, בהתאם phage בשימוש).
הערה: ארבעה phages נבחרו עבור ניסוי זה להדביק זן PAO1: שני Podoviridae, מספרי גישה GenBank vB_PaeP_PYO2, MF490236, ו vB_PaeP_DEV, MF490238, ושני Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241, ו vB_PaeM_E217, MF490240. בצע את השלבים הבאים עבור כל phage בנפרד. - דגירה lysate עם 1 מ"ג / מ"ל של DNase ו RNase במשך 30 דקות ב 37 ° C. צנטריפוגה ב 5,000 x g עבור 30 דקות ב 4 ° C בזהירות לשחזר את supernatant (SN). סנן את ה-SN עם מסנן בעל קוטר נקבוביות 0.8 μm.
- ל-SN, הוסף 58 ג'/אל של NaCl ו- 105 גרם/ל' של PEG6000. מתמוססים עם ערבוב ב-RT 20 דקות ולאחר מכן לשמור אותו לילה ב 4 ° C. צנטריפוגה ב 20, 000 x g עבור 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עבור משקעים phage. הסר את ה-SN והמיס בזהירות את גלולת ה-phage ב- 15 מ"ל של מאגר TN (ראה טבלה 1).
- טהר את ה- phages עם מעבר צבע של צפיפות CsCl כמתואר בשלבים שלהלן.
- בצינורות אולטרה-צנטריפוגה פוליאלומרית עבור רוטור SW41, הכינו מעבר צבע של צפיפות צעד CsCl על-ידי שכבות של 2 מ"ל מתוך ארבעת פתרונות CsCl המתוארים בטבלה 1. להוסיף 3.5 מ"ל של מתלה phage בכל אחד 4 צינורות.
הערה: CsCl הוא רעיל, לאמץ נהלי בטיחות נאותים כדי לטפל ולהיפטר ממנו. - להכניס את הצינורות לתוך הרוטור ולוודא כי הצינורות מאוזנים (הפרש המשקל בין שני צינורות מול חייב להיות ≤ 0.01g).
- צנטריפוגה ל-2 שעות ב-4°C ו-100, 000 x g (25,000 סל"ד עבור רוטור SW41). לאחר צנטריפוגה, לאט להסיר את הצינורות ולשתק אותם בזהירות על תמיכה. באמצעות מזרק עם מחט 19 G, צייר את הרצועה הלבנה/אופלסנט הממוקמת בדרך כלל בין d = 1.5 לבין אזור הצפיפות d=1.4.
- העבר את המתלים מהמזרק לצינורות פוליאלומר חדשים עבור רוטור SW60 והשתמש בתמיסת d=1.4 כדי לאזן במדויק את הצינורות.
- צנטריפוגה המתלים ב 4 °C ו 150,000 x g (38,000 סל"ד עבור הרוטור SW60) עבור לפחות 16 שעות.
- לאסוף את הרצועה גלוי כאמור לעיל (ראה שלב 3.3.3) ולהעביר אותם לתוך צינורות דיאליזה עם 6,000 Da לחתוך. דיאליזה הלהקה הנראה 2x שהתקבלו במשך 20 דקות נגד 500 מ"ל של מים והלילה נגד 500 מ"ל של מאגר TN. סנן עם מסנן נקבוביות 0.22 μm ולאחסן ב 4 °C.
- בצינורות אולטרה-צנטריפוגה פוליאלומרית עבור רוטור SW41, הכינו מעבר צבע של צפיפות צעד CsCl על-ידי שכבות של 2 מ"ל מתוך ארבעת פתרונות CsCl המתוארים בטבלה 1. להוסיף 3.5 מ"ל של מתלה phage בכל אחד 4 צינורות.
4. הכנת קוקטייל פאג'
- הפוך שילוב של ארבעה phages להדביק את הזן PAO1, בעבר מבודד ומאופיין8. לפני ערבוב, להעריך את הטיטר של כל מלאי phage על ידי לוח assay20.
- להרכיב את קוקטייל phage, עם titer הכולל של 5 × 108 pfu / מ"ל, על ידי ערבוב שווה ארבע הכנות phage באותו pfu / מ"ל מיד לפני כל ניסוי, כדי להבטיח titers phage מדויק.
5. איסוף והכנת עוברי דגי זברה למיקרו-זיקת מופולינוס CFTR
הערה: לאסוף 1-2 עוברי תאים מתוך דגי זברה מסוג בר עבורcftr morpholinos (cftr-MOs) microinjection.
- יומיים לפני ניסוי microinjection חיידקי, להגדיר זוגות רבייה ולאסוף עוברים כמתואר קודםלכן 21. דגי זברהבוגרים (דניו רריו)של זן AB נרכשו ממרכז המשאבים האירופי של דגי הזברה, EZRC.
- ביום שאחרי, לאסוף את העוברים מיד לאחר הפריה עם פיפטה פלסטיק או באמצעות מסננת רשת עדינה. מניחים את העוברים שנאספו בצלחת פטרי המכילה בינוני עובר E3 ולהסיר בזהירות את הפסולת עם פיפטה פלסטיק כדי למנוע זיהום שעלול לפגוע בהתפתחות העובר.
- להכין 5 μL של פתרון הזרקת מורפולינו על ידי דילול שני פתרונות מלאי מורפולינו (1 מ"מ) במים סטריליים לריכוז סופי של 0.25 pmol / עובר ATG-MO + 0.25 pmol / עובר splice-MO. כדי לעקוב אחר הזרקת העובר, להוסיף 0.5 μL של פנול אדום לתערובת תמיסת הזרקת מורפולינו.
- לטעון מחט microinjection עם כ 5 μL של פתרון תערובת מורפולינו באמצעות 20 μL micropipette עם קצה טעינת ג'ל פיין. אבטחו את המחט למיקרו-מניהר המחוברים לעמוד ומקם אותה מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
הערה: אין צורך כי הפתרון מגיע לקצה המחט כמו הלחץ של משאבת microinjector ידחוף אותו. - מהדק את קצה המחט על ידי חיתוך קצה המחט עם פינצטה סטרילית עדינה. למדוד את הקוטר של הטיפה באמצעות סרגל קנה מידה בזווית של המיקרוסקופ. לחלופין, ליצור טיפה של שמן מינרלי על שקופית מיקרומטר ולהגדיר את נפח microinjection על ידי הזרקת הפתרון לתוך השמן-טיפה כדי להעריך את גודל הטיפה. השתמש בטיפה בקוטר 156 μm כדי להזריק נפח של 2 כ"ס.
- הגדר את microinjector על ידי התאמת לחץ הפיצוי 15 hPa, זמן הזרקה 0.5 s, ולחץ הזרקה בין 300 ו 600 hPa כדי לקבל את נפח ההזרקה הנכון בהתאם למחט בשימוש.
- עם פיפטה מפלסטיק מסדרים את העוברים ממדרגה 5.2 לזכוכית הממוקם בצלחת פטרי בקוטר 96 מ"מ.
הערה: מדיום E3 יותר מדי ימנע את החדירה הנכונה של מחט microinjection לתוך chorion של העוברים. - לחדור את chorion ולאחר מכן את החלמון עם המחט להזריק 2 nL לתוך העובר כפי שתואר קודםלכן 22.
- מניחים עוברים מוזרקים לצלחת פטרי עם בינוני E3 ולשים אותם באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס כדי לאפשר להם להתפתח עד היום שאחרי.
6. מיקרו-זיקת עוברי דגי זברה עם חיידקים וקוקטייל פאג'
הערה: כדי לבצע זיהום מערכתי, העובר חייב להיות זרימת דם כי בדרך כלל מתחיל לאחר 26 hpf.
- לאחר 26 hpf (עבור שלבים התפתחותיים של דגי זברה מתייחסים קימל21) עוברים dechorionate עם תמיסת pronase שהוכן על ידי המסת אבקת פרונז ב E3 בינוני בריכוז של 2 מ"ג / מ"ל. בעדינות פיפטה העוברים לשבור את chorion. בטלו את המדיום pronase/E3 ושונו את המנה מספר פעמים עם E3 טרי כדי להסיר את כל הפרונאז.
- להניא עוברי דגי זברה במדיום E3 המכיל Tricaine כ 5 דקות לפני הזריקות.
- פיפט העוברים המרדמים למסלול שהוכנו בשלב 1. השתמש בקצה טעינת ג'ל פיין כדי לתח רוח לעוברים בתנוחה החוץ.
- לטעון מחט microinjection עם כ 5 μL של הכנת P. aeruginosa כמתואר בחלק 5.
- הכנס את המחט במשבר לנקודת ההתחלה של צינור האוורור של Cuvier שבו הוא מתחיל להתפשט על שק החלמון. הזרק נפח של 1-3 nL ולהבטיח כי עוצמת הקול מתרחבת ישירות בתוך צינור האוורור ונכנס למחזור הדם.
- כ אחרי כל 50 מוזרק-עובר, להזריק טיפה של החיידקים לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל עם 100 μL של PBS סטרילי כדי לבדוק אם נפח ההזרקה נשאר אותו הדבר. לוח inoculum על LB אגר (ראה טבלה 1)ב 37 ° C לילה כדי להעריך את CFU.
- מעבירים את העוברים המיקרו-אינטג'ים בשתי מנות פטרי נקיות עם E3 בינוני טרי + PTU ותדגירה ב-28°C.
- בשתי נקודות זמן נבחרות: 30 דקות או 3 שעות לאחר ההזרקה החיידקית, להוציא את אחת המנות פטרי עם עוברים מוזרקים חיידקים מהאינקובטור וליישר אותם במסלול כמתואר 6.3 עבור הזרקת קוקטייל phage.
- טען מחט microinjection עם כ 5 μL של קוקטייל phage (מוכן בשלב 4) עם קצה טעינת ג'ל בסדר ולתקן אותו microinjector (ראה שלב 5).
- להזריק את קוקטייל phage בתעלות של Cuvier של העוברים שהוזרקו בעבר עם חיידקים.
- מעבירים את העוברים המיקרו-אינטג'ים בשתי מנות פטרי נקיות עם E3 בינוני טרי + PTU ותדגירה ב-28°C.
7. הערכת הנטל החיידקי של עוברים מוזרקים PAO1 ו phages
- ב 8 hpi, פיפטה 15 עוברים מנומים מצלחת פטרי לצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- להחליף את תמיסת ההרדמה עם 300 μL של 1% Triton X-100 ב PBS (PBSTritonX) ו homogenize העוברים על ידי העברתם לפחות 15x דרך מזרק אינסולין עם מחט סטרילית 27-G.
- להכין דילול סדרתי של homogenates PBS סטרילי על ידי העברת 100 μL של homogenate מדולל לתוך 900 μL של PBS סטרילי.
- כדי לבחור עבור זן PAO1 עמיד באופן טבעי, צלחת 100 μL של דילול על LB אגר הוסיף עם אמפוצילין (100 μg / מ"ל), ומדגר ב 37 ° C במהלך הלילה.
- יום לאחר מכן, לספור את מספר המושבות, להכפיל על ידי גורם דילול כדי לקבוע את המספר הכולל של CFU, ולחלק על ידי מספר העוברים homogenized כדי לקבל את המספר הממוצע של CFU / עובר נגוע.
8. הערכת הקטלניות של עוברים המוזרקים PAO1 ו phages
- כדי להעריך את הקטלניות של זיהום PAO1, ציון העוברים המוזרקים ב 20 hpi תחת stereomicroscope ולספור עבור העוברים המתים (לבן / לא שקוף).
- לחשב את הריכוז הקטלני חצי מקסימום 50 (LD50) מנה של PAO1 הקובע את מותו של 50% של עוברים מוזרקים ב 20 hpf.
9. הכנת העובר להדמיית זמן-לשגות סטריאומיקרוסקופ של GFP+ PAO1 זיהום
- הכנת התבנית להדמיית עובר חי על ידי המסת 1.5% agarose התכה נמוכה ב 100 מ"ל של פתרון E3.
- הוסף 1% טריקין (ראה טבלה 1)כדי להנות את העוברים.
- ב 4 hpi להעביר עובר אחד עם פיפטה פלסטיק בצלחת תחתית זכוכית ולהוסיף את תמיסת agarose נקודת התכה נמוכה חמה.
- מקם את צלחת הזכוכית התחתונה מתחת לסטריאומיקרוסקופ ועם מיקום קצה העובר בכיוון הרצוי. השתמש פיפטה פלסטיק כדי להוסיף בזהירות טיפה של agarose על העובר.
- מניחים לאגרוז להתקרר במשך 5-10 דקות ולמלא בעדינות את צלחת התחתון של הזכוכית ב-E3 המכילה את תמיסת ההרדמה כדי לשמור על העובר לח.
- מניחים את הצלחת התחתונה זכוכית עם העובר תחת סטריאומיקרוסקופ פלורסנט עם מסנן פלורסנט (ערוץ 488 ננ"מ) עבור GFP+ חיידקים. אין להסיר את צלחת פטרי עד לרכישות נוספות עם אותם פרמטרים ב- 9, 14 ו- 18 hpi.
10. ניתוחי ביטוי של ציטוקינות פרו דלקתיות
- ב 20 hpi להנימה העוברים עם תמיסת tricaine 1x ולהעביר אותם מצלחת פטרי לצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- תחת מכסה המנוע אדים להסיר את תמיסת ההרדמה ולהחליף עם 200 μL של גאנידיום הידרוכלוריד רייגנט.
- הומוגניזציה עוברים על ידי pipetting אותם שוב דרך 200 μL פיפטה ראשון ולאחר מכן לפחות 15x עם מזרק אינסולין עם מחט סטרילית 27 G.
- לחלץ RNA הכולל של עוברי דגי זברה הומוגניים באמצעות reagentים הידרוכלוריד גואנידיום זמין מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
- לטפל 1 μg של כל מדגם של RNA עם 2 μL של 1U/μL של DNase I (RNase-free), בעקבות הוראות היצרן.
- השתמש 1 μg של DNase אני טיפלתי RNA לתגובה תמלול הפוך (RT) באמצעות ערכה מסחרית זמינה (ראה טבלת חומרים),בנפח כולל של 20 μL על פי הוראות היצרן.
- בצע RT qPCR תגובה בנפח כולל של 10 μL המכיל 1x SYBR ירוק mastermix באמצעות 1.5 μL של דילול 1:6 של תגובת RT. למטרות נורמליזציה, השתמש פריימרים עבור הגנים שמירת הבית rpl8 ולציטוקינות פרו דלקתיות, להשתמש פריימרים עבור TNF-α ו IL-1β (ראה טבלה 2). פרוטוקול qPCR היה: מחזור 1 שלב 1: 95 °C, 2 דקות, חזור פעם אחת; מחזור 2: שלב 1 95 °C, 10 s, שלב 2 55 °C, 30 s, חזור 40x; מחזור 3: שלב 1 72 °C, 15 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות ונתונים המוצגים כאן מכונים עוברי CF שנוצרו באמצעות הזרקת cftr morpholinos כמתוארקודם לכן 10 ובצעד 5. כדי לאמת את פנוטיפ CF, המיקום הלקויה של איברים פנימיים כגון לב, כבד, ולבלב כפישתואר קודם לכן 17 (איור 1) נחשבו. תוצאות דומות הושגו במקרה של עוברי WT כפי שדווח בפרסום הקודם שלנו19.
נטל חיידקים הופחת על ידי טיפול phage בעוברי CF נגוע PAO1. יתר על כן, הערכנו את הנטל החיידקי ב 8 hpi על ידי הומוגניזציה קבוצות של 15 עוברים: המספר הממוצע של חיידקים (cfu / עובר) הנוכחי PAO1 העוברים נגועים הצטמצם כ 20% לאחר טיפול ניהול phage, ובכך מאשר זיהום חמור פחות בנוכחות קוקטייל phage(איור 2).
קטלניות הופחתה על ידי טיפול phage בעוברי CF נגוע GFP+ חיידקים PAO1. עוברי דגי זברה CF ב 48 hpf הוזרקו עם GFP+ חיידקים של זן PAO1 במינון שגרם 50% קטלניות לאחר 20 hpi (30 cfu / עובר, איור 3A). אתר ההזרקה היה החלמון או צינור של Cuvier כדי ליצור זיהום מערכתי. טיפול Phage נגד זיהום PAO1 נבדק על ידי הזרקת 2 nL של קוקטייל phage מעורב באותה מידה (300-500 pfu / עובר). הזריקה בוצעה בשתי נקודות זמן שונות: 30 דקות (מוקדם) ו-7 שעות (מאוחר) לאחר הזרקת חיידקים. בשני המקרים, קטלניות הופחתה ב 20 hpi, המציין כי טיפול phage יעיל(איור 3B).
עם הדמיה חיה, באמצעות סטריאומיקרוסקופ פלורסנט, עקבנו גם אחר התקדמות הזיהום בעוברי CF מוזרק GFP+ PAO1 והראינו את היעילות של טיפול phage בהפחתת התפשטות של חיידקים פלורסנט על שאק חלמון. CF + PAO1 מוזרק עובר עם GFP + חיידקים כפל ב 4, 9, 14 ו 18 hpi מוצג בצד העליון של איור 4, בעוד CF + PAO1 + phages עובר עם פלואורסצנציה מופחתת בשל פעולת phage נגד חיידקים מוצג בחלק התחתון(איור 4).
טיפול Phage הפחית את התגובה הדלקתית שנוצרה על ידי זיהום PAO1 בעוברי CF. אנחנו, גם, הערכנו את התגובה החיסונית שנוצרה על ידי PAO1 ו PAO1 + הזרקת phages ב 8 hpi. כצפוי, הביטוי של ציטוקינות פרו דלקתיות TNF-a ו IL-1β נותח על ידי טכניקות qPCR גדל באופן משמעותי לאחר הזרקת PAO1 בהשוואה לפקדים, בעוד זה הופחת עם הזרקה שיתופית של קוקטייל phage(איור 5A,B).
איור 1: ייצור ואימות של עוברי CF על הזרקת CFTR morpholinos (cftr-MOs). (א)מיקום לקוי ולולאה של הלב בCF מוזרק עוברים בהשוואה לעוברי סוג פראי (WT). הלב הוא חזותי עם ביטוי cmlc2 על ידי בטכניקה היברידית situ. (ב) מיקום לקוי של הכבד (חצים) ולבלב בעוברי CF בהשוואה WT. כבד ולבלב הם חזותיים עם ביטוי prox1a על ידי בטכניקות הכלאה סיטו. סולות קנה מידה מציינים 100 μm. ליב: כבד; p: לבלב. הדמות מודפסת מחדש מ-19 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: נטל חיידקי בעוברי CF הנגועים PAO1 או PAO1 + phages. האחוז היחסי של cfu/עובר PAO1 +phages לעומת PAO1 עוברים ניתנים. דווח על ממוצע ואס.די של שלושה ניסויים עצמאיים. הדמות מודפסת מחדש מ-19. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: קטלניות של עוברי דגי זברה CF נגועים PAO1 ועם PAO1 +phages. (א)קביעה של LD50 ב-48 hpf עוברי דגי זברה microinjected עם CFTR-MO בשלב 1-cell (עוברי CF) ונדבק ב 48 hpf עם 2 nL של תרבות של PAO1 המכיל מספר גדל והולך של חיידקים (cfu / עובר). קטלניות העוברים נצפתה ב 20 hpi. (ב)קטלניות ב-20 hpi של עוברי CF שנדבקו ב-PAO1 ב-48 כ"ס וטופלו בקוקטייל הפאג' (PAO1+ באופן כללי). ממוצע וSD דיווח הם משישה וארבעה ניסויים, בהתאמה, כל אחד עם 25-40 עוברים. טרנספורמציה זוויתית הוחלה על אחוז הקטלניות ו-ANOVA בכיוון אחד ואחריו נעשה שימוש במבחן של דאנקן. הדמות מודפסת מחדש מ-19. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: הדמיה של היעילות של טיפול בפאג' בדגי זברה. התקדמות הזיהום בעוברי CF בעקבות הזרקת PAO1 (העובר העליון) ויעילות הטיפול בפאג' ב PAO1+phages מוזרק עוברים (עובר תחתון) ב 4, 9, 14 ו 18 hpi. סרגל קנה המידה מציין 100 מיקרון. הדמות מודפסת מחדש מ-19. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: ביטוי של ציטוקינות פרו ואנטי דלקתיות בעקבות PAO1 ו- PAO + phage ניהול. רמות הביטוי של הגנים TNF-a (A) ו- IL-1β נמדדים על ידי RT-qPCR ב 8 hpi בעוברי CF מוזרקים PAO1 ו PAO1 + באופן כללי ב 48 hpf ומנורמל באמצעות הביטוי של rpl8. ממוצע וSD של ארבעה ניסויים מדווחים. משמעות סטטיסטית הוערכה על ידי ANOVA ואחריו המבחן של דאנקן: עבור TNF- a (CF) לעומת (CF+PAO1) p = 0.015*; (CF) לעומת (CF+PAO1+Ω) p = 0.019*; (CF+PAO1) לעומת (CF+PAO1+ באופן כללי) p = 0.77 n.s.; עבור IL-1β (CF) לעומת (CF+PAO1) p = 0.00014***; (CF) לעומת (CF+PAO1+ באופן כללי) p = 0.00068***; (CF+PAO1) לעומת (CF+PAO1+ באופן כללי) p = 0.031*. הדמות מודפסת מחדש מ-19. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
| פתרונות | הכנה |
| פתרון מניות הרדמה פי 25 | 4 מ"ג/מ"ל של טריקין ב-H 2 Oמזוקק. |
| פתרון עבודה הרדמה 1X | לדלל מזוקק H 2 Oפתרוןהמניות Tricaine 25X הכנה להגיע 1X ריכוז (0.16 מ"ג / מ"ל) Tricaine של מזוקק H2O. |
| CsCl d =1.3 | 20.49 גר' ב-50 מ"ל TN |
| CsCl d = 1.4 | 20.28 גר' ב-50 מ"ל TN |
| CsCl d = 1.5 | 34.13 גר' ב-50 מ"ל TN |
| CsCl d = 1.6 | 41.2 גר' ב-50 מ"ל TN |
| עובר E3 בינוני לעובר דגי זברה | 1 L 1of E3 (לדלל את מניית 50X עם מזוקק H2O) + 200 μl של 0.05% מתיל כחול . חנות בRT. |
| פתרון מלאי בינוני של עובר E3 (50X) | 73.0 גרם NaCl, 3.15 גרם KCl , 9.15 גרם CaCl2, ו 9.95 g MgSO4 ב 5 L של מזוקק H2O. חנות RT. |
| ל.ב. אגר | 10 גרם/ל טריפטון, תמצית שמרים 5 גרם/ל', 5 גרם/ל NaCl, 10 גרם/לגר |
| מרק LB | עבור 1L: 950 מ"ל H2O, 10 גרם דרך ליפטונה, 10 גרם NaCl, 5 גרם תמצית שמרים |
| פי.בי.אס.אס.פי.אס | PBS 1X + טריטון X 1% |
| פתרון פיזיולוגי | 0.9% נאק"ל |
| פיגמנטציה חוסמת פתרון מניות פי 10 | 0.3 מ"ג/מ"ל פאניל תיוריאה (PTU) אבקה במדיום עובר E3 לעובר דגי זברה |
| פתרון מניות Pronase פי 5 | 5 מ"ג / מ"ל אבקת פרונאז ב E3 עובר בינוני עבור עובר דגי זברה |
| מאגר TN | 10 מ'מ טריס HCl pH 8.0, 150 מ"ר NaCl |
טבלה 1: הכנת פתרונות.
| שם גן | רצף פריימר |
| TNF-אלפא Fw | 5'-TGCTTCACCACTCCATAAGACC-3' |
| ת.נ.פלפה ראב | 5'-קאצ'קטגאגאגאג-גאג-ג'אג-ג'אג-ג'אג-ג'אג-ג'אג-ג'אג-ג'אג-ג'אג-ג'אג-ג'אג- |
| IL1-בטא Fw | 5'-TGGACTTCGCAGCACAAAATG-3' |
| IL1-בטא Rev | 5'-CGTTCACTTCACCTCTGGATG-3' |
| rpl8 Fw | 5'-CTCCGTCTTCAAGCCCAT-3' |
| rpl8 Rev | 1.75'-17:00-17:00,000 ---------------------------- |
טבלה 2: פריימרים המשמשים עבור RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בכתב יד זה, תיארנו את הפרוטוקול לבצע P. aeruginosa (PAO1) זיהום בעוברי דגי זברה ואיך ליישם טיפול phage עם קוקטייל של phages שזוהו בעבר כמסוגל להדביק PAO1 כדי לפתור את זה. השימוש bacteriophages כחלופה לטיפולים אנטיביוטיים כבר עניין גובר מאז השנים האחרונות. זה בעיקר בשל דיפוזיה של זיהומים חיידקיים עמידים לתרופות מרובות (MDR), המהווים בעיה רצינית לבריאות הציבור. כמובן, היקף העבודה הזו מוגבל ליישום של טיפול בפאג' למודל של בעלי חיים ולא לבני אדם. עם זאת, יצרנו מודל זברה סיסטיק פיברוזיס עם הזרקת מורפולינו מיקוד הגן cftr, מדגים את היעילות של טיפול phage גם במודל פתוגנטי רגיש במיוחד P.aeruginosa זיהום.
יש לציין כי אנו יכולים בקלות להשיג טיפול phage, כמו בעבודה קודמת, בודדנו ולאפיין phages שונים מסוגל להדביק P. aeruginosa הן במבחנה והן ב vivo8. צעד זה הוא בסיסי כדי להשיג את הפעילות מיקרוביאלית של phages. הבידוד והאפיון של phages מסוגל להדביק זן חיידקי ספציפי הם צעדים קריטיים של יישום טיפול phage. ואכן, כדי להימנע מתופעות לוואי של פרעה על בעל החיים/האדם המארח, יש צורך להשתמש בפאגים ליתיים במקום באלה ליזוגניים. והכי חשוב, יש צורך לבדוק את הגנום phage לנוכחות של גנים מזיקים כמו אלה לעמידות לאנטיביוטיקה, virulence והעברת גנים.
טיפול Phage כבר היה בשימוש מוצלח במודלים אחרים של בעלי חיים. אנו מודעים לכך שדגי זברה אינם מודל יונקים והשפעות מסוימות של phages עשויות להיות שונות. עם זאת, מכיוון שלדגי זברה יש מערכת חיסונית מולדת הדומה לזו האדם עם אוכלוסייה משוחזקתשל נויטרופילים וקרופאגים 23, אנו משערים כי הנתונים על התגובה החיסונית יכולים להיות להתרבות בבני אדם. יתר על כן, דגי זברה מוערך היטב עבור מחקרי זיהום חיידקי, השימוש בו כובחן ליעילות טיפול phage עשוי להיות מבטיח עבור גישות טיפוליות. אכן, הזיהום יכול להיות מערכתי אם חיידקים מוזרקים לתוך זרימת הדם דרך צינור של Cuvier, או מקומי כפי שדווח17. ביצענו זיהומים מערכתיים ומקומיים והראינו כי הם יצרו באופן דומה קטלניות מוגברת ונטל חיידקי ששניהם ירדו בעקבות יישום טיפול בפאג'. יתר על כן, מאז GFP+ פלואורסצנט PAO1 חיידקים הוזרק, זה היה קל לעקוב אחר הזיהום בנקודות זמן שונות של התפתחות העובר המאשר את הירידה של חיידקים פלורסנט כאשר phages הוזרקו.
למיטב ידיעתנו, זהו התיאור הראשון של יישום טיפול phage בדגי זברה, עם ערך מוסף להדגמה של פעילות מיקרוביאלית phages נגד P. aeruginosa ברקע CF, כי הוא רגיש במיוחד זיהום חיידקי זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס האיטלקית (FFC#22/2017; אסוציאציה "גלי אצ'י דלה ריטי" קסניגו ו-FFC#23/2019; האו"ם respiro בפיו Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
