Summary
Apresentado aqui é um protocolo para a infecção por Pseudomonas aeruginosa e aplicação de terapia de phage em embriões de zebrafish fibrose cística (CF).
Abstract
A resistência antimicrobiana, uma das principais consequências da incerteza diagnóstica e da superprescrição antimicrobiana, é uma causa cada vez mais reconhecida de infecções graves, complicações e mortalidade em todo o mundo com um enorme impacto em nossa sociedade e no sistema de saúde. Em particular, pacientes com sistemas imunológicos comprometidos ou patologias pré-existentes e crônicas, como a fibrose cística (CF), são submetidos a tratamentos antibióticos frequentes para controlar as infecções com a aparência e difusão de isolados resistentes a multidroga. Portanto, é urgente abordar terapias alternativas para combater infecções bacterianas. O uso de bacteriófagos, os inimigos naturais das bactérias, pode ser uma solução possível. O protocolo detalhado neste trabalho descreve a aplicação da terapia de phage contra a infecção por Pseudomonas aeruginosa em embriões de zebrafish CF. Os embriões de zebrafish foram infectados com P. aeruginosa para demonstrar que a terapia phage é eficaz contra infecções por P. aeruginosa, pois reduz a letalidade, a carga bacteriana e a resposta imune pró-inflamatória em embriões CF.
Introduction
A terapia phage, o uso dos inimigos naturais das bactérias para combater infecções bacterianas, está ganhando interesse renovado à medida que a resistência bacteriana aos antibióticos se torna generalizada1,,2. Esta terapia, utilizada há décadas na Europa Oriental, poderia ser considerada um tratamento complementar a antibióticos na cura de infecções pulmonares em pacientes com CF e uma possível alternativa terapêutica para pacientes infectados com bactérias resistentes a todos os antibióticos atualmente em uso2,,3. As vantagens da terapia antibiótico são que os bacteriófagos se multiplicam no local da infecção, enquanto os antibióticos são metabolizados e eliminados do corpo4,,5. De fato, a administração de coquetéis de phages virulentos isolados em diferentes laboratórios tem se mostrado eficaz no tratamento de infecções pseudomonas aeruginosa em modelos animais tão diferentes quanto insetos e mamíferos6,,7,,8. A terapia de phage também mostrou-se capaz de reduzir a carga bacteriana em feridas de queimadura infectadas com P. aeruginosa e Escherichia coli em um ensaio clínico randomizado9.
O zebrafish (Danio rerio) emergiu recentemente como um modelo valioso para estudar infecções com vários patógenos, incluindo P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus e Burkolderia cepacia12,13. Ao microinjetar bactérias diretamente na circulação sanguínea do embrião14 é fácil estabelecer uma infecção sistêmica que é neutralizada pelo sistema imunológico inato de zebrafish, que é conservado evolutivo com neutrófilos e geração de macrófagos semelhante à contraparte humana. Além disso, durante o primeiro mês de vida, os embriões de zebrafish carecem da resposta imune adaptativa, tornando-os modelos ideais para estudar a imunidade inata, que é o mecanismo crítico de defesa em infecções pulmonares humanas15. O zebrafish surgiu recentemente como um poderoso sistema de modelo genético para entender melhor o início da CF e desenvolver novos tratamentos farmacológicos10,,16,17. O modelo de zebrafish CF de cftr knock-down gerado com injeção de morfolino em zebrafish apresentou uma resposta de explosão respiratória amortecida e reduziu a migração de neutrófilo10, enquanto o nocaute do CFTR leva à posição do órgão interno prejudicada e à destruição do pâncreas exócrino, um fenótipo que espelha a doença humana16,17. De maior interesse foi a constatação de que a carga bacteriana P. aeruginosa foi significativamente maior em embriões de perda de função cftrdo que em controles em 8 horas pós-infecção (hpi), o que paralelamente aos resultados obtidos com camundongos e células epiteliais brônquias humanas2,,18.
Neste trabalho, demonstramos que a terapia de phage é eficaz contra infecções por P. aeruginosa em embriões de zebrafish.
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Protocol
Os zebrafish adultos (Danio rerio) da cepa AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) são mantidos de acordo com as diretrizes internacionais (Diretiva da UE 2010/63/UE) e nacionais (decreto italiano 4de março de 2014, n. 26) sobre a proteção de animais usados para fins científicos. As condições padrão são definidas na instalação de peixes com um ciclo escuro de 14 horas/10 h e temperatura da água do tanque a 28° C.
1. Elaboração de soluções e ferramentas
- Prepare uma solução de estoque de 50x e soluções de trabalho 1x para o meio de embrião E3 para embriões de zebrafish em crescimento (ver Tabela 1).
- Faça solução de bloqueio de pigmentação, para bloquear a pigmentação do embrião a partir de 24 horas após a fertilização (24 hpf) (ver Tabela 1).
- Prepare estoque de 25x e solução anestésica tricane de trabalho 1x, conforme descrito na Tabela 1.
NOTA: Para evitar o congelamento e o descongelamento repetidos da solução que poderia danificar a solução de estoque, faça alíquotas de 2 mL de tricaine 25x e armazene-as a -20 °C. - Prepare as faixas para microinjeção de embriões dissolvendo 1 g de agarose em 100 mL de H2O destilado em um frasco ou garrafa microwavable. Micro-ondas por 1-3 min até que a agarose esteja completamente dissolvida.
- Posicione os moldes de microinjeção de zebrafish (ver Tabela de Materiais) virados de cabeça para baixo em uma placa de Petri (90 mm x 15 mm) e cubra toda a superfície derramando o gel líquido de agarose com uma largura de aproximadamente 10 mm.
- Remova o molde assim que a agarose se solidificar. Encha a placa de Petri com 1x de meio de embrião E3. Isso pode ser armazenado a 4 °C por aproximadamente uma semana. Antes de usar, substitua pelo meio E3 fresco contendo Tricaine.
NOTA: Moldes mais antigos podem desenvolver fungos ou contaminações bacterianas. - Use capilares de 10 cm polidos de fogo para preparar agulhas para microinjeção e fixá-las no puxador de micropipette apertando as alças. Ajuste o puxador com as seguintes configurações: calor 500, velocidade 100, tempo 150, puxe 150.
2. P. aeruginosa (PAO1) preparação inóculo
- Inoculação 1 colônia de GFP+P. aeruginosa cepa PAO119 em 5 mL de caldo LB (ver Tabela 1) e crescer durante a noite a 37 °C com agitação (200 rpm).
- Diluir a cultura da noite para OD600 = 0,1 em 10 mL de caldo LB e crescer para OD600 = 0,5 a 37 °C com agitação (200 rpm).
- Centrifugar 2 mL da cultura por 2 min a 4 °C a 16.100 x g e resuspengar a pelota celular para OD600 = 1, equivalente a cerca de 1 x 109 cfu/mL, em 1 mL da solução fisiológica (ver Tabela 1).
- Diluir a suspensão celular para cerca de 5 x 107cfu/mL em solução fisiológica e armazenar a 4 °C.
3. Preparação de estoque de phage
- Inocular 1 colônia de P. aeruginosa cepa PAO1 em 5 mL de caldo LB e incubar durante a noite a 37 °C com agitação. Diluir a cultura da noite paraOD 600 = 0,01 em 500 mL de caldo LB e crescer a 37 °C com agitação para OD600 = 0,05, equivalente a cerca de 2,5 x 107 cfu/mL.
- À cultura diluída de P. aeruginosa,adicione cerca de 1,25 x 107 phages, para obter a multiplicidade de infecção (M.O.I.) de 10-3. Incubar a 37 °C com agitação até que o OD600 caia para cerca de 0,1-0,3 (em cerca de 3 a 5 horas, dependendo do phage utilizado).
NOTA: Foram selecionados quatro phages para este experimento que infectam a cepa PAO1: Dois Podoviridae, números de adesão do GenBank vB_PaeP_PYO2, MF490236 e vB_PaeP_DEV, MF490238, e dois Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 e vB_PaeM_E217, MF490240. Realize as etapas abaixo para cada phage individualmente. - Incubar o lysate com 1 mg/mL de DNase e RNase por 30 min a 37 °C. Centrifugar a 5.000 x g por 30 min a 4 °C e recuperar cuidadosamente o supernaspe (SN). Filtre o SN com um filtro com 0,8 μm de diâmetro de poros.
- Ao SN, adicione 58 g/L de NaCl e 105 g/L de PEG6000. Dissolva-se com agitação em RT 20 min e, em seguida, mantê-lo durante a noite a 4 °C. Centrífuga a 20.000 x g por 30 min a 4 °C para precipitação de phage. Remova o SN e dissolva cuidadosamente a pelota de phage em 15 mL de tampão TN (ver Tabela 1).
- Purifique os phages com gradiente de densidade CsCl, conforme descrito nas etapas abaixo.
- Em um tubo de ultracentrificação de poliallômero para rotor SW41, prepare um gradiente de densidade de passo CsCl estratificando 2 mL das quatro soluções CsCl descritas na Tabela 1. Adicione 3,5 mL de suspensão de phage em cada um dos 4 tubos.
NOTA: CsCl é tóxico, adotar procedimentos de segurança adequados para manuseá-lo e descartá-lo. - Introduza os tubos no rotor e certifique-se de que os tubos estejam equilibrados (a diferença de peso entre os dois tubos voltados deve ser ≤ 0,01g).
- Centrifugar por 2h a 4 °C e 100 x g (25.000 rpm para rotor SW41). Após a centrifugação, remova lentamente os tubos e imobilize-os cuidadosamente em um suporte. Usando uma seringa com agulha de 19 G, elas desenhe a faixa branca/opalescente que está localizada geralmente entre a região de densidade d=1,5 e a d=1,4.
- Transfira as suspensões da seringa para novos tubos de polinômero para rotor SW60 e use a solução d=1.4 para equilibrar com precisão os tubos.
- Centrifugar a suspensão a 4 °C e 150.000 x g (38.000 rpm para o rotor SW60) por pelo menos 16 h.
- Colete a faixa visível como acima (ver passo 3.3.3) e transfira-as para tubos de diálise com 6.000 da cut-off. Dialise a faixa visível obtida 2x por 20 min contra 500 mL de água e durante a noite contra 500 mL de tampão TN. Filtrar com um filtro de poros de 0,22 μm e armazenar a 4 °C.
- Em um tubo de ultracentrificação de poliallômero para rotor SW41, prepare um gradiente de densidade de passo CsCl estratificando 2 mL das quatro soluções CsCl descritas na Tabela 1. Adicione 3,5 mL de suspensão de phage em cada um dos 4 tubos.
4. Preparação para coquetéis de phage
- Faça uma mistura de quatro phages que infectam a cepa PAO1, anteriormente isolada e caracterizada8. Antes de misturar, estime o título de cada estoque de phage por ensaio de placa20.
- Monte o coquetel de phage, com um titer global de 5 × 108 pfu/mL, misturando igualmente quatro preparações de phage no mesmo pfu/mL imediatamente antes de cada experimento, para garantir titulações phage precisas.
5. Coleta e preparação de embriões de zebrafish para microinjeção de morfolnos cftr
NOTA: Coletar 1-2 embriões de células de zebrafish tipo selvagem para microinjeção cftr morpholinos(cftr-MOs).
- Dois dias antes do experimento de microinjeção bacteriana, configure pares de reprodução e colete embriões conforme descrito anteriormente21. Os zebrafish adultos (Danio rerio) da cepa AB foram comprados do European Zebrafish Resource Center, EZRC.
- No dia seguinte, colete os embriões imediatamente após a fertilização com uma pipeta plástica ou usando um coador de malha fina. Coloque os embriões coletados em uma placa de Petri contendo meio embrião E3 e remova cuidadosamente os detritos com uma pipeta plástica para evitar contaminação que possa prejudicar o desenvolvimento do embrião.
- Prepare 5 μL de solução de injeção de morfolino diluindo as duas soluções de estoque de morfolino (1 mM) em água estéril para uma concentração final de 0,25 pmol/embrião ATG-MO + 0,25 pmol/embrião-MO. Para rastrear a injeção de embrião, adicione 0,5 μL de fenol vermelho à mistura da solução de injeção de morfolino.
- Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL da solução de mistura de morfelino usando uma micropipette de 20 μL com uma ponta de carregamento de gel fino. Fixar a agulha no micromanípulo conectado a um suporte e posicioná-la sob um estereótipo.
NOTA: Não é necessário que a solução atinja a ponta da agulha, pois a pressão da bomba microinjetor irá empurrá-la. - Corte a ponta da agulha cortando a ponta da agulha com pinças finas e estéreis. Meça o diâmetro da gota usando uma barra de escala no ocular do microscópio. Alternativamente, crie uma gota de óleo mineral em um slide de micrômetro e ajuste o volume de microinjeção injetando a solução na gota de óleo para avaliar o tamanho da gotícula. Use uma gota com um diâmetro de 156 μm para injetar um volume de 2 nL.
- Ajuste o microinjetor ajustando a pressão de compensação para 15 hPa, tempo de injeção para 0,5 s e pressão de injeção entre 300 e 600 hPa para obter o volume correto de injeção dependendo da agulha utilizada.
- Com uma pipeta plástica organize os embriões da etapa 5.2 em um vidro posicionado em uma placa de Petri de 96 mm de diâmetro.
NOTA: Muito meio E3 impedirá a penetração adequada da agulha de microinjeção na coro dos embriões. - Penetre o acorde e, em seguida, a gema com a agulha para injetar 2 nL no embrião como descrito anteriormente22.
- Coloque embriões injetados em uma placa de Petri com meio E3 e coloque-os em uma incubadora a 28 °C para deixá-los se desenvolver até o dia seguinte.
6. Microinjeção de embriões de zebrafish com bactérias e coquetel de phage
NOTA: Para realizar uma infecção sistêmica, o embrião deve ter circulação sanguínea que geralmente começa após 26 hpf.
- Após 26 hpf (para estágios de desenvolvimento de zebrafish, consulte Kimmel21) embriões descorrionatos com solução de pronase preparados pela dissolução do pó de pronase em meio E3 a uma concentração de 2 mg/mL. Pipeta suavemente os embriões para quebrar o acorde. Descarte o meio pronase/E3 e enxágue o prato várias vezes com E3 fresco para remover toda a pronase.
- Anesthetize embriões de zebrafish em E3 médio contendo Tricaine aproximadamente 5 minutos antes das injeções.
- Pipeta os embriões anestesiados na pista preparados na etapa 1. Use uma ponta de carregamento de gel fino para forrar os embriões na posição lateral.
- Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL da preparação de P. aeruginosa conforme descrito na parte 5.
- Insira a agulha dorsalmente ao ponto de partida do duto de Cuvier, onde ela começa a se espalhar sobre o saco de gema. Injete um volume de 1-3 nL e certifique-se de que o volume se expanda diretamente dentro do duto e entre na circulação.
- Aproximadamente após cada 50 embriões injetados, injete uma gota da bactéria em um tubo de centrífuga de 1,5 mL com 100 μL de PBS estéril para verificar se o volume de injeção permanece o mesmo. Emplaque o inóculo no ágar LB (ver Tabela 1) a 37 °C durante a noite para avaliar a UFC.
- Transfira os embriões microinjetados em duas placas de Petri limpas com e3 médio fresco + PTU e incuba-os a 28 °C.
- Em dois pontos de tempo selecionados: 30 min ou 3 h após a injeção bacteriana, retire uma das placas de Petri com embriões injetados por bactérias da incubadora e alinhe-os na pista, conforme descrito em 6.3 para a injeção de coquetel phage.
- Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL do coquetel de phage (preparado na etapa 4) com uma ponta de carregamento de gel fino e fixe-a no microinjetor (ver passo 5).
- Injete o coquetel de phage no duto de Cuvier dos embriões previamente injetados com bactérias.
- Transfira os embriões microinjetados em duas placas de Petri limpas com e3 médio fresco + PTU e incuba-os a 28 °C.
7. Avaliação da carga bacteriana de embriões injetados com PAO1 e phages
- A 8 hpi, pipeta 15 embriões anestesiados da placa de Petri para um tubo de centrífugas de 1,5 mL.
- Substitua a solução anestésica por 300 μL de 1% Triton X-100 em PBS (PBSTritonX) e homogeneize os embriões passando-os pelo menos 15x através de uma seringa de insulina com uma agulha estéril de 27 G.
- Prepare diluições seriais de homogeneizadores em PBS estéreis transferindo 100 μL do homogenate diluído em 900 μL de PBS estéril.
- Para selecionar para a cepa PAO1 naturalmente resistente, a placa 100 μL das diluições no ágar LB adicionada com ampicillina (100 μg/mL) e incubar a 37 °C durante a noite.
- No dia seguinte, conte o número de colônias, multiplique pelo fator de diluição para determinar o número total de UFC, e divida pelo número de embriões homogeneizados para obter o número médio de UFC/embrião infectado.
8. Avaliação da letalidade dos embriões injetados com PAO1 e phages
- Para avaliar a letalidade da infecção por PAO1, escore os embriões injetados em 20 hpi sob um estereótipo e conte para os embriões mortos (branco/não transparente).
- Calcule a dose de concentração letal semi-máxima de 50 (LD50) de PAO1 que determina a morte de 50% dos embriões injetados a 20 hpf.
9. Preparação embrionária para imagens de lapso de tempo estereomicroscope da infecção por GFP+ PAO1
- Prepare o molde para imagens de embriões vivos dissolvendo 1,5% de baixa agarose de fusão em 100 mL de solução E3.
- Adicione 1% de Tricaine (ver Tabela 1) para anestesiar os embriões.
- A 4 hpi transfira um embrião com uma pipeta de plástico em um prato de fundo de vidro e adicione a solução agarose de ponto de fusão baixa quente.
- Posicione a placa de fundo de vidro sob um estereótipo e com uma ponta posicione o embrião na orientação desejada. Use uma pipeta de plástico para adicionar cuidadosamente uma gota de agarose no embrião.
- Deixe a agarose esfriar por 5-10 min e encha delicadamente o prato de fundo de vidro com E3 contendo a solução anestésica para manter o embrião úmido.
- Coloque a antena inferior de vidro com o embrião sob o estereóscópio fluorescente com um filtro fluorescente (canal 488 nm) para bactérias GFP+. Não remova a placa de Petri até novas aquisições com os mesmos parâmetros de 9, 14 e 18 cv.
10. Análises de expressão de citocinas pró-inflamatórias
- A 20 hpi anestesia os embriões com solução tricaine 1x e transfira-os da placa de Petri para um tubo de centrífugas de 1,5 mL.
- Sob um capô de fumaça remova a solução anestéstica e substitua por 200 μL de reagente de cloridrato de guanidium.
- Homogeneize os embriões ao pipetá-los repetidamente através de uma pipeta de 200 μL primeiro e, em seguida, pelo menos 15x com uma seringa de insulina com uma agulha estéril de 27 G.
- Extrair RNA total de embriões homogeneizados de zebrafish usando um reagente de cloridrato de guanidium comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante.
- Trate 1 μg de cada amostra de RNA com 2 μL de 1U/μL de DNase I (sem RNase), seguindo as instruções do fabricante.
- Use 1 μg de RNA tratado DNase I para reação de transcrição reversa (RT) usando kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais),em um volume total de 20 μL de acordo com as instruções do fabricante.
- Execute a reação qPCR RT em um volume total de 10 μL contendo 1x SYBR Green mastermix usando 1,5 μL de uma diluição de 1:6 da reação RT. Para fins de normalização, use os primers para os genes de manutenção da casa rpl8 e para citocinas pró-inflamatórias, use primers para TNF-α e IL-1β (ver Tabela 2). o protocolo qPCR foi: ciclo 1 passo 1: 95 °C, 2 min, repetir uma vez; ciclo 2: passo 1 95 °C, 10 s, passo 2 55 °C, 30 s, repetir 40x; ciclo 3: passo 1 72 °C, 15 min.
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Representative Results
Os resultados e os números aqui apresentados são encaminhados aos embriões cf gerados através da injeção de morfoolinos cftr como descrito anteriormente10 e na etapa 5. Para validar o fenótipo cf, considerou-se a posição prejudicada de órgãos internos como coração, fígado e pâncreas, conforme descrito anteriormente17 (Figura 1). Resultados semelhantes foram obtidos no caso dos embriões WT, conforme relatado em nossa publicação anterior19.
A carga bacteriana foi reduzida pela fisioterapia em embriões CF infectados com PAO1. Além disso, avaliamos a carga bacteriana em 8 hpi por homogeneizar grupos de 15 embriões: o número médio de bactérias (cfu/embrião) presente nos embriões infectados pao1 foi reduzido para cerca de 20% após o tratamento administrativo da phage, confirmando assim uma infecção menos grave na presença do coquetel phage(Figura 2).
A letalidade foi reduzida pela fisioterapia em embriões CF infectados com GFP+ bactéria PAO1. Os embriões de zebrafish CF a 48 hpf foram injetados com GFP+ bactérias da cepa PAO1 em uma dose que causou 50% de letalidade após 20 hpi (30 cfu/embrião, Figura 3A). O local da injeção foi a gema ou o ducto de Cuvier para gerar uma infecção sistêmica. A terapia de phage contra a infecção pelo PAO1 foi testada injetando 2 nL do coquetel de phage igualmente misto (300-500 pfu/embrião). A injeção foi realizada em dois pontos de tempo diferentes: 30 minutos (cedo) e 7 horas (atrasado) após injeção bacteriana. Em ambos os casos, a letalidade foi reduzida a 20 hpi, indicando que a terapia phage é eficaz(Figura 3B).
Com imagens ao vivo, utilizando um estereótipo fluorescente, também acompanhamos a progressão da infecção em embriões CF injetados com GFP+ PAO1 e mostramos a eficácia da terapia de phage na redução da propagação de bactérias fluorescentes sobre o saco de gema. O embrião injetado CF+PAO1 com multiplicação de bactérias GFP+ em 4, 9, 14 e 18 hpi é mostrado na parte superior da Figura 4, enquanto o embrião CF+PAO1+phages com fluorescência reduzida devido à ação de phage contra bactérias é mostrado na parte inferior(Figura 4).
A terapia de phage reduziu a resposta inflamatória gerada pela infecção por PAO1 em embriões CF. Também avaliamos a resposta imune gerada pela injeção de PAO1 e PAO1 + phages a 8 hpi. Como esperado, a expressão das citocinas pró-inflamatórias TNF-a e IL-1β analisadas pelas técnicas qPCR foi significativamente aumentada após a injeção de PAO1 em comparação com os controles, enquanto foi reduzida com a co-injeção do coquetel de phage(Figura 5A,B).
Figura 1: Geração e validação de embriões CF após injeção de cftr morpholinos(cftr-MOs). (A) Posição prejudicada e looping do coração em embriões injetados cf em comparação com embriões do tipo selvagem (WT). O coração é visualizado com expressão cmlc2 pela técnica de hibridização in situ. (B) Posição prejudicada do fígado (setas) e pâncreas em embriões CF em comparação com WT. Fígado e pâncreas são visualizados com expressão prox1a por técnicas de hibridização in situ. As barras de escala indicam 100 μm. liv: fígado; p: pâncreas. A figura é reimpressa a partir de19 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Carga bacteriana em embriões CF infectados com PAO1 ou PAO1+phages. A porcentagem relativa de cfu/embrião em embriões PAO1+phages vs PAO1 é dada. A média e a SD de três experimentos independentes são relatadas. O número é reimpresso a partir de19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Letalidade de embriões de zebrafish CF infectados com PAO1 e com PAO1+phages. (A) Determinação de LD50 em embriões de zebrafish de 48 hpf microinjetados com cftr-MOem estágio de 1 célula (embriões CF) e infectados a 48 hpf com 2 nL de uma cultura de PAO1 contendo número crescente de bactérias (cfu/embrião). A letalidade dos embriões foi observada em 20 hpi. (B) Letalidade a 20 hpi de embriões CF infectados com PAO1 a 48 hpf e tratados com o coquetel phage (PAO1+ Φ). A média e a SD relatadas são de seis e quatro experimentos, respectivamente, cada um com 25-40 embriões. A transformação angular foi aplicada à porcentagem de letalidade e a ANOVA unidirecional seguida pelo teste de Duncan foi usada. O número é reimpresso a partir de19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem da eficácia da terapia de phage em zebrafish. Progressão da infecção em embriões CF após injeção de PAO1 (embrião superior) e eficácia da terapia de phage em pao1+phages injetou embriões (embrião inferior) em 4, 9, 14 e 18 hpi. A barra de escala indica 100 mícrons. O número é reimpresso a partir de19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias seguindo a administração PAO1 e PAO+phage. Níveis de expressão dos genes TNF-a (A) e IL-1β medidos por RT-qPCR a 8 hpi em embriões CF injetados com PAO1 e PAO1+Φ a 48 hpf e normalizados usando a expressão de rpl8. A média e a SD de quatro experimentos são relatadas. A significância estatística foi avaliada pela ANOVA seguida do teste de Duncan: para TNF- a (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,015*; (CF) vs (CF+PAO1+Φ) p = 0,019*; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,77 n.s.; para IL-1β (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,00014**; (CF) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,00068***; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,031*. O número é reimpresso a partir de19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Soluções | Preparação |
| Solução de ações anestésica 25X | 4 mg/mL de Tricaine em H2O destilado. |
| Solução de trabalho anestésico 1X | diluído em H2O da solução de estoque tricaine 25X preparação para alcançar a concentração de 1X (0,16 mg/mL) Tricaine de H2O destilado. |
| CsCl d=1.3 | 20,49 g em 50 mL TN |
| CsCl d=1.4 | 20,28 g em 50 mL TN |
| CsCl d=1,5 | 34,13 g em 50 mL TN |
| CsCl d=1.6 | 41,2 g em 50 mL de TN |
| Meio de embrião E3 para embrião de zebrafish | 1 L 1 de E3 (diluir o estoque de 50X com H2O destilado) + 200 μl de 0,05% azul metil . Loja na RT. |
| Solução de estoque médio de embrião E3 (50X) | 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl , 9,15 g CaCl2 , e 9,95 g MgSO4 em 5 L de H2O. Destilado Loja na RT. |
| Ágar LB | 10 g/L triptona, extrato de levedura 5 g/L, 5 g/L NaCl, 10 g/L de ágar |
| Caldo LB | para 1L: 950 mL H2O, 10 g Tripptone, 10 g NaCl, extrato de levedura de 5 g |
| PBST | PBS 1X + Tritão X 1% |
| Solução fisiológica | 0,9% NaCl |
| Solução de estoque de bloqueio de pigmentação 10X | 0,3 mg/mL fenil thiourea (PTU) em pó de embrião E3 para embrião de zebrafish |
| Solução de ações pronase 5X | 5 mg/mL de pronase em pó em embrião E3 para embrião de zebrafish |
| Tampão TN | 10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl |
Tabela 1: Preparação de soluções.
| Nome genético | Sequência de primer |
| TNF-alfa Fw | 5'-TGCTTCACGCTCCATAAGACC-3' |
| TNFalpha Rev | 5'-CAAGCCACCTGAAGAAAAAGG-3' |
| IL1-beta Fw | 5'-TGGACTTCGCAGCAAAATG-3' |
| IL1-beta Rev | 5'-CGTTCACTTCACCTCTTGGATG-3' |
| rpl8 Fw | 5'-CTCCGTCTTCAAAGCCCAT-3' |
| rpl8 Rev | 5'-TCCTTCACGATCCCCTTGAT-3' |
Tabela 2: Primers usados para RT-qPCR.
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Discussion
Neste manuscrito, descrevemos o protocolo para realizar a infecção por P. aeruginosa (PAO1) em embriões de zebrafish e como aplicar a terapia de phage com um coquetel de phages previamente identificado como capaz de infectar PAO1 para resolvê-lo. O uso de bacteriófagos como alternativa aos tratamentos com antibióticos tem sido de crescente interesse desde os últimos anos. Isso se deve principalmente à difusão de infecções bacterianas multidrogas resistentes (MDR), que constituem um problema sério para a saúde pública. É claro que o escopo deste trabalho limita-se à aplicação da terapia de phage a um modelo animal e não aos seres humanos. No entanto, geramos um modelo de zebrafish de fibrose cística com a injeção de um morfolino direcionado ao gene cftr, demonstrando a eficácia da terapia de phage também em um modelo patogênico particularmente suscetível à infecção por P.aeruginosa.
Note-se que poderíamos facilmente alcançar a terapia phage, como em um trabalho anterior, isolamos e caracterizamos diferentes phages capazes de infectar P. aeruginosa tanto in vitro quanto in vivo8. Esta etapa é fundamental para a obtenção da atividade antimicrobiana dos phages. O isolamento e a caracterização de phages capazes de infectar uma cepa bacteriana específica são etapas críticas da aplicação da terapia de phage. De fato, para evitar efeitos adversos das pragas no hospedeiro animal/humano, é necessário usar phages líticos em vez daqueles lisogênicos. Mais importante, é necessário verificar os genomas phage para a presença de genes nocivos como aqueles para resistência a antibióticos, virulência e transferência genética.
A terapia phage já foi usada com sucesso em outros modelos animais. Estamos conscientes de que o zebrafish não é um modelo mamífero e alguns efeitos das pragas podem ser diferentes. No entanto, uma vez que os zebrafish possuem um sistema imunológico inato comparável ao humano com uma população conservada de neutrófilos e macrófagos23,especulamos que os dados sobre a resposta imune poderiam ser reprodutíveis em humanos. Além disso, o zebrafish é bem avaliado para estudos de infecção bacteriana, seu uso como testador para a eficácia da terapia de phage pode ser promissor para abordagens terapêuticas. De fato, a infecção pode ser sistêmica se as bactérias forem injetadas na circulação através do Duto de Cuvier, ou localizadas como relatado17. Realizamos infecções sistêmicas e localizadas e demonstramos que elas geraram, da mesma forma, aumento da letalidade e da carga bacteriana que foram diminuídas após a aplicação da terapia de phage. Além disso, como a bactéria GFP+ fluorescente PAO1 foi injetada, foi fácil acompanhar a infecção em diferentes pontos de tempo do desenvolvimento de embriões confirmando a redução de bactérias fluorescentes quando as pragas foram injetadas.
Para nosso conhecimento, esta é a primeira descrição da aplicação da terapia phage em zebrafish, com o valor agregado para a demonstração de atividade antimicrobiana de phages contra P. aeruginosa em um fundo CF, que é particularmente suscetível a esta infecção bacteriana.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Italiana de Fibrose Cística (FFC#22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo e FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
