Summary
Представлено здесь протокол для Pseudomonas aeruginosa инфекции и фаг терапии применения в муковисцидоз (CF) эмбрионов зебры.
Abstract
Устойчивость к противомикробным препаратам, которое является одним из основных следствий диагностической неопределенности и чрезмерной предписания противомикробных препаратов, является все более признанной причиной тяжелых инфекций, осложнений и смертности во всем мире, что оказывает огромное воздействие на наше общество и систему здравоохранения. В частности, пациенты с ослабленной иммунной системой или уже существующими и хроническими патологиями, такими как муковисцидоз (CF), подвергаются частым антибиотикам для борьбы с инфекциями с появлением и распространением мультирезистентных изолятов. Поэтому существует настоятельная необходимость в решении альтернативных методов лечения для противодействия бактериальным инфекциям. Использование бактериофагов, естественных врагов бактерий, может быть возможным решением. Протокол, подробно описанный в этой работе, описывает применение фаговой терапии против инфекции Pseudomonas aeruginosa в эмбрионах зебры. Эмбрионы зебры были инфицированы P. aeruginosa, чтобы продемонстрировать, что фаг-терапия эффективна против инфекций P. aeruginosa, поскольку она снижает летальность, бактериальное бремя и провоспалительный иммунный ответ в эмбрионах CF.
Introduction
Фаге терапии, использование естественных врагов бактерий для борьбы с бактериальными инфекциями, набирает новый интерес, как бактериальная устойчивость к антибиотикамстановится широко распространенным 1,2. Эта терапия, используемая в течение десятилетий в Восточной Европе, можно считать дополнительным лечением антибиотиков в лечении легочных инфекций у пациентов с CF и возможной терапевтической альтернативой для пациентов, инфицированных бактериями, которые устойчивы ко всем используемым в настоящее времяантибиотикам 2,3. Преимущества антибиотикотерапии в том, что бактериофагы размножаются на месте инфекции, в то время как антибиотики метаболизируются ивыбывают из организма 4,,5. Действительно, администрирование коктейлей вирулентных фагов, изолированных в различных лабораториях, оказалось эффективным в лечении инфекций Pseudomonas aeruginosa в животных моделях, таких как насекомыеи млекопитающие 6,7,8. Фаге терапии было также показано, чтобы быть в состоянии уменьшить бактериальную нагрузку в ожоговых ран, инфицированных P. aeruginosa и Escherichia coli в рандомизированных клиническихиспытаний 9.
Зебрафиш(Danio rerio) недавно стала ценной моделью для изучения инфекций с несколькими патогенами, в том числе P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus и Burkolderia cepacia12,13. Путем микроинъекций бактерий сразу вциркуляцию крови зародыша 14 легко установить системную инфекцию которая противодействована зебрафиш врожденной иммунной системой, которая эволюционирована сохранена с нейтрофилами и поколением макрофагов подобно к людским двойнику. Кроме того, в течение первого месяца жизни эмбрионы зебры не имеют адаптивного иммунного ответа, что делает их идеальными моделями для изучения врожденного иммунитета, который является критическим защитным механизмом в легочныхинфекциях человека 15. Зебрафиш недавно появилась как мощная генетическая модель системы, чтобы лучше понять начало CF и разработать новыефармакологические методы лечения 10,,16,17. CF зебрафиш модель cftr нокдаун генерируется с морфолино инъекции в зебрафиш представил смоченной реакции респираторного всплеска и снижениемиграции нейтрофилов 10, в то время как cftr нокаут приводит к нарушению внутреннего положения органа и разрушение экзокринной поджелудочной железы, фенотип, которыйотражает болезни человека 16,17. Наибольший интерес представляет вывод о том, что бактериальная нагрузка P. aeruginosa была значительно выше в cftr-потеря-функции эмбрионов, чем в контроле на 8 часов после заражения (hpi), который параллели результаты, полученные с мышами и человека бронхиальных эпителиальныхклеток 2,18. cftr
В этой работе мы демонстрируем, что фаг-терапия эффективна против инфекций P. aeruginosa у эмбрионов зебры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Взрослые зебры(Danio rerio) из штамма AB (Европейский ресурсный центр Зебрафиш E'RC) поддерживаются в соответствии с международными (Директива ЕС 2010/63/EU) и национальными руководящими принципами(итальянский указ от 4 марта 2014 года, n. 26) о защите животных, используемых в научных целях. Стандартные условия устанавливаются на рыбном объекте с 14 ч темного цикла света/10 ч и температурой воды в резервуаре при температуре 28 градусов по Цельсию.
1. Подготовка решений и инструментов
- Подготовье 50-х стокового раствора и 1x рабочих решений для среды эмбриона E3 для выращивания эмбрионов зебры (см. таблицу 1).
- Сделать пигментации блокирующий раствор, чтобы блокировать пигментацию эмбриона от 24 часов после оплодотворения (24 л.с.) (см. таблицу 1).
- Подготовка 25x акции и 1x рабочий трикан обезболивающее решение, как описано в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания раствора, который может повредить фондовый раствор, сделать aliquots 2 мл 25x tricaine и хранить их при -20 градусов по Цельсию. - Подготовка треков для микроинъекции эмбриона путем растворения 1 г агарозы в 100 мл дистиллированной H2O в микроволновой колбе или бутылке. Микроволновая печь в течение 1-3 мин, пока агароза полностью не растворит.
- Позиция зебры микроинъекции формы (см. Таблица материалов) перевернулся в чашке Петри (90 мм х 15 мм) и покрыть всю поверхность, наливая жидкий гель агарозы с шириной около 10 мм.
- Удалите плесень после того, как агароза затвердевла. Заполните чашку Петри 1x E3 среды эмбриона. Это может храниться при 4 градусов по Цельсию в течение примерно одной недели. Перед использованием замените свежей средой E3, содержащей Tricaine.
ПРИМЕЧАНИЕ: Старые формы могут развиваться грибки или бактериальных загрязнений. - Используйте огонь полированной 10 см борозиликат капилляры для подготовки иглы для микроинъекции и закрепить их в micropipette шкив, затягивая ручки. Установите шкив со следующими настройками: тепло 500, скорость 100, время 150, тянуть 150.
2. P. aeruginosa (PAO1) инокулум препарат
- Привить 1 колониюGFPиP. aeruginosa штамм PAO119 в 5 мл бульона LB (см. таблицу 1) и расти на ночь при 37 градусов по Цельсию со тряской (200 об/мин).
- Разбавить выше ночной культуры до OD600 и 0,1 в 10 мл бульона LB и расти до OD600 и 0,5 при 37 градусов по Цельсию со тряской (200 об / мин).
- Центрифуга 2 мл культуры в течение 2 мин при 4 градусов по Цельсию при 16100 х г и повторное разрешение клеточной гранулы на OD600 и 1, что эквивалентно примерно 1 х 109 cfu/mL, в 1 мл физиологического раствора (см. таблицу 1).
- Разбавить клеточной суспензией примерно до 5 х10 7кфу/мл в физиологическом растворе и хранить при 4 градусах Цельсия.
3. Подготовка запасов фаге
- Прививка 1 колонии P. aeruginosa штамм PAO1 в 5 мл бульона LB и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию со тряской. Разбавить ночную культуру доOD 600 и 0,01 в 500 мл бульона LB и расти при 37 градусов по Цельсию со встряхивания до OD600 и 0,05, что эквивалентно около 2,5 х 107 cfu/mL.
- К разбавленной культуре P. aeruginosa,добавить около 1,25 х10 7 фагов, чтобы получить множественность инфекции (M.O.I.) от 10-3. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию с встряхивания до OD600 падает примерно до 0,1-0,3 (примерно в 3 до 5 ч, в зависимости от используемого фагома).
ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре фага были отобраны для этого эксперимента, которые заражают штамм PAO1: Два Podoviridae, GenBank присоединения номера vB_PaeP_PYO2, MF490236, и vB_PaeP_DEV, MF490238, и два Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241, и vB_PaeM_E217, MF490240. Выполните следующие шаги для каждого фагов по отдельности. - Инкубировать лизат с 1 мг/мл DNase и RNase в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию. Центрифуга при 5000 х г в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию и тщательно восстановить супернатант (SN). Фильтр SN с фильтром, имеющих диаметр поры 0,8 мкм.
- В SN добавьте 58 г/л NaCl и 105 г/л PEG6000. Растворите с перемешиванием на RT 20 мин, а затем держать его на ночь при 4 градусов по Цельсию. Центрифуга при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 градусах цельсия для выпадения фагов. Удалите SN и тщательно растворите фаговую гранулу в 15 мл буфера TN (см. таблицу 1).
- Очистить фагов градиентом плотности CsCl, как описано в шагах ниже.
- В полиалломерных ультрацентрифугных трубках для ротора SW41 подготовьтесь градиент плотности шага CsCl, расслоив 2 мл из четырех решений CsCl, описанных в таблице 1. Добавьте 3,5 мл фаговой подвески в каждую из 4 трубок.
ПРИМЕЧАНИЕ: CsCl является токсичным, принять надлежащие процедуры безопасности для обработки и отказаться от него. - Ввести трубки в ротор и убедитесь, что трубы сбалансированы (разница в весе между двумя облицовочных трубок должна быть ≤ 0,01 г).
- Центрифуга для 2 ч при 4 кк и 100 000 х г (25 000 об/мин для ротора SW41). После центрифугации медленно снимите трубки и тщательно обездвижйте их на опоре. Используя шприц с иглой 19 G, нарисуйте белую/опалесцентную полосу, которая обычно находится между областью плотности d'1.5 и d'1.4.
- Перенесите подвески из шприца в новые полиалломеры для ротора SW60 и используйте раствор d'1.4, чтобы точно сбалансировать трубки.
- Центрифуга подвески при 4 градусах Цельсия и 150 0000 х г (38 000 об/мин для ротора SW60) не менее 16 ч.
- Соберите видимую полосу, как указано выше (см. шаг 3.3.3) и перенесите их в диализные трубки с 6000 Da cut-off. Dialyze получил видимый диапазон 2x в течение 20 минут против 500 мл воды и на ночь против 500 мл буфера TN. Фильтр с фильтром поры 0,22 мкм и хранить при 4 градусов по Цельсию.
- В полиалломерных ультрацентрифугных трубках для ротора SW41 подготовьтесь градиент плотности шага CsCl, расслоив 2 мл из четырех решений CsCl, описанных в таблице 1. Добавьте 3,5 мл фаговой подвески в каждую из 4 трубок.
4. Приготовление коктейлей Фаге
- Сделать смесь из четырех фагов, которые заражают штамм PAO1, ранее изолированных и характеризуется8. Перед смешиванием, оценить titer каждого фагового запаса по налету анализ20.
- Соберите фаг коктейль, с общим титр 5 × 108 pfu/mL, в равной степени смешивания четырех фагов препаратов в том же pfu/mL непосредственно перед каждым экспериментом, чтобы обеспечить точный фаг титры.
5. Сбор и подготовка эмбрионов зебры для микроинъекции cftr morpholinos
ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите 1-2 клеточных эмбрионов из диких зебры типа для микроинъекции cftr morpholinos(cftr-MOs).
- За два дня до бактериального эксперимента микроинъекции, создать размножения пар и собирать эмбрионы, как описаноранее 21. Взрослые зебры(Danio rerio)штамма AB были приобретены у Европейского ресурсного центра Зебрафиш, E'RC.
- На следующий день после этого, собирать эмбрионы сразу после оплодотворения с пластиковой пипеткой или с помощью тонкой сетки ситечко. Поместите собранные эмбрионы в чашку Петри, содержащую E3 эмбриона среды и тщательно удалить мусор с пластиковой пипетки, чтобы избежать загрязнения, которые могут повредить развитию эмбриона.
- Приготовьте 5 мкл раствора для инъекций морфолино, разбавляя два раствора морфолино (1 мМ) в стерильной воде до конечной концентрации 0,25 пмоль/эмбрион ATG-MO - 0,25 пмоль/зародыш-МО. Чтобы проследить инъекцию эмбриона, добавьте 0,5 МКЛ фенола красного цвета в смесь раствора для инъекций морфолино.
- Загрузите микроинъекцию иглы с приблизительно 5 йл раствора смеси морфолино с помощью микропипетта 20 йл с тонкой наконечником загрузки геля. Закрепите иглу к микроманипулятору, подключенному к стенду, и располите ее под стереомикроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно, что раствор достигает кончика иглы, как давление микроинъектор насос будет толкать его. - Отрежь кончик иглы, разрезав кончик иглы мелким стерильным пинцетом. Измерьте диаметр капли с помощью планки шкалы в глазу микроскопа. Кроме того, создать каплю минерального масла на микрометровый слайд и установить объем микроинъекции путем введения раствора в масляной капли для оценки размера капли. Используйте каплю диаметром 156 мкм, чтобы ввести объем 2 нл.
- Установите микроинъектор, регулируя давление компенсации до 15 hPa, время впрыска до 0,5 с, и давление впрыска между 300 и 600 hPa, чтобы получить правильный объем впрыска в зависимости от используемой иглы.
- С помощью пластиковой пипетки расположить эмбрионы от шага 5,2 на стекло, расположенное в 96 мм диаметром Петри блюдо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком много E3 среды предотвратит надлежащее проникновение микроинъекции иглы в хорион эмбрионов. - Проникнуть в хорион, а затем желток с иглой, чтобы ввести 2 nL в эмбрион, как описаноранее 22.
- Поместите вводимые эмбрионы в чашку Петри со средой E3 и поместите их в инкубатор при 28 градусов по Цельсию, чтобы они развивались до следующий день.
6. Микроинъекция эмбрионов зебры с бактериями и фагом коктейля
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения системной инфекции, эмбрион должен иметь кровообращение, которое обычно начинается после 26 л.с.
- После 26 л.с. (для стадий развития зебры относятся к Kimmel21) дехорионат эмбрионов с проназовым раствором, приготовленным путем растворения проназового порошка в среде E3 при концентрации 2 мг/мл. Аккуратно пипетки эмбрионов, чтобы сломать хорион. Откажитесь от проназе/E3 среды и промыть блюдо несколько раз со свежим E3, чтобы удалить все проназе.
- Анестезировать эмбрионы зебры в E3 среде, содержащей Tricaine примерно за 5 минут до инъекций.
- Пипетты обасыть эмбрионы в трек подготовлен в шаге 1. Используйте тонкий гель загрузки отзыв линии эмбрионов в боковом положении.
- Загрузите микроинъекцию иглы примерно с 5 йл препарата P. aeruginosa, как описано в части 5.
- Вставьте иглу dorsally к отправной точке протока Кювье, где он начинает распространяться по желтковому мешку. Ввимит объем 1-3 нл и убедитесь, что объем расширяется непосредственно внутри протока и попадает в циркуляцию.
- Приблизительно после каждых 50 инъекций эмбриона, введать каплю бактерий в 1,5 мл центрифуги трубки с 100 йл стерильных PBS, чтобы проверить, если объем инъекции остается прежним. Плита инокулум на LB агар (см. таблицу 1) при 37 градусов по Цельсию ночь для оценки CFU.
- Перенесите микроинъектированные эмбрионы в две чистые чашки Петри со свежимИ E3 средними и инкубировать их при 28 градусов по Цельсию.
- В двух выбранных точках времени: 30 мин или 3 ч после бактериальной инъекции, вынюхить одну из чашек Петри с бактериальными инъекционными эмбрионами из инкубатора и выровнять их в треке, как описано в 6.3 для инъекции фагового коктейля.
- Загрузите микроинъекцию иглы примерно с 5 мкл фагового коктейля (подготовленного в шаге 4) с тонкой наконечником загрузки геля и закрепите его на микроинжектор (см. шаг 5).
- Ввимить фаг-коктейль в проток Кювье эмбрионов, ранее введенных с бактериями.
- Перенесите микроинъектированные эмбрионы в две чистые чашки Петри со свежимИ E3 средними и инкубировать их при 28 градусов по Цельсию.
7. Оценка бактериального бремени эмбрионов, вводимых с помощью ПАО1 и фагов
- На 8 л.с., пипетка 15 анестезировал эмбрионов от чашки Петри до 1,5 мл центрифуги трубки.
- Замените обезболивающее решение на 300 МЛ 1% Triton X-100 в PBS (PBSTritonX) и гомогенизируйте эмбрионы, передав их по крайней мере 15x через инсулиновый шприц со стерильной иглой 27-G.
- Подготовка серийных разбавлений гомогенатов в стерильных PBS путем передачи 100 йл разбавленного гомогената в 900 МЛ стерильных PBS.
- Чтобы выбрать для естественно ампер-резистентного штамма PAO1, пластина 100 МКЛ разбавления на Агаре LB добавляется с ампициллином (100 мкг/мл), и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение ночи.
- На следующий день, подсчитайте количество колоний, умножить на фактор разбавления, чтобы определить общее число CFU, и разделить на количество эмбрионов гомогенизированных для получения среднего числа CFU / инфицированных эмбрионов.
8. Оценка летальности эмбрионов, вводимых с помощью ПАО1 и фагов
- Чтобы оценить летальность инфекции PAO1, оценка инъекционных эмбрионов на 20 л.с. под стереомикроскопом и рассчитывать на мертвых эмбрионов (белый / не прозрачный).
- Рассчитайте половину максимальной смертельной концентрации 50 (LD50) дозы PAO1, которая определяет смерть 50% инъекционных эмбрионов при 20 л.с.
9. Подготовка эмбрионов к стереомикроскопу замедленной визуализацииинфекции GFP и PAO1
- Препарировать форму для живого эмбриона изображения путем растворения 1,5% низкой плавления агарозы в 100 мл раствора E3.
- Добавьте 1% Tricaine (см. таблицу 1) для обезболивать эмбрионы.
- При 4 л.с. перенесите один эмбрион с пластиковой пипеткой в стеклянную нижнюю тарелку и добавьте теплый низкоплавильный раствор агарозы.
- Распоить стеклянное дно блюда под стереомикроскопом и с кончиком положения эмбриона в нужной ориентации. Используйте пластиковую пипету, чтобы аккуратно добавить каплю агарозы на эмбрион.
- Пусть агароза остыть в течение 5-10 минут и аккуратно заполнить стеклянное дно блюдо с E3, содержащий анестезии раствор, чтобы сохранить эмбрион влажным.
- Поместите стеклянную нижнюю тарелку с эмбрионом под флуоресцентный стереомикроскоп с флуоресцентным фильтром (канал 488 нм) длябактерий GFP. Не снимите чашку Петри до дальнейших приобретений с теми же параметрами на 9, 14 и 18 л.с.
10. Экспрессионистский анализ провоспалительных цитокинов
- При 20 л.с. анестезирует эмбрионы раствором трикаина 1x и перенесите их из чашки Петри в центрифугу 1,5 мл.
- Под дымовой капот снимите обезболивающее раствор и замените 200 МКЛ гидрохлоридного реагента гуанидия.
- Гомогенизировать эмбрионы, трубя их повторно через 200 мкл пипетки, а затем по крайней мере 15x с инсулиновым шприцем со стерильной иглой 27 G.
- Извлекайте полную РНК из гомогенизированных эмбрионов зебры с использованием коммерчески доступных гидрохлоридных реагентов гуанидия в соответствии с инструкциями производителя.
- Лечить 1 мкг каждого образца РНК с 2 йл 1U / йл DNase I (RNase-бесплатно), следуя инструкциям производителя.
- Используйте 1 мкг DNase я лечил РНК для обратной транскрипции реакции (RT) с использованием коммерчески доступного комплекта (см. Таблица материалов), в общем объеме 20 йл в соответствии с инструкциями производителя.
- Выполните реакцию RT qPCR в общем объеме 10 ЗЛ, содержащую 1x SYBR Green mastermix с использованием 1,5 МЛ 1:6 разбавления реакции RT. Для целей нормализации используйте праймеры для хранения генов rpl8 и провоспалительных цитокинов, используйте праймеры для TNF-α и IL-1 (см. таблицу 2). qPCR протокол был: цикл 1 шаг 1: 95 КК, 2 мин, повторить один раз; цикл 2: шаг 1 95 градусов по Цельсию, 10 с, шаг 2 55 градусов по Цельсию, 30 с, повторите 40x; цикл 3: шаг 1 72 КК, 15 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты и цифры, представленные здесь, ссылаются на эмбрионы CF, генерируемые путем инъекции cftr morpholinos,как описано ранее 10 и в шаге 5. Для проверки фенотипа CF были рассмотрены нарушения положения внутренних органов, таких как сердце, печень иподжелудочная железа, как описано ранее17 (рисунок 1). Аналогичные результаты были получены в случае эмбрионов WT, как сообщалось в нашей предыдущейпубликации 19.
Бактериальное бремя было уменьшено фаг-терапией в эмбрионах CF, инфицированных PAO1. Кроме того, мы оценили бактериальную нагрузку на уровне 8 л.с. путем гомогенизации групп из 15 эмбрионов: среднее количество бактерий (cfu/embryo), присутствующих в зараженных эмбрионах PAO1, сократилось примерно до 20% после лечения фагом, тем самым подтвердив менее тяжелую инфекцию в присутствии фаговогококтейля (рисунок 2).
Летальность была снижена с помощью фаготерапии в эмбрионах CF, инфицированныхбактериями GFP и PAO1. CF эмбрионы зебры на 48 л.с. были введены с GFPи бактерии штамма PAO1 в дозе, которая вызвала 50% летальности после 20 л.с. (30 cfu/embryo, Рисунок 3A). Местом инъекции был желток или проток Кювье для создания системной инфекции. Фаг-терапия против инфекции ПАО1 была протестирована путем введения 2 nL одинаково смешанного фагового коктейля (300-500 pfu/embryo). Инъекция была выполнена в двух разных точках времени: 30 мин (ранний) и 7 часов (поздно) после бактериальной инъекции. В обоих случаях летальность была снижена на 20 л.с., что указывает на эффективность фаг-терапии(рисунок 3B).
С живой визуализации, используя флуоресцентный стереомикроскоп, мы также следили за прогрессированием инфекции в эмбрионах CF вводили сGFP PAO1 и показал эффективность фаготерапии в снижении распространения флуоресцентных бактерий над желтковый мешок. В верхней части рисунка 4показан инъекционный эмбрион CF-PAO1 с размножением бактерий GFP- на уровне 4, 9, 14 и 18 л.с., в то время как эмбрион CF-PAO1 с пониженной флуоресценцией из-за действия фага против бактерий показан внижней части (рисунок 4).
Фаг-терапия уменьшила воспалительный ответ, порожденный инфекцией PAO1 в эмбрионах CF. Мы также оценили иммунный ответ, генерируемый PAO1 и PAO1 и инъекцией фагов на 8 л.с. Как и ожидалось, экспрессия провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-1, проанализированных методами qPCR, была значительно увеличена после инъекций PAO1 по сравнению с контролем, в то время как она была уменьшена с коинъемой фагового коктейля(рисунок 5A,B).
Рисунок 1: Поколение и проверка эмбрионов CF при инъекциях cftr morpholinos(cftr-MOs). (A)Нарушение положения и цикл сердца в CF вводили эмбрионы по сравнению с дикого типа (WT) эмбрионов. Сердце визуализируется с выражением cmlc2 с помощью метода гибридизации наместе. (B) Нарушение положения печени (стрелки) и поджелудочной железы в эмбрионах CF по сравнению с WT. Печень и поджелудочная железа визуализированы с выражением prox1a методами гибридизации на месте. Шкала баров указывает на 100 мкм. лив: печень; p: поджелудочная железа. Цифра перепечатывается с19 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Бактериальное бремя в эмбрионах CF, инфицированных PAO1 или PAO1-фагов.. Относительный процент cfu/embryo в PAO1'phages против эмбрионов PAO1 дается. Сообщается о среднем и SD трех независимых экспериментов. Цифра перепечатывается с19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Летальность эмбрионов CF зебры, инфицированных PAO1 и PAO1-фагов. (A) Определение LD50 в 48 л.с. зебры эмбрионов microinjected с cftr-MOна 1-клеточной стадии (CF эмбрионов) и инфицированных на 48 л.с. с 2 nL культуры PAO1, содержащий все большее количество бактерий (cfu/embryo). Летальность эмбрионов наблюдалась на уровне 20 л.с. (B) Летальность на 20 л.с. эмбрионов CF инфицированных PAO1 на 48 л.с. и лечение фагом коктейль (PAO1 "Φ). Среднее и SD сообщили от шести и четырех экспериментов, соответственно, каждый с 25-40 эмбрионов. Угловая трансформация была применена к проценту летальности и одной стороны ANOVA следуют тест Дункан был использован. Цифра перепечатывается с19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Изображение эффективности фаг терапии у зебры. Прогрессирование инфекции в эмбрионах CF после инъекции PAO1 (верхний эмбрион) и эффективность фаг-терапии в PAO1-фагов вводили эмбрионы (нижний эмбрион) на 4, 9, 14 и 18 л.с. Шкала бар указывает 100 микрон. Цифра перепечатывается с19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Выражение пр- и противовоспалительных цитокинов после PAO1 и PAO-фаге администрации. Уровни экспрессии генов TNF-a (A) и IL-1, измеряемые RT-qPCR на уровне 8 л.с. в эмбрионах CF, вводимых с PAO1 и PAO1-Φ при 48 л.с. и нормализованных с использованием экспрессии rpl8. Сообщается о среднем и SD четырех экспериментов. Статистическая значимость была оценена ANOVA, а затем тест Дункана: для TNF- a (CF) против (CF-PAO1) р 0,015 евро; (CF) vs (CF-PAO1)Φ) р 0,019 евро; (CF-PAO1) vs (CF-PAO1) Φ) р 0,77 н.с.; для ИЛ-1 (CF) против (CF-PAO1) р 0,00014;; (CF) vs (CF-PAO1) Φ) р - 0,00068 "; (CF-PAO1) vs (CF-PAO1) Φ) р 0,031. Цифра перепечатывается с19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Решения | Подготовка |
| Обезболивающее решение 25X | 4 мг/мл Tricaine в дистиллированной H2O. |
| Обезболивающее рабочее решение 1X | разбавить вдистиллированнойH 2 O Tricaine фондовый раствор 25X препарат для достижения концентрации 1X (0,16 мг/мл) Tricaine дистиллированной H2O. |
| CsCl д'1.3 | 20,49 г в 50 мл ТН |
| CsCl д'1.4 | 20,28 г в 50 мл ТН |
| CsCl d'1.5 | 34,13 г в 50 мл ТН |
| CsCl д'1.6 | 41,2 г в 50 мл ТН |
| E3 эмбриона среды для эмбриона зебры | 1 л 1of E3 (разбавить 50X бульон с дистиллированной H2O) 200 мкл 0,05% метил-голубой . Магазин на RT. |
| E3 эмбрион среднего запаса раствор (50X) | 73,0 г NaCl, 3,15 г KCl , 9,15 г CaCl2 , и 9,95 г MgSO4 в 5 л дистиллированной H2O. Магазин на RT. |
| LB агар | 10 г/л триптона, экстракт дрожжей 5 г/л, 5 г/л накл, 10 г/л агара |
| Бульон LB | для 1L: 950 мл H2O, 10 г триптона, 10 г NaCl, 5 г экстракта дрожжей |
| PBST | PBS 1X и Тритон X 1% |
| Физиологическое решение | 0,9% NaCl |
| Пигментация блокирует фондовый раствор 10X | 0,3 мг/мл фенил тиуреа (ПТУ) порошок в E3 эмбриона среды для эмбриона зебры |
| Проназное акционерное решение 5X | 5 мг/мл проназного порошка в среде эмбриона E3 для эмбриона зебры |
| Буфер TN | 10 мМм Трис HCl рН 8,0, 150 мм НаКл |
Таблица 1: Подготовка решений.
| Имя гена | Праймер последовательность |
| TNF-альфа Fw | 5'-TGCTTCACGCTCCATAAGACC-3' |
| TNFalpha Rev | 5'-CAAGCCACCTGAAGAAAAGG-3' |
| IL1-бета Fw | 5'-TGGACTTCGCAGCAAAATG-3' |
| IL1-бета Rev | 5'-CGTTCACTTCACGCTCTTGGATG-3' |
| rpl8 Fw | 5'-CTCCGTCTTCAAAGCCCAT-3' |
| rpl8 Rev | 5'-TCCTTCACGATCCCCTTGAT-3' |
Таблица 2: Праймеры, используемые для RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи мы описали протокол для выполнения P. aeruginosa (PAO1) инфекции в эмбрионах зебры и как применять фаг терапии с коктейлем фагов ранее определены как способные заразить PAO1, чтобы решить ее. Использование бактериофагов в качестве альтернативы лечению антибиотиками представляет все более большой интерес с последних нескольких лет. Это объясняется главным образом распространением бактериальных инфекций с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), которые представляют собой серьезную проблему для общественного здравоохранения. Конечно, масштабы этой работы ограничиваются применением фагоевой терапии к животной модели, а не к человеку. Тем не менее, мы создали муковисцидоз зебры модель с инъекцией морфолино ориентации гена cftr, демонстрируя эффективность фаг терапии также в патогенетической модели особенно восприимчивы к инфекции P.aeruginosa.
Следует отметить, что мы могли бы легко достичь фаг терапии, как и в предыдущей работе, мы изолированы и характеризуются различные фаги, способные заразить P. aeruginosa как в пробирке и in vivo8. Этот шаг имеет основополагающее значение для получения антимикробной активности фагов. Изоляция и характеристика фагов, способных заразить определенный бактериальный штамм, являются критическими шагами применения фагоевой терапии. Действительно, чтобы избежать неблагоприятного воздействия фагов на животное/ человека хозяина, необходимо использовать литические фагов вместо этих лизогенных. Самое главное, необходимо проверить геномы фагов на наличие вредных генов, как для устойчивости к антибиотикам, вирулентности и передачи генов.
Фаг-терапия уже успешно используется в других моделях животных. Мы осознаем, что зебрафиш не является моделью млекопитающих и некоторые эффекты фагов могут быть разными. Однако, поскольку зебры обладают врожденной иммунной системой, сравнимой с человеческой с сохранением популяции нейтрофилови макрофагов 23, мы полагаем,что данные по иммунному ответу могут быть воспроизведены в организме человека. Кроме того, зебрафиш хорошо оценивается для бактериальных исследований инфекции, его использование в качестве тестера для эффективности фаг терапии может быть перспективным для терапевтических подходов. Действительно, инфекция может быть системной, если бактерии вводятся в циркуляцию через проток Кювье, или локализованы, как сообщается17. Мы провели как системные, так и локализованные инфекции и продемонстрировали, что они также вызвали повышенную летальность и бактериальное бремя, которые были снижены после применения фаговой терапии. Кроме того, так как бактерии GFPи флуоресцентные бактерии PAO1 вводились, было легко следить за инфекцией в разное время точки развития эмбриона, подтверждающие снижение флуоресцентных бактерий при введении фагов.
К нашим знаниям, это первое описание применения фаговой терапии у зебры, с добавленной стоимостью для демонстрации фагов антимикробной активности против P. aeruginosa на фоне CF, что особенно восприимчиво к этой бактериальной инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Итальянским фондом муковисцидоза (FFC No22/2017; Ассоциазионе "Gli amici della Ritty" Casnigo и FFC No23/2019; Un respiro в Пио Онлус Ла Мано теса Онлус).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
