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Medicine

힘줄 유래 줄기 세포의 세포 분화를 유도하기 위해 3차원 동축 기계 자극 생물 반응기 시스템을 적용

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61278
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia
* These authors contributed equally

Summary

3차원 단방향 기계적 자극 생물반응기 시스템은 힘줄 유래 줄기 세포 및 신힘주 형성의 테노겐 특이적 분화를 위한 이상적인 생물반응기입니다.

Abstract

텐디노병증은 정형 외과 지역에서 염증과 변성과 관련된 일반적인 만성 힘줄 질환입니다. 높은 이환율, 제한된 자기 수리 능력, 그리고 가장 중요한 것은, 확실한 처리가 없는, 힘병증은 아직도 환자의 삶의 질을 부정적으로 영향을 미칩니다. 힘줄 세포의 1 차전구세포로서 힘줄 유래 줄기 세포(TDSC)는 힘줄병증의 발달과 힘줄병증 후기능및 구조적 복원 모두에서 필수적인 역할을 한다. 따라서, 시험관 내에서 TDSC의 생체 내 분화를 힘줄 세포로 모방할 수 있는 방법이 유용할 것이다. 여기서, 본 프로토콜은 TDSC를 자극하는 3차원(3D) 단종 스트레칭 시스템을 기반으로 하는 방법을 설명하여 힘줄과 같은 조직으로 분화한다. 현재 프로토콜의 7단계가 있다: 마우스 TDSC의 분리, 마우스 TDSC의 배양 및 확장, 세포 시트 형성을 위한 자극 배양 배지의 준비, 자극 매체에서 배양하여 세포 시트 형성, 3D 힘줄 줄기 세포 구성의 준비, 단축 스트레칭 기계 자극 복합체의 조립, 및 생체 외 조직과 같은 기계적 자극의 평가. 그 효과는 히스토로지에 의해 입증되었다. 전체 절차는 3주 미만이 소요됩니다. 세포외 매트릭스 증착을 촉진하기 위해, 4.4 mg/mL 아스코르브산은 자극 배양 배지에 사용되었다. 선형 모터가 있는 분리된 챔버는 정확한 기계적 적재를 제공하며 이식성이 뛰어나고 쉽게 조절되어 생물 반응기에 적용됩니다. 본 프로토콜의 로딩 정권은 6% 변형, 0.25Hz, 8h, 6일 동안 16h 휴게되었다. 이 프로토콜은 힘줄에서 세포 분화를 모방 할 수 있으며, 이는 건병증의 병리학 적 과정을 조사하는 데 도움이됩니다. 더욱이, 힘줄 같이 조직은 잠재적으로 조작된 자가 이식으로 힘줄 상해에 있는 힘줄 치유를 승진시키기 위하여 이용됩니다. 요약하자면, 현재 프로토콜은 간단하고 경제적이며 재현 가능하며 유효합니다.

Introduction

텐디노병증은 일반적인 스포츠 부상 중 하나입니다. 그것은 주로 통증에 의해 명시, 로컬 붓기, 영향 받는 지역에 근육 긴장 감소, 그리고 기능 장애. 건공병증의 부각은 높다. 아킬레스건병증의 존재는 중장거리 주자(최대 29%)에게 가장 흔한 반면, 슬개골 건비병증의 존재는 배구(45%), 농구(32%), 육상(23%), 핸드볼(15%), 축구(13%)1,,2,,3,,4,,5등에서도높다. 그러나, 힘줄의 제한된 자기 치유 능력, 효과적인 치료의 부족으로 인해, 힘병증은 여전히 환자의 삶에 부정적인 영향을6,,7. 더욱이, 건근병증의 병인은 불분명합니다. 주로 '염증론', '변성론', '남용이론', '남용이론' 등 발병기발병에 대한 많은 조사가있었다. 현재, 많은 연구자들은 힘줄 경험9,,10과함께 과도한 기계적 적재로 인한 미세 부상에 대한 자가 수리에 실패한 것으로 판단했다.

힘줄 세포의 1차 전구체 세포로서 힘줄 유래 줄기 세포(TDSC)는,건반병증11,,12,13이후의 건근병증 및 기능적 및 구조적 복원의 발달 모두에서 필수적인 역할을 한다. 기계적 스트레스 자극은 골세포, 골세포, 매끄러운 근육 세포, 섬유아세포, 중간엽줄기세포 및 기타 힘에 민감한 세포14,,15,,16,,17,,18의증식 및 분화를 일으킬 수 있다고 보고되었다. 따라서, TDSC는, 메카노민감성 및 다능성 세포 중 하나로서, 기계적적재(19,,20)로분화하도록 유사하게 자극될 수 있다.

그러나, 다른 기계적 적재 파라미터(적재 강도, 하중 주파수, 적재 유형 및 적재 기간)는 TDSC를 유도하여 다른셀(21)으로분화하도록 유도할 수 있다. 따라서 효과적이고 유효한 기계적 로딩 정권은 tenogenesis에 매우 중요합니다. 또한 현재 TDSC에 기계적 로딩을 제공하는 데 사용되는 자극 시스템으로 다양한 종류의 생물 반응기가 있습니다. 생물 반응기의 각 종류의 원리는 다르므로 다른 생물 반응기에 대응하는 기계적 적재 매개 변수도 다릅니다. 따라서, 간단하고 경제적이며 재현 가능한 자극 프로토콜은 생물 반응기의 유형, 해당 자극 매체 및 기계적 적재 체제를 포함하는 수요가 있다.

본 기사는 TDSC를 자극하여 힘줄과 같은 조직으로 분화하는 3차원(3D) 항축 스트레칭 시스템을 기반으로 하는 방법을 설명합니다. 프로토콜의 7단계가 있다: 마우스 TDSC의 격리, 마우스 TDSC의 배양 및 확장, 세포 시트 형성을 위한 자극 배양 배지의 준비, 자극 매체에서 배양하여 세포 시트 형성, 3D 힘줄 줄기 세포 생성의 준비, 단축 스트레칭 기계 자극 복합체의 조립, 및 시험관 조직과 같은 기계적 자극의 평가. 전체 절차는 3D 세포 구조를 얻는 데 3 주 미만이 걸리며, 이는 일부 기존방법(22,,23)보다훨씬 적습니다. 본 프로토콜은 TDSC를 힘줄 조직으로 분화하도록 유도할 수 있는 것으로 입증되었으며, 현재 일반적으로 사용되는 2차원(2D) 스트레치시스템(21)보다더 신뢰할 수 있다. 그 효과는 히스토로지에 의해 입증되었다. 요컨대, 현재 프로토콜은 간단하고 경제적이며 재현 가능하며 유효합니다.

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Protocol

설명된 방법은 웨스턴 오스트레일리아 동물 윤리 위원회의 지침 및 규정에 따라 승인되고 수행되었습니다.

1. 마우스 TDSC의 격리

  1. 자궁 경부 탈구에 의해 6-8 주 된 C57BL/6 마우스를 안락사.
  2. 수확 슬개골 힘줄(24 및 아킬레스 건25)
  3. 3 시간 동안 6 mL 타입 I 콜라게나아제 (3 mg/mL)를 가진 하나에서 힘줄을 소화합니다.
    참고: 마우스의 힘줄 크기가 작기 때문에 한 마우스에서 수확한 모든 힘줄은 이 단계에서 사용해야 합니다.
  4. 태아 소 혈청 (FBS)의 10 %와 7 일 동안 연쇄상 구균 및 페니실린 혼합물의 1 %를 포함하는 완전한 최소한의 필수 매체 (알파-MEM)에서 세포와 배양을 수집합니다.
  5. 유동 세포측정(CD44, CD90 및 Sca-1을 포함한 세포 표면 마커의 발현; CD34 및 CD45의 발현 부족)에 의한 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 TDSC를 식별합니다.
  6. 통로 및 동결 셀(통로 4 세포는 추가 단계에 사용됩니다).

2. 마우스 TDSC의 문화 및 확장

참고: 멸균 생물 안전 후드의 모든 단계를 수행합니다.

  1. 워밍업 세포(마우스 TDSC, 100만 개의 세포, 통로 4, 37°C)를 섭취하십시오.
  2. 4-5mL의 완전한 최소 필수 매체(알파-MEM)를 천천히 추가합니다.
  3. 파이펫으로 혼합물을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기다.
  4. 파이펫으로 중간~ 8mL 합계로 위로 올려보있습니다.
    1. 37°C 오븐 인큐베이터에서 미리 웜 배지.
  5. 튜브를 원심분리기와 균형에 넣습니다.
  6. 원심분리기 및 펠릿 세포는 347 x g에서 5분 동안.
  7. 원심분리기 후에 꺼내 서 하단에 펠릿을 확인 합니다.
  8. 동결 배지를 데킹하고, 완전한 배지의 1-2 mL에서 부드럽게 세포를 다시 중단한다(너무 많은 거품을 만들지 마십시오).
  9. 리펜시드 셀을 파이펫으로 T-75 플라스크로 옮기습니다.
  10. 파이펫을 사용하여 플라스크에 완전한 알파-MEM 배지를 추가하여 13,000개의 세포/cm2의최종 농도로 총 10mL의 부피에 도달한다.
  11. 플라스크를 인큐베이터와 배양에 넣고 37°C에서 5% CO2로놓습니다.
  12. 3일마다 매체를 변경합니다.
  13. 세포가 100% 합류(약 40,000세포/cm2)로배양될 때까지 배지를 변경할 때 현미경으로 세포를 관찰하고 모니터링한다.

3. 세포 시트 형성을위한 자극 배양 배지의 준비

참고: 멸균 생물 안전 후드의 모든 단계를 수행합니다.

  1. 15mL 멸균 튜브에 완전한 알파-MEM 배지 15mL를 붓습니다.
  2. 4.4 μg/mL의 최종 농도를 위해 15mL의 배지에 아스코르브산(11 mg/mL)의 6μL을 추가합니다.
    참고: 자극 배양 배지에 25 ng/mL 결합 조직 성장 인자를 추가하면 전체 성장 및 분화 과정을 가속화할 수 있습니다.
  3. 위아래로 반전하여 부드럽게 섞는다.

4. 자극 배지에서 배양하여 세포 시트 형성

참고: 멸균 생물 안전 후드의 모든 단계를 수행합니다.

  1. 일반 완전한 알파-MEM 배지를 신중하게 폐기하고 플라스크 바닥에 부착된 셀을 만지지 마십시오.
  2. 10mL의 자극 매체를 천천히 추가하고 완전히 응수된 세포에 방해를 주지 마십시오.
  3. 9일 동안 자극 배지에서 세포를 배양하여(매3일마다 배지를 변경)하여 37°C에서 셀 시트를 5%CO2로충분히 생성한다.
    참고: 세포외 매트릭스는 아스코르브산에 의해 자극된 후 플라스크 의 바닥에서 관찰될 때 두껍게 되고 현재가 흐리게 되며, 이는 세포 시트가 충분히 생성된다는 것을 의미합니다.

5. 3D 힘줄 줄기 세포 구조의 준비

참고: 멸균 생물 안전 후드의 모든 단계를 수행합니다.

  1. 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내십시오.
  2. 자극 매체를 완전히 폐기하십시오.
  3. 플라스크를 소용돌이시켜 인산염 완충식염(PBS)으로 단층 셀 시트를 세척합니다.
  4. PBS를 완전히 폐기하십시오.
  5. 파이펫을 사용하여 플라스크 모서리에 0.25% 트립신 1mL을 추가합니다.
  6. 플라스크의 모서리를 탭하여 단층 셀 시트의 모서리가 플라스크의 바닥에서 벗어날 때까지 단층 셀 시트를 부착 해제합니다.
  7. 트립시니화를 중지하려면 즉시 9mL의 완전한 알파-MEM 배지를 추가합니다.
  8. 플라스크를 계속 소용돌이쳐 단층 셀 시트를 완전히 벗겨냅니다.
  9. 부착되지 않은 총 셀 시트를 중간 크기의 페트리 접시에 붓습니다.
  10. 멸균 트위저를 사용하여 셀 시트의 한 쪽 모서리를 선택하고 시계 방향으로 15회 회전합니다.
  11. 셀 시트의 또 다른 끝을 선택하고 10회 반시계 방향으로 회전하여 힘줄과 같은 체외구성(도 1A)을단단히 생성한다.

6. 독특한 설계 생물 반응기의 단축 스트레칭 기계 자극 복합체의 조립

참고: 멸균 생물 안전 후드의 모든 단계를 수행합니다.

  1. 커넥터로 후크를 연결하고 두 후크 사이에 원하는 거리(2cm)로 조정합니다.
  2. 3D TDSC가 조립된 후크에서 3회 동안 각후크(그림 1B)에부드럽게 바람을 피습니다.
  3. 두 끝에 나사를 조이어 생물 반응기의 챔버에 세포 구조로 후크를 고정합니다.
    참고: 나사와 후크를 포함한 전체 챔버는 멸균(134°C에서 1.5시간 동안 자동 클락을 사용하고 자외선(UV)은 사용하기 24시간 전에 노출됩니다. 챔버의 금속 홀더의 경우, UV 빛은 사용하기 전에 48 시간 동안 노출됩니다.
  4. 완벽한 알파-MEM 배지로 챔버를 채웁니다.
  5. 액추에이터를 케이블로 배양챔버에 연결합니다.
  6. 멸균 가위로 후크 커넥터를 잘라냅니다.
  7. 기계적 자극을 시작하려면 전원 및 해당 채널 컨트롤러를 켭막히게 합니다.
  8. 뚜껑을 챔버에 놓습니다.
  9. 표시등을 확인하고 생물 반응기가 제대로 작동할 수 있는지 확인합니다.
  10. 생체 반응기를 인큐베이터에 넣고 3D 세포 구조를 기계적 스트레칭으로 6일 동안(6% 스트레칭, 0.25Hz, 8시간, 16h 휴식)한다.

7. 체외 힘줄과 같은 조직에서 자극된 기계적 평가

  1. 드라이버로 나사를 풀고 조심스럽게 조립을 벗습니다.
  2. 15 분 동안 고정을 위해 힘줄과 같은 조직을 4 % 파라 포름 알데히드에 넣습니다.
  3. 고정 된 힘줄 같은 조직을 생검 폼 패드가있는 생검 카세트에 넣습니다.
  4. 샘플을 탈수하고 마지막으로 H&E 조직학적 염색에 의해 평가되는 공정.
  5. 정량적 PCR(qPCR)에 의한 테노겐성 마커의 발현을 평가하기 위한 힘줄과 같은 조직에서 전체 프로토콜을 반복하고 RNA를 추출한다. 선택된 유전자에 대한 프라이머는 표 1에나열됩니다.
    참고: 히스토로지 프로토콜 및 qPCR 프로토콜은 표준이며 이전연구(21)에따른다.

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Representative Results

기계적 자극 전에 TDSC는 완전한 매체에서 100% 합류로 성장하여 무질서한 초구조적형태(도 2A)를표시하였다. 6일 간의 단종 스트레칭 기계적 하중 후, 세포외 매트릭스(ECM) 및 세포 정렬은 잘 지향되었다(도2B). 세포는 기계적 적재 후 ECM에 잘 채워지고 잘 포위되었습니다. 세포 형태는 길어지게 되어, 스트레칭없이 에 비해 정상 힘줄 세포와 더 유사하였다(도2C). 적재를 가진 세포 구조의 세포 밀도는 적재없이 하나보다 높았다. QPCR 결과는 현재 의 방법이 정적 배양에 의해 처리된 것과 비교하여 스클러액스, 모호크, 테노모둘린 및 COL1A1(도3)을포함하는 테노겐마커의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다.

Figure 1
도 1: 생물 반응기의 후크 위에 3차원(3D) 세포 구조의 조립. (A)후크 를 통해 3D 셀 구조의 일반 보기. (B)후크 위에 3D 셀 구인을 조립하는 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 기계적 자극 전후의 세포 형태. (A)힘줄 유래 줄기 세포는 완전한 배지에서 100% 합류로 성장하여 기계적 자극 전에 무질서한 초구조학적 형태를 보였다. (B)내학적 이미지는 기계적 자극 후 세포 구조의 H&E 염색을 보여 주었다. (C)내학적 이미지는 기계적 자극 없이 6일 동안 생물반응기에서 배양된 대조군 세포 구조의 H&E 염색을 보여주었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 표현 수준[1] 개별 유전자 발현 수준은 먼저 내부 통제에 대하여 정규화되었다, 36B4, 그 후 정적 배양에서 유전자 발현 수준에 대하여 정규화. 3개의 실험의 결과가 표시됩니다. qPCR 분석에 사용되는 프라이머 시퀀스는 표 1에제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 3차원 단종 기계 자극 생물 반응기 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유전자 프라이머 시퀀스
포워드 5'>3' 리버스 5'>3'
콜1A1 트고가가가그CG가그GT GTTCGGGCTGATACCAGT
스클러액스 CCCAAACAGATCTGCACCTT GGCTCTCCGACTCTCTCAG
모호크 GTCCGGCAGCCAGATTTAAG TCGCTGAGCTTTCCTTTA
테노모둘린 CCGCAGAAAGCCTATTGAA 가ACCACCCATTGCTCATTCT
36B4 CTTCCCACTTGCTGAAAAAAAGG CGAA가가CCGAATCCCATCATA

표 1: qPCR 분석에 사용되는 프라이머 시퀀스

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Discussion

힘줄은 메카노감과성 섬유성 결합 조직입니다. 이전 연구에 따르면, 과도한 기계적 적재는 힘줄 줄기 세포의 골성 분화로 이어질 수 있지만, 부전이 부족하면 힘줄분화(21)가무질서한 콜라겐 섬유 구조로 이어질 수 있다.

일반적인 견해는 이상적인 생물 반응기의 열쇠는 생체 내 세포가 겪는 체외 세포 미세 환경을 시뮬레이션하는 능력입니다. 따라서, 시험관내 생체내 정상 응력 환경을 모방하는 것은 TDSC의 단일 계면 분화를 힘줄 세포로 자극하는 열쇠이다. 본 프로토콜에서 TDSC 구조의 폭은 2cm이고 후크의 이동 범위는 0.12cm였으며 이는 균주가 0.12/2(%)였다는 것을 의미한다. 결론적으로, TDSC는 현재 프로토콜에서 6일(6%, 0.25Hz, 8h, 16h 휴식)에 대한 생물 반응기에서 기계적으로 자극되었다. 평가 후, 이 프로토콜에 사용되는 기계적 적재 파라미터는 TDSC를 유도하여 힘줄과 같은 조직을 생성하는 것으로 입증되었다. 생물 반응기 매개 변수는 특히 스트레칭 시스템의 해당 유형과 일치해야한다는 점에 유의해야합니다. 예를 들어, 단층 된 세포 스트레칭에 대한 적절한 매개 변수는26,,27스트레칭 현재의 3D 셀 시트와 다릅니다. 가능한 이유는 다른 힘 모드(21)입니다. 2D 단층 스트레칭 시스템에서, 세포는 하단의 초점 접착에 의해 배양 기판에 부착하고 세포 세포 접합을 통해 서로 연결합니다. 그러나, 3D 세포 시트에서, 또한 3D 틈새 시장결과로 형성된 더 많은 세포-ECM 연결이 있는데, 이는 세포가 스트레칭 이외에 압력을 받고 있음을 의미한다.

본 프로토콜의 효과는 형태학 및 발성 마커의 발현 수준에 의해 입증되었다. 형태학의 관점에서, 조직학을 제외하고, 콜라겐을 검출하기 위해 공초점 면역 형광 현미경 을 사용하여 콜라겐 조직을 특성화한 다음 ECM 정렬을 평가하는 일반적인 방법입니다. 이전 연구는 TDSC 구조에서 잘 정렬된 콜라겐 유형 I 번들 형성을 6일 동안 6% 원축 기계적 자극으로 확인했지만21을적재하지 않고는 하나도 확인되지 않았다. 테노제닉 마커는 Scleraxis (SCX), 모호크 (MKX), 테노모둘린 (TNMD) 및 COL1A1을 포함하여 힘줄 세포를 식별하는 데 사용되었다. 만 TNMD는 비 전사 요인이었고, 나머지는 전사 요인(28)이다. 그들은 모두 잘 인식되었다. SCX는 배아 단계29에서힘줄 발달을 조절할 수 있고, MKX는 산후 단계30에서힘줄 분화 및 성숙을 조절할 수 있었다. 더욱이, 힘줄과 같은 조직의 기계적 특성(최대 부하 및 강성)도 이전 연구에서 평가되었으며, 로딩을 한 TDSC 구조의 기계적 특성이21을적재하지 않고 보다 더 나은 것으로 나타났다.

매체는 세포 성장 및 분화에 영향을 미칠 수 있습니다. 본 프로토콜에서, 적절한 방법으로 세포 시트를 형성하기 위해, TDSC는 완전한 매체에서 표준 비코팅 플라스틱 플라스크에 100% 합류로 성장한 다음 TDSC는 6d에 4.4 mg/mL 아스코르빅산을 추가하여 ECM 증착을 촉진하도록 자극되었다. 인슐린과 같은 성장인자 I, 혈관 내피 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 기본 섬유아세포 성장 인자, 성장 인자 변형, 성장 인자 5 등 여러 성장 인자는 힘줄 형성 및 치유31,,32,,33,,34에중요한 역할을 했다. 추가적으로 25ng/mL 결합 조직 성장 인자를 추가하면 자극 배양 배지에 Ni 등등이 보고된 바와 같이 전체 성장 및 분화과정(35)을가속화할 수 있다.

현재, 단층 셀이라고도 하는 2D 셀 시트는 기계적 조사에 사용되는 가장 일반적인 시스템이다. 축방향 스트레치는 단방향 스트레치가세로장력(36)만을제공하기 때문에 종방향 및 측면 모두다방향 장력을 제공한다. 따라서, 양축 스트레칭을 가진 단층세포 배양은 심근세포 및 표피 세포와 같은 몇몇 세포의 성장 환경을 모방할 수 있었다. 그러나, 3D 세포 구조는 힘줄의 실제 형상과 유사하며, 단종 스트레칭은 2D 세포 시트 및 양축 스트레치와 비교하여 힘줄 세포의 응력 특성과 더 유사하다. 따라서, 3D 세포 구조와 단방향 스트레칭의 조합은 힘줄과 기계적 마이크로 환경을 더 잘 이해하기 에 더 유능하다. 이는 TDSC의 분화를 자극하기 위해 3D 단방향 스트레칭 시스템을 사용하기 위한 이론적 근거를 제공합니다. 따라서, 2D 셀 시트는 마침내 3D 세포 구조로 압연되었고, 본 프로토콜에서 단원확장을 겪었다.

본 프로토콜에 사용되는 생물반응기는 액추에이터 및 배양챔버(도 4)로구성되었다. 본 바이오반응기의 세부 사항은 이전연구(37)에서확인할 수 있다. 현재, 힘줄에 사용되는 가장 일반적인 액추에이터는 공압 액추에이터, 선형 모터 및 스텝 모터볼 나사38,,39,,40을포함했다. 챔버에는 통합 및 분리 된 챔버(41,42)가포함되어 있습니다., 그 중에서도 리니어 모터가 있는 분리된 챔버는 정확한 기계적 적재를 제공했으며43을쉽게 조정할 수 있었다.

TDSC를 제외하고, 다른 유형의 줄기 세포는 현재 의 방법으로 사용될 잠재적인 세포 소스일 수 있다. 이전 연구는 줄기 세포의 다른 유형잠재적인 치료 능력을 가질 수 있으며 힘줄 재생을 향상 시킬 수 있습니다 나타났습니다. 종래의 비세포 기반 관리로 치료된 부상당한 말 힘줄에 비해 BMSC에 의해 처리된 힘줄의 재부상율은44,,45로낮았다. 더욱이, 건병증 모델로 BMSC를 주입하면 힘줄재생(46)을효과적으로 유도할 수 있다. 지방 유래 줄기 세포는 말 의 건반증을 효과적으로 치료하여 완전한 회복을 초래하고 말(47)에서정상 활동으로 돌아갈 수 있습니다. 함께, 줄기 세포제안 충분 한 증거가 있었다, TDSC를 제외 하 고, 힘줄 변성을 치료할 수 있습니다. 그러나, 주의 사항으로서, 부상당한 힘줄로 BMSC를 이식하는 것은 토끼 모델에서 자궁 외 골다발분화를 유도하는 것으로 나타났으며, 특정 조직에서 줄기 세포가 기원48의조직의 원치 않는 세포로 분화하는 경향이 있음을 시사한다. 이전 연구에서, TDSC에 로딩 박탈 치료는 뿐만 아니라 골 발생귀착될 수있습니다 21,이는 현재 방법은 다른 줄기 세포의 종전을 유도하 고 특정 로딩 정권과 골발생을 방지 하는 잠재력을 가지고 제안 주도. 줄기 세포의 다른 유형에 대 한 이러한 특정 로딩 정권을 탐구 하는 추가 연구가 필요 하다. 이 시나리오가 유지되는 경우, 건반증을 치료하는 더 많은 세포 소스를 사용할 수 있습니다.

인정해야 할 몇 가지 제한사항이 여전히 있습니다. 첫째, 비부식성 및 자동분해성 물질, 스테인리스 스틸이 생물반응기 시스템을 구축하는 데 사용되었지만, 배양 조건 및 배양 배지는 여전히 나사와 후크를 포함한 챔버를 부식시다. 따라서, 챔버의 일상적인 검사와 적시 녹 제거가 필요합니다. 둘째, 현재의 생물반응기를 경제적이고 휴대적으로 만들기 위해, 환경 통제 및 중간 순환 시스템이 없다. 따라서, 작업자는 생물 반응기를 수송하고 오염의 위험을 증가 3 일마다 중간 교환 챔버를 열어해야합니다. 운영자는 항상 TDSC 환경을 멸균하기 위해주의를 기울여야합니다.

건반증의 치료를 위해 비 수술 적 관점에서 병리학 적 과정을 명확히하는 것이 중요합니다. 외과 적 치료의 관점에서, 효과적인 방법은 엔지니어링 자가 이식편을 사용하는 것입니다. 생체 내 분화를 모방하기 위해 TDSC를 자극하는 과정은 건병증의 병리학 적 과정의 조사에 도움이됩니다. 엔지니어링 된 비계가없는 힘줄 조직은 쥐 슬개골 힘줄 창 부상 모델에서 힘줄 치유를 촉진 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 게다가, 이전 작업은 기계적 적재가 배양 힘줄의 기계적 특성을 향상시킬 수 있음을 증명했다. 따라서, 이 프로토콜은 TDSC를 힘줄과 같은 조직으로 직접 분화하기 위한 재현 가능한 방법을 제공하여 잠재적인 엔지니어링 힘줄 문화에 간단하고 타당성있게 사용될 수 있도록 한다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 "웨스턴 오스트레일리아 대학 국제 료 장학금과 웨스턴 오스트레일리아 대학에서 대학 대학원 상"을 받는 동안 연구가 수행되었다. 이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81802214)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331

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힘줄 유래 줄기 세포의 세포 분화를 유도하기 위해 3차원 동축 기계 자극 생물 반응기 시스템을 적용
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Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).

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