Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

टेंडन-व्युत्पन्न स्टेम सेल के टेनोजेनिक भेदभाव को प्रेरित करने के लिए त्रि-आयामी यूनिएक्सियल मैकेनिकल स्टिमुलेशन बायोरिएक्टर सिस्टम लागू करना

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61278
* These authors contributed equally

Summary

टेंडन-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं और नव-टेंडन गठन के टेनोजेनिक-विशिष्ट भेदभाव के लिए एक त्रि-आयामी एकीय यांत्रिक उत्तेजना बायोरिएक्टर प्रणाली एक आदर्श बायोरिएक्टर है।

Abstract

टेंडिनोपैथी एक हड्डी रोग क्षेत्र में सूजन और पतन से संबंधित एक आम पुरानी टेंडन बीमारी है। उच्च रुग्णता, सीमित आत्म-मरम्मत क्षमता और, सबसे महत्वपूर्ण बात, कोई निश्चित उपचार नहीं, टेंडिनोपैथी अभी भी रोगियों के जीवन की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। टेंडन-व्युत्पन्न स्टेम सेल (टीडीएससी), टेंडन कोशिकाओं की प्राथमिक अग्रदूत कोशिकाओं के रूप में, टेंडिनोपैथी के विकास और टेंडिनोपैथी के बाद कार्यात्मक और संरचनात्मक बहाली दोनों में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। इस प्रकार, एक विधि जो इन विट्रो में टीडीएससी के वीवो भेदभाव को टेंडन कोशिकाओं में नकल कर सकती है, उपयोगी होगी। यहां, वर्तमान प्रोटोकॉल एक त्रि-आयामी (3 डी) एकीय खींच प्रणाली के आधार पर एक विधि का वर्णन करता है ताकि टीडीएससी को टेंडन जैसे ऊतकों में अंतर करने के लिए प्रोत्साहित किया जा सके । वर्तमान प्रोटोकॉल के सात चरण हैं: चूहों टीडीएससी का अलगाव, चूहों टीडीएससी का समन्वय, कोशिका पत्रक गठन के लिए उत्तेजना संस्कृति माध्यम की तैयारी, उत्तेजना माध्यम में संस्कृति द्वारा सेल शीट गठन, 3 डी टेंडन स्टेम सेल निर्माण की तैयारी, यूनिएक्सियल-स्ट्रेचिंग मैकेनिकल उत्तेजना परिसर की असेंबली, और विट्रो टेंडन जैसे ऊतक में उत्तेजित यांत्रिक का मूल्यांकन। प्रभावशीलता हिस्ट्रोलॉजी द्वारा प्रदर्शित किया गया था। पूरी प्रक्रिया में 3 सप्ताह से भी कम समय लगता है। एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स जमाव को बढ़ावा देने के लिए उत्तेजना संस्कृति माध्यम में 4.4 मिलीग्राम/एमएल एस्कॉर्बिक एसिड का उपयोग किया गया था। एक रैखिक मोटर के साथ एक अलग कक्ष सटीक यांत्रिक लोडिंग प्रदान करता है और पोर्टेबल और आसानी से समायोजित किया जाता है, जो बायोरिएक्टर के लिए लागू होता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में लोडिंग व्यवस्था 6% तनाव, 0.25 हर्ट्ज, 8 घंटे थी, इसके बाद 6 दिनों के लिए 16 घंटे आराम किया गया। यह प्रोटोकॉल टेंडन में सेल भेदभाव की नकल कर सकता है, जो टेंडिनोपैथी की पैथोलॉजिकल प्रक्रिया की जांच के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, टेंडन जैसे ऊतक का उपयोग संभावित रूप से एक इंजीनियर ऑटोलोगस भ्रष्टाचार के रूप में टेंडन चोट में टेंडन उपचार को बढ़ावा देने के लिए किया जाता है। संक्षेप में, वर्तमान प्रोटोकॉल सरल, आर्थिक, प्रजनन योग्य और वैध है।

Introduction

टेंडिनोपैथी आम खेल चोटों में से एक है। यह मुख्य रूप से दर्द, स्थानीय सूजन, प्रभावित क्षेत्र में मांसपेशियों के तनाव में कमी, और शिथिलता से प्रकट होता है। टेंडिनोपैथी की घटनाएं अधिक होती हैं। दुखती टेंडिनोपैथी की उपस्थिति मध्यम और लंबी दूरी के धावकों (29%) के लिए सबसे आम है, जबकि वॉलीबॉल (45%), बास्केटबॉल (32%), ट्रैक और फील्ड (23%), हैंडबॉल (15%), और फुटबॉल (13%),1,,2,3,4, 5,5के एथलीटों में पटेलर टेंडिनोपैथी की उपस्थिति भी अधिक है।, हालांकि, टेंडन की सीमित आत्म-चिकित्सा क्षमता और प्रभावी उपचारों की कमी के कारण, टेंडिनोपैथी अभी भी रोगियों के जीवन को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है6,,7। इसके अलावा, टेंडिनोपैथी का रोगजनन अस्पष्ट बना हुआ है। इसके रोगजनन के बारे में कई जांच की गई है, जिसमें मुख्य रूप से "सूजन सिद्धांत", "अध: पतन सिद्धांत", "अति प्रयोग सिद्धांत", और आगे8शामिल हैं। वर्तमान में, कई शोधकर्ताओं का मानना था कि टेंडिनोपैथी अत्यधिक यांत्रिक लोडिंग के कारण सूक्ष्म चोटों की विफल आत्म-मरम्मत के कारण थी टेंडन अनुभव9,,10।

टेंडन-व्युत्पन्न स्टेम सेल (टीडीएससी), टेंडन कोशिकाओं की प्राथमिक अग्रदूत कोशिकाओं के रूप में, टेंडिनोपैथी11, 12, 13,12के बाद टेंडिनोपैथी और कार्यात्मक और संरचनात्मक बहाली दोनों के विकास में एक आवश्यक भूमिकानिभाते13हैं। यह बताया गया था कि यांत्रिक तनाव उत्तेजना ऑस्टियोसाइट्स, ऑस्टियोब्लास्ट, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट, मेसेंचिमल स्टेम कोशिकाओं और अन्य बल-संवेदनशील कोशिकाओं14,15, 16,,,17,,,18के प्रसार और भेदभाव का कारण बन सकती है।17 इसलिए, टीडीएससी, मशीनोसेंसिव और बहुआयामी कोशिकाओं में से एक के रूप में, इसी तरह यांत्रिक लोडिंग19,,20द्वारा अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है।

हालांकि, विभिन्न यांत्रिक लोडिंग पैरामीटर (लोडिंग स्ट्रेंथ, लोडिंग फ्रीक्वेंसी, लोडिंग प्रकार और लोडिंग अवधि) टीडीएससी को विभिन्न कोशिकाओं21में अंतर करने के लिए प्रेरित कर सकते हैं। इस प्रकार, एक प्रभावी और वैध यांत्रिक लोडिंग व्यवस्था टेनोजेनेसिस के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, विभिन्न प्रकार के बायोरिएक्टर हैं क्योंकि वर्तमान में टीडीएससी को यांत्रिक लोडिंग प्रदान करने के लिए उपयोग की जाने वाले उत्तेजना प्रणालियां हैं। प्रत्येक प्रकार के बायोरिएक्टर के सिद्धांत अलग-अलग हैं, इसलिए विभिन्न बायोरिएक्टरों के अनुरूप यांत्रिक लोडिंग पैरामीटर भी अलग हैं। इसलिए, एक सरल, आर्थिक और प्रजनन योग्य उत्तेजना प्रोटोकॉल मांग में है, जिसमें बायोरिएक्टर का प्रकार, संबंधित उत्तेजना माध्यम और यांत्रिक लोडिंग व्यवस्था शामिल है।

वर्तमान लेख में टेंडन जैसे ऊतक में अंतर करने के लिए टीडीएससी को प्रोत्साहित करने के लिए त्रि-आयामी (3 डी) एकीय खींच प्रणाली के आधार पर एक विधि का वर्णन किया गया है। प्रोटोकॉल के सात चरण हैं: चूहों का अलगाव टीडीएससी, संस्कृति और चूहों टीडीएससी का विस्तार, सेल शीट गठन के लिए उत्तेजना संस्कृति माध्यम की तैयारी, उत्तेजना माध्यम में खेती करके सेल शीट गठन, 3 डी टेंडन स्टेम सेल निर्माण की तैयारी, यूनिएक्सियल-स्ट्रेचिंग मैकेनिकल उत्तेजना परिसर की असेंबली, और विट्रो टेंडन जैसे ऊतक में यांत्रिक उत्तेजित का मूल्यांकन। पूरी प्रक्रिया को 3 डी सेल निर्माण प्राप्त करने में 3 सप्ताह से भी कम समय लगता है, जो कुछ मौजूदा तरीकों22, 23,23से बहुत कम है। वर्तमान प्रोटोकॉल को टेंडन ऊतक में अंतर करने के लिए टीडीएससी को प्रेरित करने में सक्षम साबित किया गया है, और यह वर्तमान आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दो-आयामी (2D) स्ट्रेचिंग सिस्टम21की तुलना में अधिक विश्वसनीय है। प्रभावशीलता हिस्ट्रोलॉजी द्वारा प्रदर्शित किया गया था। संक्षेप में, वर्तमान प्रोटोकॉल सरल, आर्थिक, प्रजनन योग्य और वैध है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

वर्णित तरीकों को मंजूरी दे दी और पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया पशु नैतिकता समिति के विश्वविद्यालय के दिशा निर्देशों और विनियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. चूहों टीडीएससी का अलगाव

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा 6-8 सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों को इच्छामृत्यु ।
  2. हार्वेस्ट पटेलर टेंडन24 और दुखती कण्डरा25.
  3. 3 घंटे के लिए टाइप I कोलेजनेज (3 मिलीग्राम/एमएल) के 6 एमएल के साथ एक से टेंडन को डाइजेस्ट करें।
    नोट: चूंकि माउस में टेंडन का आकार छोटा है, इसलिए इस चरण में एक माउस से काटे गए सभी टेंडन का उपयोग किया जाना चाहिए।
  4. कोशिकाओं और संस्कृति को पूर्ण न्यूनतम आवश्यक माध्यम (अल्फा-एमईएम) में एकत्र करें जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% स्ट्रेप्टोमाइसिन और पेनिसिलिन मिश्रण 7 दिनों के लिए होता है।
  5. प्रवाह साइटोमेट्री (सीडी 44, सीडी 90 और एससीए-1 सहित सेल सतह मार्कर की अभिव्यक्ति; सीडी 34 और सीडी 45 की अभिव्यक्ति की कमी) द्वारा फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई का उपयोग करके टीडीएससी की पहचान करें।
  6. मार्ग और फ्रीज कोशिकाओं (मार्ग 4 कोशिकाओं को आगे के कदम के लिए इस्तेमाल किया जाएगा) ।

2. संस्कृति और चूहों टीडीएससी का विस्तार

नोट: एक बाँझ जैवसेफ्टी हुड में सभी चरणों का संचालन करें।

  1. गरम कोशिकाओं (चूहों टीडीएससी, 1 मिलियन कोशिकाओं, मार्ग 4, 37 डिग्री सेल्सियस) को लें।
  2. धीरे-धीरे पूर्ण न्यूनतम आवश्यक माध्यम (अल्फा-एमईएम) का अतिरिक्त 4-5 एमएल जोड़ें।
  3. मिश्रण को एक पिपेट के साथ 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. एक पिपेट के साथ मध्यम से 8 एमएल कुल के साथ टॉप अप करें।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस ओवन इनक्यूबेटर में प्रीवार्म मीडियम।
  5. ट्यूब को सेंट्रलाइज और बैलेंस में रखें।
  6. 5 मिनट के लिए 347 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और पैलेट सेल।
  7. अपकेंद्रित्र के बाद बाहर निकालें और नीचे गोली की जांच करें।
  8. ठंड माध्यम को कम करें, और कोशिकाओं को धीरे-धीरे पूर्ण माध्यम के 1-2 एमएल में पुनर्निर्भर करें (बहुत सारे बुलबुले बनाने से बचें)।
  9. एक पिपेट द्वारा टी-75 फ्लास्क में पुनर्नगित कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  10. 13,000 कोशिकाओं/सेमी2की अंतिम एकाग्रता के साथ 10 एमएल की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए फ्लास्क में पूर्ण अल्फा-एमईएम माध्यम जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें ।
  11. फ्लास्क को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर और संस्कृति में रखें।
  12. हर 3 दिन में माध्यम बदलें।
  13. जब तक कोशिकाओं को 100% संगम (लगभग 40,000 कोशिकाओं/सेमी2)में सुसंस्कृत नहीं किया जाता है तब तक माध्यम को बदलते समय माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण और निगरानी करें।

3. सेल शीट गठन के लिए उत्तेजना संस्कृति माध्यम की तैयारी

नोट: एक बाँझ जैवसेफ्टी हुड में सभी चरणों का संचालन करें।

  1. एक 15 एमएल बाँझ ट्यूब में पूरा अल्फा-एमईएम माध्यम के 15 एमएल डालो।
  2. 4.4 माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए 6 माइक्रोन एस्कॉर्बिक एसिड (11 मिलीग्राम/एमएल) को माध्यम के 15 एमएल में जोड़ें।
    नोट: इसके अतिरिक्त उत्तेजना संस्कृति माध्यम में 25 एनजी/एमएल संयोजी ऊतक विकास कारक जोड़ने से पूरे विकास और भेदभाव प्रक्रिया में तेजी आ सकती है ।
  3. ऊपर और नीचे उलटा करके धीरे-धीरे मिलाएं।

4. उत्तेजना माध्यम में खेती द्वारा सेल शीट गठन

नोट: एक बाँझ जैवसेफ्टी हुड में सभी चरणों का संचालन करें।

  1. सामान्य पूर्ण अल्फा-एमईएम माध्यम को सावधानी से त्यागें, और फ्लास्क के नीचे से जुड़ी कोशिकाओं को छूने से बचें।
  2. उत्तेजना माध्यम के 10 एमएल धीरे-धीरे जोड़ें और पूरी तरह से संकुचित कोशिकाओं के लिए किसी भी अशांति पैदा करने से बचें।
  3. 9 दिनों के लिए उत्तेजना माध्यम में कोशिकाओं संस्कृति (हर 3 दिन माध्यम बदलें) पर्याप्त रूप से 5% सीओ2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेल शीट उत्पन्न करने के लिए ।
    नोट: एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स मोटी हो जाएगी और बादल छाए रहने के लिए मौजूद होगी जब एस्कॉर्बिक एसिड द्वारा उत्तेजित होने के बाद फ्लास्क के नीचे से मनाया जाता है, जिसका अर्थ है कि सेल शीट पर्याप्त रूप से उत्पन्न होती है।

5. 3डी टेंडन स्टेम सेल निर्माण की तैयारी

नोट: एक बाँझ जैवसेफ्टी हुड में सभी चरणों का संचालन करें।

  1. फ्लास्क को इनक्यूबेटर से बाहर निकाल लें।
  2. उत्तेजना माध्यम को पूरी तरह से त्याग दें।
  3. फ्लास्क को घूमता हुआ मोनोलेयर सेल शीट को फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) से धोएं।
  4. पीबीएस को पूरी तरह से छोड़ दें।
  5. फ्लास्क के कोने में 0.25% ट्राइपसिन के 1 एमएल जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
  6. फ्लास्क के कोने को टैप करें मोनोलेयर सेल शीट को डी-अटैच करने के लिए जब तक सेल शीट का कोना फ्लास्क के नीचे से नहीं हो जाता।
  7. ट्राइपसिनाइजेशन को रोकने के लिए तुरंत पूरा अल्फा-एमईएम माध्यम का 9 एमएल जोड़ें।
  8. मोनोलेयर सेल शीट को पूरी तरह से छीलने के लिए फ्लास्क को घूमता हुआ जारी रखें।
  9. मध्यम के साथ एक पेट्री डिश में कुल डी-अटैच सेल शीट डालो।
  10. सेल शीट के एक कोने को लेने के लिए एक बाँझ चिमटी का उपयोग करें और 15 बार के लिए एक दक्षिणावर्त दिशा में घुमाएं।
  11. सेल शीट का एक और अंत उठाओ और 10 बार के लिए एक विरोधी दक्षिणावर्त दिशा में घुमाने के लिए दृढ़ता से एक कण्डरा की तरह इन विट्रो निर्माण(चित्रा 1A)उत्पन्न करते हैं ।

6. अद्वितीय डिजाइन बायोरिएक्टर में एकीय-स्ट्रेचिंग मैकेनिकल उत्तेजना परिसर की असेंबली

नोट: एक बाँझ जैवसेफ्टी हुड में सभी चरणों का संचालन करें।

  1. कनेक्टर द्वारा हुक कनेक्ट करें और दो हुक के बीच वांछित दूरी (2 सेमी) में समायोजित करें।
  2. धीरे-धीरे हवा 3डी टीडीएससी प्रत्येक हुक(चित्रा 1B)पर 3 बार के लिए इकट्ठे हुक पर निर्माण।
  3. दो सिरों पर शिकंजा कस कर बायोरिएक्टर के कक्ष पर सेल निर्माण के साथ हुक सुरक्षित करें।
    नोट: शिकंजा और हुक सहित पूरे कक्ष, बाँझ है (134 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए ऑटोक्लेव और पराबैंगनी किरणों (यूवी) उपयोग से पहले 24 घंटे के लिए बेनकाब) । कक्षों के धातु धारक के लिए, यूवी प्रकाश उपयोग से पहले 48 घंटे के लिए बेनकाब।
  4. पूरा अल्फा-एमईएम माध्यम से कक्ष भरें।
  5. ऐक्टिवेटर को केबल से कल्चर चैंबर से कनेक्ट करें।
  6. बाँझ कैंची से हुक कनेक्टर काटें।
  7. यांत्रिक उत्तेजना शुरू करने के लिए शक्ति और इसी चैनल नियंत्रक पर स्विच करें।
  8. चैंबर पर ढक्कन लगा दिया।
  9. संकेतक रोशनी की जांच करें और बायोरिएक्टर को ठीक से काम कर सकते हैं आश्वासन दें।
  10. इनक्यूबेटर में बायोरिएक्टर रखो और 3 डी सेल 6 दिनों के लिए यांत्रिक खींच करने के लिए निर्माण विषय (6% खींच, ०.२५ हर्ट्ज, 8 घंटे, 16 घंटे आराम के बाद) ।

7. यांत्रिक का मूल्यांकन इन विट्रो टेंडन जैसे ऊतक को उत्तेजित किया गया

  1. एक पेचकश द्वारा शिकंजा ढीला और ध्यान से विधानसभा ले।
  2. 15 मिनट के लिए निर्धारण के लिए टेंडन जैसे ऊतक को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में रखें।
  3. फिक्स्ड टेंडन जैसे टिश्यू को बायोप्सी फोम पैड के साथ बायोप्सी कैसेट में रखें।
  4. नमूने को निर्जलित करने की प्रक्रिया और अंत में एच एंड ई हिस्टोलॉजिकल धुंधला द्वारा मूल्यांकन।
  5. पूरे प्रोटोकॉल को दोहराएं और मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) द्वारा टेनोजेनिक मार्कर की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए टेंडन जैसे ऊतक से आरएनए निकालें। चयनित जीन के लिए प्राइमर तालिका 1में सूचीबद्ध हैं।
    नोट: हिसटोलॉजी प्रोटोकॉल और क्यूपीसीआर प्रोटोकॉल मानक हैं और पिछले अध्ययन21का पालन कर रहे हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यांत्रिक उत्तेजना से पहले, टीडीएससी को पूर्ण माध्यम में 100% संगम में उगाया गया था और एक अव्यवस्थित अल्ट्रास्ट्रक्चरल आकृति विज्ञान(चित्रा 2 ए)प्रदर्शित किया गया था। एकीय स्ट्रेचिंग मैकेनिकल लोडिंग के 6 दिनों के बाद, एक्सेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) और सेल अलाइनमेंट अच्छी तरह से केंद्रित थे(चित्रा 2B)। कोशिकाओं को अच्छी तरह से आबादी और अच्छी तरह से यांत्रिक लोड होने के बाद ईसीएम में छा रहे थे । सेल आकृति विज्ञान को विस्तारित करने के लिए प्रस्तुत किया गया था और बिना खींच(चित्रा 2C)के एक की तुलना में सामान्य कण्डरा कोशिका के समान था। लोडिंग के साथ सेल निर्माण में सेल घनत्व लोड किए बिना एक की तुलना में अधिक था। क्यूपीसीआर के परिणामों से पता चला है कि वर्तमान विधि ने स्थिर संस्कृति द्वारा इलाज किए गए लोगों की तुलना में स्क्लेरेक्सिस, मोहॉक, टेनोमडुलिन और COL1A1(चित्रा 3)सहित टेनोजेनिक मार्कर की अभिव्यक्ति में वृद्धि की।

Figure 1
चित्रा 1: तीन आयामी (3 डी) सेल की विधानसभा बायोरिएक्टर के हुक पर निर्माण करती है। (ए)हुक के ऊपर 3डी सेल का सामान्य दृश्य। (ख)हुक के ऊपर 3डी सेल निर्माण को इकट्ठा करने के लिए आरेख । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: यांत्रिक उत्तेजना से पहले और बाद में सेल आकृति विज्ञान। (क)टेंडन-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं को पूर्ण माध्यम में 100% संगम में उगाया गया और यांत्रिक उत्तेजना से पहले एक अव्यवस्थित अल्ट्रास्ट्रक्चरल आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया गया। (ख)हिस्टोलॉजिक छवियों ने यांत्रिक उत्तेजना के बाद सेल निर्माण के एच एंड ई धुंधला दिखाया। (ग)हिस्टोलॉजिक छवियों ने यांत्रिक उत्तेजना के बिना 6 दिनों के लिए बायोरिएक्टर में सुसंस्कृत नियंत्रण कोशिका के एच एंड ई धुंधला दिखाया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: टेनोजेनेसिस मार्कर का अभिव्यक्ति स्तर। व्यक्तिगत जीन-अभिव्यक्ति के स्तर को पहले आंतरिक नियंत्रण, 36B4 के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया था, और फिर स्थिर संस्कृतियों से जीन-अभिव्यक्ति के स्तर के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया था। 3 प्रयोगों के परिणाम दिखाए जाते हैं। क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर सीक्वेंस तालिका 1में प्रदान किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: त्रि-आयामी एकीय यांत्रिक उत्तेजना बायोरिएक्टर प्रणाली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जीन प्राइमर सीक्वेंस
फॉरवर्ड 5'->3' रिवर्स 5'->3'
COL1A1 TGACTGGAGAGGAGAGT जीटीटीसीजीजीजीसीटीजीटीजीएजीजीजीटी
स्क्लेरेक्सिस सीसीसीएएएसीएसीसीटीसीटीटीटीटीटीटीटी जीजीसीसीटीसीसीसीजीटीजीएक्टटीसीएजी
मोहॉक जीटीसीसीजीसीएजीसीसीगागटाग टीसीजीसीजीजीटीसीटीटीसीसीसीटीटीए
टेनोमोडुलिन CCGCAGAAAAGCCATTATTGAA GACCACCCATTGCTCATTCT
36B4 सीटीटीसीसीसीएक्टक्टगएएजीजी CGAAGACCGAATCCCATA

तालिका 1: QPCR विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर दृश्य

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

टेंडन एक मेकेनोसेंसिव रेशेदार कनेक्टिव टिश्यू है। पिछले शोध के अनुसार, अतिरिक्त यांत्रिक लोडिंग टेंडन स्टेम कोशिकाओं के ऑस्टियोजेनिक भेदभाव का कारण बन सकती है, जबकि अपर्याप्त लोडिंग से टेंडन भेदभाव21के दौरान अव्यवस्थित कोलेजन फाइबर संरचना का कारण बन जाएगा।

एक आम दृश्य यह है कि एक आदर्श बायोरिएक्टर की कुंजी इन विट्रो सेलुलर माइक्रोएनवायरमेंट को अनुकरण करने की क्षमता है जो वीवो में कोशिकाओं से गुजरती है। इसलिए, विट्रो में वीवो सामान्य तनाव वातावरण में नकल करना टेंडन कोशिकाओं में टीडीएससी के एकल-वंश भेदभाव को उत्तेजित करने की कुंजी है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, टीडीएससी निर्माण की चौड़ाई 2 सेमी थी, और हुक की आंदोलन सीमा 0.12 सेमी थी, जिसका अर्थ है कि तनाव 0.12/2 (%) था। अंत में, वर्तमान प्रोटोकॉल में 6 दिनों (6%, 0.25 हर्ट्ज, 8 एच, इसके बाद 16 घंटे आराम) के लिए बायोरिएक्टर में टीडीएससी को यांत्रिक रूप से उत्तेजित किया गया था। मूल्यांकन के बाद, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले यांत्रिक लोडिंग पैरामीटर टीडीएससी को टेंडन जैसे ऊतक उत्पन्न करने के लिए प्रेरित करने के लिए साबित हुए हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बायोरिएक्टर पैरामीटर विशेष रूप से संबंधित प्रकार की स्ट्रेचिंग सिस्टम से मेल खाने चाहिए। उदाहरण के लिए, मोनोलेयर्ड सेल स्ट्रेचिंग के लिए उचित पैरामीटर वर्तमान 3डी सेल शीट से भिन्न हैंजो26,27तक फैले हुए हैं। इसका संभावित कारण21के विभिन्न बल मोड हैं . 2D मोनोलेयर स्ट्रेचिंग सिस्टम में, कोशिकाएं नीचे फोकल आसंजन द्वारा संस्कृति सब्सट्रेट से जुड़ती हैं और सेल-सेल जंक्शनों के माध्यम से एक दूसरे से जुड़ती हैं। हालांकि, 3डी सेल शीट में, 3डी आला के परिणामस्वरूप कई और सेल-ईसीएम कनेक्शन भी बनते हैं, जिसका अर्थ है कि कोशिकाएं खींचने के अलावा दबाव में हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता को आकृति विज्ञान और टेनोजेनिक मार्कर के अभिव्यक्ति स्तर द्वारा प्रदर्शित किया गया था। आकृति विज्ञान के संदर्भ में, हिस्टोरोलॉजी के अलावा, कोलेजन का पता लगाने के लिए कॉन्फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मैं कोलेजन संगठन की विशेषता और फिर ईसीएम संरेखण का मूल्यांकन करने का एक आम तरीका है। पिछले अध्ययन ने टीडीएससी में अच्छी तरह से गठबंधन कोलेजन प्रकार की पुष्टि की, मैं 6 दिनों के लिए 6% एकक्षीय यांत्रिक उत्तेजना के साथ निर्माण करता हूं लेकिन21लोड किए बिना एक में नहीं। टेनोजेनिक मार्कर का उपयोग टेंडन कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया गया था, जिसमें स्क्लेरेक्सिस (एससीएक्स), मोहॉक (एमकेएक्स), टेनोमोडुलिन (टीएनएमडी) और COL1A1 शामिल थे । केवल टीएनएमडी एक गैर-ट्रांसक्रिप्शन कारक था, और उनमें से बाकी ट्रांसक्रिप्शन कारक28हैं। वे सब अच्छी तरह से पहचाने गए थे । एससीएक्स भ्रूणीय चरण29में टेंडन विकास को विनियमित कर सकता है, जबकि एमकेएक्स प्रसवोत्तर चरण30में टेंडन भेदभाव और परिपक्वता को विनियमित कर सकता है । इसके अलावा, कण्डरा जैसे ऊतक के यांत्रिक गुणों (अधिकतम भार और कठोरता) का मूल्यांकन पिछले अध्ययन में भी किया गया है, और इससे पता चला कि लोडिंग के साथ टीडीएससी निर्माण के यांत्रिक गुण21लोड किए बिना बेहतर थे।

माध्यम कोशिका विकास और भेदभाव को प्रभावित कर सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, सेल शीट को उचित तरीके से बनाने के लिए, टीडीएससी को पूर्ण माध्यम में मानक अनकोटेड प्लास्टिक फ्लास्क में 100% संगम में उगाया गया था, और फिर टीडीएससी को 6 डी के लिए 4.4 मिलीग्राम/एमएल एस्कॉर्बिक एसिड जोड़कर ईसीएम जमाव को बढ़ावा देने के लिए प्रेरित किया गया था। इंसुलिन जैसे विकास कारक I, संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर, प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक, बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर, ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर और ग्रोथ डिफरेंस फैक्टर 5 सहित कई ग्रोथ फैक्टर्स ने टेंडन फॉर्मेशन और हीलिंग31, 32,,33,,,34में अहम भूमिका निभाई ।33 इसके अतिरिक्त नी एट अल के रूप में उत्तेजना संस्कृति माध्यम में 25 एनजी/एमएल कनेक्टिव ऊतक विकास कारक जोड़ने की रिपोर्ट पूरे विकास और भेदभाव प्रक्रिया३५में तेजी ला सकता है ।

वर्तमान में, 2डी सेल शीट, जिसे मोनोलेयर्ड सेल के रूप में भी जाना जाता है, यांत्रिक जांच के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे आम प्रणाली है। बाइक्सियल खिंचाव बहुदिशात्मक तनाव प्रदान करता है, दोनों देशांतर और बाद में, के रूप में एकीय खिंचाव केवल देशांतर तनाव३६प्रदान करता है । इस प्रकार, बाइक्सियल खिंचाव के साथ मोनोलेयर्ड सेल संस्कृति कुछ प्रकार की कोशिकाओं के विकास वातावरण की नकल कर सकती है, जैसे कार्डियोमायोसाइट्स और एपिडर्मल कोशिकाएं। हालांकि, 3 डी सेल निर्माण एक कण्डरा के वास्तविक आकार के समान है, और एकक्षी खिंचाव टेंडन कोशिकाओं की तनाव विशेषताओं के समान है, 2D सेल शीट और बाइक्सियल खिंचाव की तुलना में। इस प्रकार, 3 डी सेल निर्माण और एकीय खींच का संयोजन कण्डरा और उसके यांत्रिक सूक्ष्म पर्यावरण की बेहतर समझ के लिए अधिक सक्षम है। यह टीडीएससी के भेदभाव को प्रोत्साहित करने के लिए 3 डी एकीय खींच प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक सैद्धांतिक आधार प्रदान करता है। इस प्रकार, 2डी सेल शीट को अंततः 3 डी सेल निर्माण में लुढ़का दिया गया और वर्तमान प्रोटोकॉल में एकाक्षिक खिंचाव से गुजरना पड़ा।

वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बायोरिएक्टर में एक्ट्यूएटर और कल्चर चैंबर(चित्रा 4)शामिल थे। वर्तमान बायोरिएक्टर का विवरण पिछले अध्ययन37में उपलब्ध है . वर्तमान में, टेंडन के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम एक्ट्यूएटर में वायवीय एक्ट्यूएटर, रैखिक मोटर्स और स्टेप मोटरबॉल स्टूस38,,39,,40शामिल थे। कक्षों में एकीकृत और अलग कक्ष41,42शामिल थे . उनमें से, एक रैखिक मोटर के साथ एक अलग कक्ष सटीक यांत्रिक लोडिंग प्रदान की और पोर्टेबल और43समायोजित किया जाना आसान था।

टीडीएससी को छोड़कर, अन्य प्रकार की स्टेम सेल वर्तमान विधि में उपयोग किए जाने वाले संभावित सेल स्रोत हो सकते हैं। पिछले शोध से पता चला है कि स्टेम कोशिकाओं के अंय प्रकार के संभावित चिकित्सीय क्षमता हो सकती है और कण्डरा उत्थान में सुधार हो सकता है । पारंपरिक गैर-कोशिकीय आधारित प्रबंधन के साथ इलाज किए गए घायल घोड़े टेंडन की तुलना में, बीएमएससी द्वारा उपचारित टेंडन की पुनः चोट दर44,,45कम थी। इसके अलावा, बीएमएससी के टेंडिनोपैथी मॉडल में इंट्रेनाजिनस इंजेक्शन प्रभावी रूप से टेंडन पुनर्जनन46को प्रेरित कर सकता है। आदिपोस व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाएं घोड़े के कण्डरा का प्रभावी ढंग से इलाज कर सकती हैं जिससे पूरी तरह से वसूली होती है और घोड़ों में सामान्य गतिविधि में वापसी होती है47. एक साथ, यह सुझाव देने के लिए पर्याप्त सबूत थे कि टीडीएससी को छोड़कर स्टेम सेल, टेंडन अध: पतन का इलाज कर सकते हैं । हालांकि, एक चेतावनी नोट के रूप में, घायल टेंडन में बीएमएससी के प्रत्यारोपण को खरगोश मॉडल में एक्टोपिक ऑस्टियोजेनिक भेदभाव को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है, जिससे यह सुझाव दिया गया है कि एक विशिष्ट ऊतक से स्टेम कोशिकाओं में मूल48के अपने ऊतकों की अवांछित कोशिकाओं में अंतर करने की प्रवृत्ति हो सकती है। पिछले शोध में, टीडीएससी को लोडिंग-वंचित उपचार के परिणामस्वरूप ऑस्टियोजेनेसिस के साथ-साथ21भी हो सकता है, जिसके कारण यह प्रस्ताव आया कि वर्तमान विधि में अन्य स्टेम कोशिकाओं के टेनोजेनेसिस को प्रेरित करने और विशिष्ट लोडिंग व्यवस्था के साथ ऑस्टियोजेनेसिस से बचने की क्षमता है। अन्य प्रकार की स्टेम कोशिकाओं के लिए इन विशिष्ट लोडिंग व्यवस्थाओं का पता लगाने के लिए आगे अनुसंधान आवश्यक है। यदि यह परिदृश्य रखता है, तो टेंडिनोपैथी के इलाज के लिए अधिक सेल स्रोत उपलब्ध होगा।

अभी भी कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, हालांकि एक गैर-कोरोसिव और ऑटोक्लेवेबल सामग्री, स्टेनलेस स्टील का उपयोग बायोरिएक्टर प्रणाली का निर्माण करने के लिए किया जाता था, संस्कृति की स्थिति और संस्कृति माध्यम अभी भी स्क्रू और हुक सहित कक्ष को खराब करते हैं। इस प्रकार, कक्ष का नियमित निरीक्षण और समय पर जंग हटाने आवश्यक हैं। दूसरा, वर्तमान बायोरिएक्टर को आर्थिक और पोर्टेबल बनाने के लिए इसमें पर्यावरण नियंत्रण और मीडियम सर्कुलेशन सिस्टम नहीं है । इस प्रकार, ऑपरेटर को बायोरिएक्टर को परिवहन करने और हर 3 दिनों में मध्यम विनिमय के लिए चैंबर खोलने की आवश्यकता होती है, जिससे प्रदूषण का खतरा बढ़ जाता है। ऑपरेटर को टीडीएससी पर्यावरण बाँझ रखने के लिए हमेशा ध्यान देना चाहिए ।

टेंडिनोपैथी के उपचार के लिए, गैर-शल्य चिकित्सा के नजरिए से पैथोलॉजिकल प्रक्रिया को स्पष्ट करना महत्वपूर्ण है। सर्जिकल उपचार के संदर्भ में, एक प्रभावी विधि इंजीनियर ऑटोलोगस ग्राफ्ट का उपयोग करना है। वीवो में भेदभाव की नकल करने के लिए टीडीएससी को उत्तेजित करने की प्रक्रिया टेंडिनोपैथी की पैथोलॉजिकल प्रक्रिया की जांच के लिए मददगार है। इंजीनियर पाड़ मुक्त कण्डरा ऊतक एक चूहा पटेलर कण्डरा खिड़की चोट मॉडल में कण्डरा चिकित्सा को बढ़ावा देने की क्षमता है । इसके अलावा, पिछले काम ने साबित कर दिया कि यांत्रिक लोडिंग सुसंस्कृत कण्डरा के यांत्रिक गुणों में सुधार कर सकती है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल टेंडन जैसे ऊतकों में टीडीएससी के निर्देशित भेदभाव के लिए एक प्रजनन विधि प्रदान करता है ताकि इसका उपयोग संभावित इंजीनियर टेंडन संस्कृति के लिए बस और व्यवहार्य किया जा सके।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह शोध उस समय किया गया जबकि लेखक को "पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया विश्वविद्यालय अंतर्राष्ट्रीय शुल्क छात्रवृत्ति और पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया विश्वविद्यालय में विश्वविद्यालय स्नातकोत्तर पुरस्कार" की प्राप्ति हुई । इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (81802214) ने सपोर्ट किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper's knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper's knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), Bristol, Avon. 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), Oxford, England. 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), Oxford, England. 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), Bristol, England. 014109 (2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), Cambridge, England. 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

Tags

मेडिसिन अंक 162 मैकेनिकल लोडिंग टेंडन-व्युत्पन्न स्टेम सेल टेंडिनोपैथी बायोरिएक्टर विभेदन टेंडन स्टेम सेल
टेंडन-व्युत्पन्न स्टेम सेल के टेनोजेनिक भेदभाव को प्रेरित करने के लिए त्रि-आयामी यूनिएक्सियल मैकेनिकल स्टिमुलेशन बायोरिएक्टर सिस्टम लागू करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen,More

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter