Summary
三维单轴机械刺激生物反应器系统是肌腱衍生干细胞和新肌腱形成具有致源特异性分化的理想生物反应器。
Abstract
肌腱病是一种常见的慢性肌腱疾病,与骨科区域的炎症和退化有关。由于发病率高,自我修复能力有限,最重要的是,没有明确的治疗,肌腱病仍然对患者的生活质量产生负面影响。肌腱衍生干细胞(TDSCs)作为肌腱细胞的原发性前体细胞,在肌腱病的发育以及肌腱病后的功能和结构恢复都起着至关重要的作用。因此,一种在体外模拟TDSC在体内分化为肌腱细胞的方法将是有用的。在这里,本协议描述了一种基于三维(3D)单轴拉伸系统的方法,以刺激TDSC分化成跟腱样组织。本方案分为七个阶段:小鼠TDSC的分离、小鼠TDSC的培养和扩张、细胞表形成刺激培养的制备、刺激培养的细胞片的形成、3D肌腱干细胞结构的准备、单轴拉伸机械刺激复合物的组装以及体外肌腱类组织的机械刺激评估。组织学证明了这种有效性。整个过程需要不到3周的时间。为了促进细胞外基质沉积,在刺激培养基中使用了4.4mg/mL抗坏血酸。带线性电机的分离室提供精确的机械载荷,便于携带且易于调整,适用于生物反应器。本协议的装载方案为6%应变,0.25赫兹,8小时,随后16小时休息6天。该协议可以模拟肌腱的细胞分化,有助于肌腱病的病理过程研究。此外,肌腱般的组织有可能用于促进肌腱愈合在肌腱损伤作为工程自体移植。综上关于本议定书简单、经济、可重复、有效的方案。
Introduction
肌腱病是常见的运动损伤之一。它主要表现在疼痛、局部肿胀、受影响区域肌肉张力减轻和功能障碍。肌腱病的发生率很高。跟腱病的存在是最常见的中长跑运动员(高达29%),而在排球运动员(45%),篮球(32%),田径(23),手球(15%)和足球(13%)1,2,3,4,51,2,3,4的运动员也高。然而,由于肌腱自我修复能力有限,缺乏有效的治疗方法,肌腱病仍然对患者的生活产生负面影响,。此外,肌腱病的发病机制尚不清楚。关于其发病机制的研究已经很多,主要包括"炎症论","退化论","过度使用理论"等。目前,许多研究人员认为,肌腱病是由于自我修复失败造成的微损伤造成的过度机械负荷肌腱经验9,9,10。
肌腱衍生干细胞(TDSCs)作为肌腱细胞的原发性前体细胞,在肌腱病,11、12、13,12之后,在肌腱病的发育和功能及结构恢复中起着至关重要的作用。据报道,机械应激刺激可引起骨细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、中质干细胞和其他力敏感细胞的增殖和分化,14、15、16、17、18。14,15,16,17,18因此,TDSC,作为机械敏和多能细胞之一,同样可以通过机械载荷19,20来刺激,以区分。
然而,不同的机械载荷参数(装载强度、装载频率、载荷类型和装载周期)可以诱导TDSC分化成不同的单元21。因此,一个有效和有效的机械载荷制度对于肿瘤的发生具有非常重要意义。此外,还有不同类型的生物反应器作为刺激系统,目前用于向TDSC提供机械载荷。每种生物反应器的原理不同,因此对应不同生物反应器的机械载荷参数也不同。因此,需要一种简单、经济、可重复的刺激方案,包括生物反应器的类型、相应的刺激介质和机械载荷装置。
本文介绍了一种基于三维(3D)单轴拉伸系统的方法,以刺激TDSC分化成肌腱样组织。该协议分为七个阶段:小鼠TDSC的分离、小鼠TDSC的培养和扩张、细胞表形成刺激培养的制备、刺激培养的细胞表的形成、3D肌腱干细胞结构的准备、单轴拉伸机械刺激复合物的组装以及机外肌腱类组织的评价。整个过程需要不到3周的时间才能获得3D细胞构造,这远远低于一些现有的方法22,23。22,本协议已被证明能够诱导TDSC分化成肌腱组织,它比目前常用的二维(2D)拉伸系统21更可靠。组织学证明了这种有效性。简言之,本议定书简单、经济、可重复、有效。
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Protocol
上述方法根据西澳大利亚大学动物伦理委员会的准则和条例得到批准和执行。
1. 小鼠TDSC的隔离
- 通过宫颈脱位使6-8周大的C57BL/6小鼠安乐死。
- 收获的跟腱24和跟腱25。
- 消化肌腱从一个与6 mL的一型我胶原酶(3毫克/mL)为3小时。
注意:由于鼠标肌腱的大小较小,因此应在此步骤中使用从一只鼠标中采集的所有肌腱。 - 收集细胞和培养在完整的最小基本介质(阿尔法-MEM)包含10%的胎儿牛血清(FBS)和1%的链霉素和青霉素混合物7天。
- 使用流式细胞学荧光激活细胞排序识别TDSC(包括CD44、CD90和Sca-1在内的细胞表面标记的表达;缺乏CD34和CD45的表达)。
- 通过和冻结细胞(通道4细胞将用于进一步的步骤)。
2. 小鼠TDSC的培养和扩展
注:在无菌生物安全罩中执行所有步骤。
- 以加热细胞(小鼠TDSC,100万个细胞,通道4至37°C)。
- 慢慢添加额外的 4-5 mL 完整的最小基本介质 (Alpha-MEM)。
- 将混合物转移到带移液器的 15 mL 离心管中。
- 用移液器以中到 8 mL 的总为顶。
- 在37°C烤箱培养箱中预热介质。
- 将管子放入离心机并平衡。
- 347 x g 的离心机和颗粒细胞,5 分钟。
- 离心机后取出并检查底部的颗粒。
- 在1-2 mL的完整介质中轻轻冷冻细胞,并重新暂停细胞(避免产生太多的气泡)。
- 通过移液器将重新暂停的细胞转移到T-75烧瓶中。
- 使用移液器将完整的 Alpha-MEM 介质添加到烧瓶中,达到总体积 10 mL,最终浓度为 13,000 个细胞/厘米2。
- 将烧瓶放入孵化器,在37°C下用5%的CO2进行培养。
- 每 3 天更换一次介质。
- 在改变培养介质时,观察和监视显微镜下的细胞,直到细胞被培养到100%汇合(约40,000个细胞/厘米2)。
3. 为细胞片形成准备刺激培养培养
注:在无菌生物安全罩中执行所有步骤。
- 将 15 mL 的完整 Alpha-MEM 介质倒入 15 mL 无菌管中。
- 将6μL的抗坏血酸(11毫克/mL)加入15 mL的介质中,最终浓度为4.4μg/mL。
注:此外,在刺激培养培养培养培养培养中加入25纳克/mL结缔组织生长因子可以加速整个生长和分化过程。 - 通过上下反转轻轻混合。
4. 在刺激介质中培养细胞片形成
注:在无菌生物安全罩中执行所有步骤。
- 小心丢弃正常完整的α-MEM介质,避免接触附着在烧瓶底部的细胞。
- 缓慢加入10 mL的刺激介质,避免对完全汇合细胞造成任何干扰。
- 培养刺激培养基中的细胞9天(每3天改变一次培养基),在37°C下用5%CO2充分生成细胞表。
注:在受到抗坏血酸刺激后,从烧瓶底部观察到细胞外基质会变厚,并呈现多云,这意味着细胞片已充分生成。
5. 3D肌腱干细胞结构的准备
注:在无菌生物安全罩中执行所有步骤。
- 把烧瓶从孵化器里拿出来
- 完全丢弃刺激介质。
- 用磷酸盐缓冲液盐水 (PBS) 用旋转烧瓶清洗单层细胞片。
- 完全丢弃 PBS。
- 使用移液器将 1 mL 的 0.25% trypsin 添加到烧瓶的一角。
- 点击烧瓶的一角去连接单层细胞片,直到细胞片的一角从烧瓶的底部。
- 立即添加 9 mL 的完整 Alpha-MEM 介质,以停止三辛化。
- 继续旋转烧瓶,完全剥下单层细胞片。
- 将总去附细胞片倒入带介质的培养皿中。
- 使用无菌钳子拾取细胞片的一角,顺时针方向旋转 15 次。
- 拾取细胞片的另一端,逆时针方向旋转10次,以牢固地生成一个跟腱状的体外构造(图1A)。
6. 在独特设计的生物反应器中组装单轴拉伸机械刺激复合物
注:在无菌生物安全罩中执行所有步骤。
- 通过连接器连接挂钩,并调整到两个挂钩之间的所需距离(2 厘米)。
- 轻轻将 3D TDSC 构造在组装的挂钩上,在每个挂钩上吹 3 次(图 1B)。
- 通过拧紧两端的螺钉,将带电池结构的挂钩固定到生物反应器的腔室上。
注:整个腔室(包括螺钉和挂钩)无菌(在 134 °C 下 1.5 小时自动处理),使用前 24 小时暴露紫外线 (UV))。对于腔室的金属支架,UV 光在使用前暴露 48 小时。 - 用完整的 Alpha-MEM 介质填充腔室。
- 通过电缆将执行器连接到培养室。
- 用无菌剪刀切开挂钩连接器。
- 打开电源和相应的通道控制器以启动机械刺激。
- 盖在室上。
- 检查指示灯并确保生物反应器正常工作。
- 将生物反应器放入培养箱中,将 3D 细胞结构置于机械拉伸 6 天(6% 拉伸、0.25 Hz、8 小时,然后 16 小时休息)。
7. 体外肌腱样组织的机械刺激评价
- 用螺丝刀松开螺钉,小心地拆下组件。
- 将肌腱状组织放入4%的半成醛中,进行固定15分钟。
- 将固定的肌腱样组织放入活检盒中,并配有活检泡沫垫。
- 过程脱水样品,最后通过H&E组织学染色进行评估。
- 重复整个方案,从肌腱样组织中提取RNA,通过定量PCR(qPCR)评估致畸标记的表达。所选基因的底片列在表1中。
注:组织学协议和qPCR协议是标准的,遵循先前的研究21。
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Representative Results
在机械刺激之前,TDSC以完整的介质生长到100%的汇合,并表现出一种混乱的超结构形态(图2A)。经过6天的单轴拉伸机械载荷,细胞外矩阵(ECM)和细胞对齐方向良好(图2B)。机械装载后,电池填充良好,并密罩在 ECM 中。细胞形态呈现为拉长,与没有拉伸的肌腱细胞相比更相似(图2C)。带载荷的细胞构造中的细胞密度高于无载荷的细胞密度。QPCR结果表明,与静态培养处理方法相比,本方法增加了包括Scleraxis、莫霍克、特诺莫杜林和COL1A1(图3)等致原标记的表达。
图1:三维(3D)细胞结构在生物反应器的挂钩上组装。(A) 3D 单元格构造在挂钩上一般视图。(B) 在挂钩上组装 3D 单元格构造的图。请单击此处查看此图的较大版本。
图2:细胞形态在机械刺激之前和之后。(A) Tendon衍生干细胞在完整介质中生长到100%的汇合,在机械刺激前表现出一种混乱的超结构形态。(B) 组织学图像显示,机械刺激后细胞结构的H&E染色。(C) 组织学图像显示,在生物反应器中培养的控制细胞结构的H&E染色6天,没有机械刺激。请单击此处查看此图的较大版本。
图3:天生标记的表达级别。单个基因表达水平首先针对内部控制36B4进行规范化,然后针对静态培养物的基因表达水平进行规范化。显示了3个实验的结果。用于 qPCR 分析的底项序列在表1 中提供。请单击此处查看此图的较大版本。
图4:三维单轴机械刺激生物反应器系统。请单击此处查看此图的较大版本。
基因 | 底图序列 | |
转发 5'->3' | 反向 5'->3' | |
COL1A1 | 特加格特加加格加格特 | 格特克特加特加特卡格特 |
斯克莱拉希斯 | 卡卡加特格特 | Ggctctccgtgctcttcag |
莫霍克 | 格特克格卡加加特塔格 | 特克夫特克克特克塔 |
特诺莫杜林 | Ccgcagctctattgaa | 加卡卡特克特克特克特 |
36B4 | Cttcacttgctggg | 克加加加奇加卡特卡塔 |
表1:用于 qPCR 分析的底器序列
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Discussion
肌腱是一种机械性纤维结缔组织。根据先前的研究,机械负荷过多可能导致肌腱干细胞的骨质分化,而负荷不足会导致肌腱分化期间胶原纤维结构紊乱。
一个普遍的观点是,理想的生物反应器的关键是能够模拟体内细胞微环境,细胞在体内经历的能力。因此,在体外模仿体内正常应激环境是刺激TDSC单谱分化到肌腱细胞的关键。在目前的协议中,TDSC构造的宽度为2厘米,吊钩的运动范围为0.12厘米,这意味着应变为0.12/2(%)。总之,在本协议中,TDSC在生物反应器中机械刺激6天(6%,0.25赫兹,8小时,后跟16小时休息)。经过评估,本协议中使用的机械载荷参数已被证明能诱导TDSC产生肌腱样组织。需要指出的是,生物反应器参数应特别匹配相应类型的拉伸系统。例如,单层单元格拉伸的正确参数不同于当前的 3D 单元格板拉伸26,27。,一个可能的原因是不同的力模式21。在二维单层拉伸系统中,细胞通过底部的焦粘附附着在培养基板上,通过细胞结相互连接。然而,在 3D 电池表中,由于 3D 利基,也形成了更多的细胞+ECM 连接,这意味着除了拉伸之外,细胞还承受着压力。
本协议的有效性通过形态学和致原标记的表达水平得到证明。在形态学方面,除了组织学外,使用共分免疫荧光显微镜检测胶原蛋白 I 是描述胶原蛋白组织特征,然后评估 ECM 排列的常见方法。先前的研究证实了TDSC构造中对齐良好的胶原蛋白类型一捆绑形成与6%的单轴机械刺激6天,但不是在一个没有加载21。致畸标记用于识别肌腱细胞,包括精干细胞(SCX)、莫霍克(MKX)、特诺穆杜林(TNMD)和COL1A1。只有TNMD是非转录因子,其余为转录因子28。他们都得到认可。SCX可以调节肌腱发育在胚胎阶段29,而MKX可以调节肌腱分化和产后30期成熟。此外,在以往的研究中对肌腱类组织的机械性能(最大载荷和刚度)进行了评价,结果表明,TDSC构造的机械性能优于无载荷21。
该培养素会影响细胞生长和分化。在现行协议中,为了以适当的方式形成细胞片,TDSC在标准无涂层塑料瓶中以全介质生长到100%的汇合,然后通过添加4.4mg/mL抗坏血酸来刺激TDSC的6d。。几个生长因子,包括胰岛素样生长因子一、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、基本成纤维细胞生长因子、生长因子转化因子、生长分化因子5等,在肌腱形成和愈合,,31、32、33、34等都发挥了重要作用。31,3233此外,在刺激培养基中加入25纳克/mL结缔组织生长因子,Ni等人报告可加速整个生长和分化过程35。
目前,2D细胞片,也称为单层细胞,是机械研究最常见的系统。双轴拉伸提供纵向和横向的多向张力,因为单轴拉伸只提供纵向张力36。因此,具有双轴拉伸的单层细胞培养可以模拟某些类型的细胞的生长环境,如心肌细胞和表皮细胞。然而,与2D细胞片和双轴拉伸相比,3D细胞构造与肌腱的真实形状更相似,单轴拉伸更类似于肌腱细胞的应力特征。因此,3D细胞构造和单轴拉伸的结合更有利于更好地了解肌腱及其机械微环境。这为使用三D单轴拉伸系统来刺激TDSC的分化提供了理论依据。因此,2D单元格板最终被卷进一个3D单元构造中,并在本协议中进行了单轴拉伸。
本协议中使用的生物反应器由执行器和培养室组成(图4)。目前的生物反应器的细节,可在先前的研究37。目前,用于肌腱的最常见的执行器包括气动执行器、线性电机和步进马达球螺钉38、39、40。38,39,40分庭包括综合和分离的分庭41,42。,42其中,带线性电机的分离室提供精确的机械载荷,便于携带,易于调节。
除TDSC外,其他类型的干细胞可能是目前方法中使用的潜在细胞源。先前的研究表明,其他类型的干细胞可能有潜在的治疗能力,并可能有助于改善肌腱再生。与传统的非细胞损伤治疗的损伤马肌腱相比,BMSCs治疗的肌腱的再损伤率较低,为44,45。,45此外,将BMSCS注射到肌腱病模型中,可以有效诱导肌腱再生46。脂肪衍生干细胞可以有效地治疗马肌肌腱病,导致完全恢复,并恢复正常活动在马47。总之,有足够证据表明,干细胞,除了TDSC,可以治疗肌腱退化。然而,作为一个警告,将BMSCs移植到受伤的肌腱中已被证明在兔子模型中诱导异位性骨质分化,这表明来自特定组织的干细胞可能有分化成其起源组织48的不需要的细胞的倾向。在以前的研究中,对TDSC的负荷剥夺治疗也可能导致骨质生成,因此提出,目前的方法有可能诱导其他干细胞的月生,并避免骨质生成与特定的加载机制。需要进一步研究,以探索这些特定的加载机制的其他类型的干细胞。如果这种情况成立,更多的细胞源来治疗肌腱病将可用。
还有一些限制需要承认。首先,虽然一种非腐蚀性和可自动降解材料,不锈钢,用于建立生物反应器系统,栽培条件和培养介质仍然腐蚀室,包括螺丝和钩。因此,有必要对腔室进行例行检查和及时清除铁锈。其次,为了使目前的生物反应器经济性、可移植性,没有环境控制和中循环系统。因此,操作员需要每 3 天运输一次生物反应器并打开腔室进行介质交换,从而增加污染风险。操作员必须始终注意保持 TDSC 环境无菌。
对于肌腱病的治疗,从非手术角度阐明病理过程至关重要。在手术治疗方面,一个有效的方法是使用工程自体移植。刺激TDSC模拟体内分化的过程有助于肌腱病病理过程研究。工程式无支架肌腱组织能够促进大鼠肌腱窗口损伤模型中的肌腱愈合。此外,以往的工作证明,机械载荷可以改善培养肌腱的机械性能。因此,该协议提供了一种可重复的方法,用于将TDSC定向分化成跟腱样组织,以便简单而合理地用于潜在的工程肌腱培养。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究是在提交人获得"西澳大利亚大学国际学费奖学金和西澳大利亚大学研究生奖"时进行的。这项工作得到了国家自然科学基金(81802214)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ascorbic acid | Sigma-aldrich | PHR1008-2G | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibcoä by Life Technologies | 1908361 | |
Histology processor | Leica | TP 1020 | |
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) | Gibcoä by Life Technologies | 2003802 | |
Mouse Tendon Derived Stem Cell | Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions. | ||
Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | 441244 | |
Streptomycin and penicillin mixture | Gibcoä by Life Technologies | 15140122 | |
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System | Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia | Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809 | |
Trypsin | Gibcoä by Life Technologies | 1858331 |
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