腱由来幹細胞の発熱分化を誘導する三次元単軸機械刺激バイオリアクターシステムの適用

Summary

三次元単軸的な機械的刺激バイオリアクターシステムは、腱由来幹細胞の形質特異的分化およびネオ腱形成のための理想的なバイオリアクターである。

Abstract

腱障害は、整形外科領域における炎症および変性に関連する一般的な慢性腱疾患である。高い罹患率、限られた自己修復能力、そして最も重要なことは、決定的な治療法がない、腱症は依然として患者の生活の質に悪影響を及ぼさない。腱由来幹細胞(TDSC)は、腱細胞の原発前細胞として、腱障害の発症と腱障害後の機能および構造的回復の両方において重要な役割を果たす。従って、インビトロでTDcSCの腱細胞への分化を模倣できる方法が有用であろう。ここで、本プロトコルは、TDSCを刺激して腱様組織に分化する三次元(3D)単軸ストレッチシステムに基づく方法を説明する。本プロトコルの7つの段階があります:マウスTDSCの単離、マウスTDSCの培養および拡大、細胞シート形成のための刺激培養培地の調製、刺激媒体中の培養による細胞シート形成、3D腱幹細胞構築物の調製、単軸伸張機械的刺激複合体の組立、および機械的刺激体型腱様組織の評価。有効性は、ヒストロジーによって実証された。全体の手順は3週間未満かかります。細胞外マトリックス沈着を促進するために、4.4mg/mLアスコルビン酸を刺激培養培地に使用した。線形モーターが付いている分離された部屋は正確な機械負荷を提供し、携帯用および容易に調節されるバイオリアクターのために適用される。本プロトコルにおける負荷レジームは、6%の株、0.25 Hz、8 h、続いて6日間16時間休息であった。このプロトコルは腱の細胞分化を模倣することができ、腱障害の病理学的プロセスの調査に有用である。さらに、腱様組織は、設計された自家移植片として腱損傷における腱治癒を促進するために使用される可能性がある。要約すると、現在のプロトコルはシンプルで経済的で、再現性があり、有効です。

Introduction

腱障害は、一般的なスポーツ傷害の一つです。それは主に痛みによって現れます, 局所腫れ, 患部の筋肉の緊張の低下, 機能不全.腱障害の発生率は高い。アキレス腱症の存在は、中長距離ランナー(最大29%)に最も一般的であり、膝蓋腱症の存在はバレーボール(45%)、バスケットボール(32%)、陸上競技(23%)、ハンドボール(15%)、サッカー(13%)1、2、3、4、5の選手でも高い。^1,2,3,4,5しかし、腱の自己治癒能力が限られているため、効果的な治療が不足しているため、腱症は依然として患者の生活に負の^66,77に影響を及ぼす。さらに、腱障害の病因は不明のままである。その病因について多くの調査が行われてきましたが、主に「炎症理論」、「変性理論」、「使い過ぎ理論」など^8.現在、多くの研究者は、腱障害は、腱の経験^99、1010の過度の機械的負荷によって引き起こされる微小傷害への自己修復の失敗によるものだと考えていた。

腱由来幹細胞(TDSC)は、腱細胞の原発前細胞として、腱障害^11、12、13後の腱障害および機能および構造的回復の両方の発達において重要な^11,役割^を13果たす。機械的ストレス刺激は、骨細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞および他の力感受性細胞14、15、16、17、18^{14,15,16,17,18}の増殖および分化を引き起こす可能性があると報告された。従って、TDcSCは、メカノイ感受性および多能性細胞の一つとして、機械的負荷^19、20,20によって同様に分化するように刺激することができる。

しかし、異なる機械的負荷パラメータ(荷重強度、積載頻度、積載タイプおよびローディング期間)は、TDCが異なるセル²¹に分化するように誘導する可能性がある。したがって、効果的かつ有効な機械的負荷のレジームは、テノジェネシスにとって非常に重要です。さらに、TDCに機械的負荷を提供するために現在使用されている刺激システムとして、バイオリアクターの種類が異なります。バイオリアクターの各種類の原理は異なるので、異なるバイオリアクターに対応する機械的負荷パラメータも異なります。したがって、バイオリアクターの種類、対応する刺激媒体、および機械的負荷体制を含む、簡便で経済的で再現可能な刺激プロトコルが要求されている。

本稿では、TDSCを刺激して腱様組織に分化する三次元(3D)単軸ストレッチシステムに基づく方法について説明する。プロトコルには、マウスTDSCの単離、マウスTDSCの培養および拡大、細胞シート形成のための刺激培養培地の調製、刺激媒体中の培養による細胞シート形成、3D腱幹細胞構築物の調製、単軸伸張機械的刺激複合体の組立、および機械的刺激体型腱様組織の評価の7段階がある。全体の手順は、いくつかの既存の方法^22、23,23よりもはるかに少ない3D細胞構造を得るために3週間未満かかります。本プロトコルは、TDSCを腱組織に分化するように誘導できることが証明されており、現在一般的に使用されている2次元(2D)延伸システム²¹よりも信頼性が高い。有効性は、ヒストロジーによって実証された。要するに、本プロトコルは、シンプルで経済的で、再現性があり、有効である。

Protocol

記載された方法は、西オーストラリア大学動物倫理委員会のガイドラインと規制に従って承認され、実施されました。

1. マウスTDSCの分離

1. 6-8週齢のC57BL/6マウスを子宮頸部脱臼で安楽死させる。
2. 収穫膝蓋腱²⁴とアキレス腱^25.
3. I型コラゲザーゼ(3mg/mL)の6mLを持つ腱を3時間消化します。
   注:マウスの腱のサイズが小さいので、1つのマウスから収穫されたすべての腱はこのステップで使用する必要があります。
4. 胎児ウシ血清(FBS)の10%とストレプトマイシンとペニシリン混合物の1%を含む完全な最小必須培地(Α-MEM)で細胞と培養を7日間収集します。
5. フローサイトメトリーによる蛍光活性化細胞選別(CD44、CD90、Sca-1を含む細胞表面マーカーの発現、CD34およびCD45の発現の欠如)を用いてTDSCを同定する。
6. 通過および凍結細胞(通路4細胞は、さらなるステップのために使用されます)。

2. マウスTDcの培養と拡大

注:無菌バイオセーフティフードですべてのステップを実行してください。

1. 温めた細胞(マウスTDC、100万個の細胞、通過4、37°C)を取る。
2. 完全な最小必須培地(アルファ-MEM)の余分な4-5 mLをゆっくりと追加します。
3. ピペットで15 mL遠心管に混合物を移します。
4. ピペットで合計8 mLまでの培地で上に上げます。
   1. 37°Cのオーブンインキュベーター中のプリウォーム培地。
5. チューブを遠心分離機とバランスに入れ。
6. 遠心分離機およびペレット細胞を347 x gで5分間用くる。
7. 遠心分離機の後に取り出し、下部のペレットを確認してください。
8. 凍結培地をデカントし、完全な培地の1〜2mLで細胞を穏やかに再懸濁する(泡が多すぎるのは避ける)。
9. 再懸濁した細胞をピペットでT-75フラスコに移す。
10. ピペットを使用してフラスコに完全なアルファ-MEM培地を追加し、最終的な濃度が13,000セル/cm²の総体積10 mLに達します。
11. フラスコをインキュベーターに入れ、培養物を_5%CO2で37°Cに入れる。
12. 3日ごとにメディアを変更します。
13. 培地を100%合流まで培養するまで、顕微鏡下で細胞を観察し、監視する(約40,000細胞^/cm2)。

細胞シート形成のための刺激培養培地の調製

注:無菌バイオセーフティフードですべてのステップを実行してください。

1. 完全なアルファ-MEM培地の15 mLを15 mLの無菌チューブに注ぎます。
2. 6 μL のアスコルビン酸 (11 mg/mL) を培地 15 mL に加え、最終濃度は 4.4 μg/mL となります。
   注:さらに、刺激培養培地に25ng/mL結合組織成長因子を加えることは、全体の成長および分化プロセスを加速することができる。
3. 上下に反転してやさしく混ぜます。

4. 刺激媒体で培養した細胞シート形成

注:無菌バイオセーフティフードですべてのステップを実行してください。

1. 正常な完全なα-MEM培地を慎重に捨て、フラスコの底部に取り付けられた細胞に触れないようにしてください。
2. 刺激媒体の10 mLをゆっくりと加え、完全にコンフルなコンフルエント細胞に任意の妨害を引き起こさないようにします。
3. 細胞を刺激培地で9日間培養し(3日毎に培地を変える)、5%CO2で37°Cで細胞シートを₂十分に生成する。
   注:細胞外マトリックスは、アスコルビン酸によって刺激された後、フラスコの底部から観察すると厚く、存在し、細胞シートが十分に生成されることを意味します。

5. 3次元腱幹細胞構築物の調製

注:無菌バイオセーフティフードですべてのステップを実行してください。

1. インキュベーターからフラスコを取り出します。
2. 刺激媒体を完全に捨てます。
3. フラスコを旋回してリン酸緩衝塩(PBS)で単層細胞シートを洗浄する。
4. PBS を完全に破棄します。
5. ピペットを使用して、フラスコの隅に0.25%トリプシンの1 mLを加えます。
6. フラスコの角をタップして、単層セルシートの角がフラスコの底部から外れるまで、単層セルシートを取り付け解除します。
7. すぐに完全なアルファ-MEM培地の9 mLを加えて、トリプシンを止めます。
8. フラスコを旋回し、単層細胞シートを完全に剥がします。
9. 取り付け解除されたセルシートの合計をペトリ皿に媒体で注ぎます。
10. 滅菌用のツイーザーを使用してセルシートの片隅を拾い上げ、時計回りに15回回転させます。
11. 細胞シートの別の端をピックアップし、抗時計回りの方向に10回回転させて腱様インビトロコンストラクトをしっかりと生成します(図1A)。

6. ユニークな設計されたバイオリアクターにおける単軸伸縮機械刺激複合体の組み立て

注:無菌バイオセーフティフードですべてのステップを実行してください。

1. 接続器でフックを接続し、2つのフック間の所望の距離(2cm)に調整します。
2. 組み立てられたフックの3D TDSCコンストラクトを各フックに3回軽く巻きます(図1B)。
3. 両端のネジを締めて、細胞コンストラクトをバイオリアクターのチャンバーに固定します。
   注:ねじやフックを含むチャンバー全体は無菌(134°Cで1.5時間オートクレーブ、紫外線(UV)は使用前に24時間露出します)。チャンバの金属ホルダーの場合、UVライトは使用前に48時間露出します。
4. チャンバーを完全なアルファ-MEM培地で満たします。
5. アクチュエータをケーブルで培養チャンバーに接続します。
6. 無菌はさみでフックコネクターをカットします。
7. 電源と対応するチャネルコントローラの電源を入れ、機械的刺激を開始します。
8. 蓋をチャンバーに置きます。
9. インジケータライトを確認し、バイオリアクターが正常に機能できることを確認してください。
10. インキュベーターにバイオリアクターを入れ、3D細胞構築物を機械的ストレッチに6日間(6%延伸、0.25Hz、8時間、続いて16時間休む)を施します。

7. 機械的刺激体のインビトロ腱様組織の評価

1. ドライバーでねじを緩め、慎重にアセンブリを取り外します。
2. 腱状組織を4%パラホルムアルデヒドに入れて15分間固定します。
3. 固定腱様組織を生検フォームパッド付きの生検カセットに入れる。
4. 試料を脱水し、最終的にH&E組織染色によって評価するプロセス。
5. 定量PCR(qPCR)によるテノジェニックマーカーの発現を評価するために、プロトコル全体を繰り返し、腱様組織からRNAを抽出します。選択した遺伝子のプライマーを表1に示します。
   注: ヒストロジープロトコルと qPCR プロトコルは標準であり、前の研究²¹に従います。

Representative Results

機械的刺激の前に、TDSCは完全な媒体で100%合流まで成長し、組織化されていない超構造形態を示した(図2A)。機械的ローディングの6日間の単軸ストレッチの後、細胞外マトリックス(ECM)および細胞の配向が良好に配向された(図2B)。細胞は、機械的な負荷の後にECMによく入り込み、よく包まれました。細胞形態は伸長するように提示され、伸張しないものに比べて通常の腱細胞に類似していた(図2C)。ローディングを伴うセル構成体の細胞密度は、ローディングなしのものよりも高かった。QPCRの結果は、本方法が、Scleraxis、Mohawk、テノモジュリン、およびCOL1A1(図3)を含むテノジェニックマーカーの発現を、静的培養によって処理されたものと比較して増加することを示した。

図1:バイオリアクターのフック上に立体(3D)細胞構築物の組み立て。(A) フック上の 3D セル構造の一般的なビュー。(B) フック上で 3D セルコンストラクトを組み立てる図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:機械的刺激の前後の細胞形態(A)腱由来幹細胞を完全培地で100%合流まで成長させ、機械的刺激の前に組織化されていない超構造形態を示した。(B)組織学的画像は、機械的刺激後の細胞構築物のH&E染色を示した。(C) ヒストリカル画像は、機械的刺激を伴わずに6日間バイオリアクターで培養したコントロール細胞構築物のH&E染色を示した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:細胞形成マーカーの発現量。個々の遺伝子発現レベルを、まず内部制御36B4に対して正規化し、次いで、静的培養物の遺伝子発現レベルに対して正規化した。3つの実験の結果が示される。qPCR 分析に使用されるプライマーシーケンスを表 1に示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:三次元単軸機械刺激バイオリアクターシステム.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

遺伝子	プライマーシーケンス
	フォワード 5'->3'	逆 5'->3'
コル1A1	トゥクトッガガーガグガガガガグ	GTTCGGGGTATGTACCACCGT
スクレラーク	CCCAAAAATATCTGCACCTTTTTT	グクトクトッククグクトクトカグ
モホーク	GTCCGGCAGCカガッタアグ	TCGCTGAGCTTCCCッタ
テノモジュリン	CCGCAAAGCCTTGAA	ガッカクトGCTCT
36B4	CTTCCCTGCTGAAAGG	CGAAギャガッカッチョッカタータ

表1:qPCR分析に使用されるプライマー配列

Discussion

腱は、メカノイ感受性線維性結合組織である。以前の研究によると、過剰な機械的負荷は腱幹細胞の骨形成分化につながる可能性があり、一方、不十分な負荷は腱分化^中にコラーゲン線維構造の乱れにつながる。

一般的な見解は、理想的なバイオリアクターの鍵は、生体内の細胞が受けるインビトロ細胞微小環境をシミュレートする能力であるということです。したがって、インビボ正常応力環境をインビトロで模倣することは、TDCの単一系統分化を腱細胞に刺激する鍵となる。本プロトコルでは、TDSC構成体の幅は2cmであり、フックの移動範囲は0.12cmであり、これは、歪みは0.12/2(%)であった。結論として、TDcは、本プロトコルにおいて6日間(6%、0.25Hz、8時間、続いて16時間の休息)のバイオリアクターにおいて機械的に刺激された。評価後、このプロトコルで使用される機械的負荷パラメータは、TDCが腱様組織を生成するように誘導することが証明されています。なお、バイオリアクターパラメータは、対応するストレッチングシステムの種類と特異的に一致すべきである。例えば、単層セル伸張の適切なパラメータは、現在の3Dセルシート延伸^2626,2727とは異なる。考えられる理由は、異なる力モード²¹です。2D単層ストレッチシステムでは、細胞は底部の焦点付着によって培養基質に付着し、細胞-細胞接合を介して互いに接続します。しかし、3D細胞シートでは、3Dニッチの結果として形成されるセル-ECM接続も多く、ストレッチに加えて細胞が圧力を受けていることも意味します。

本プロトコルの有効性は、形態学および形質マーカーの発現レベルによって実証された。形態学の点では、組織学とは別に、共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いてコラーゲンIを検出することは、コラーゲン組織を特徴付け、次いでECMアライメントを評価する一般的な方法である。これまでの研究では、TDSC構築物における十分に整列したコラーゲンタイプIバンドル形成を6日間の単軸的な機械的刺激で確認したが^、21をローディングしないものには含まれていない。テノゲンマーカーを使用して、スクレラシス(SCX)、モホーク(MKX)、テノモジュリン(TNMD)、COL1A1を含む腱細胞を同定した。TNMDのみが非転写因子であり、残りは転写因子²⁸である。彼らはすべてよく認識されていました。SCXは胚期²⁹で腱の発達を調節することができ、MKXは出生後ステージ³⁰における腱分化および成熟を調節することができた。また、腱様組織の機械的特性(最大荷重および剛性)は以前の研究でも評価されており、荷重を伴うTDSC構築物の機械的特性は、荷重が²¹に入らないものよりも優れていたことを示した。

培地は細胞の成長および分化に影響を与える可能性がある。本プロトコルでは、細胞シートを適切な方法で形成するために、TDSCを完全培地中の標準的なコーティングされていないプラスチックフラスコで100%合流まで成長させ、次いでTDSCを刺激して、6dに4.4mg/mLアスコルビン酸を加えてECM沈着を促進させた。インスリン様成長因子Iを含むいくつかの成長因子は、血管内皮成長因子、血小板由来成長因子、基礎線維芽細胞成長因子、成長因子の変化、及び成長分化因子5を含む、腱形成および治癒^{31、32、33、3432,33}において重要な役割^を34果たした。³¹さらに、Ni et al.が報告したように刺激培養培地に25ng/mL結合組織成長因子を加えることは、全体の成長および分化プロセス³⁵を加速することができる。

現在、2D細胞シートは、単層細胞とも呼ばれ、機械的調査に使用される最も一般的なシステムです。二軸ストレッチは、単軸ストレッチが長方向の緊張³⁶のみを提供するので、長方向および横方向の両方の多方向張力を提供する。したがって、二軸ストレッチを有する単層細胞培養は、心筋細胞および表皮細胞のようないくつかのタイプの細胞の成長環境を模倣することができる。しかし、3D細胞構造は腱の実際の形状に似ており、単軸ストレッチは2D細胞シートや二軸ストレッチと比較して腱細胞の応力特性に似ています。したがって、3D細胞構築物と単軸ストレッチの組み合わせは、腱とその機械的微小環境をよりよく理解するためにより有能です。これは、TDCの分化を刺激するために3D単軸ストレッチシステムを使用するための理論的根拠を提供します。このように、2D細胞シートは最終的に3D細胞構造に転がり、本プロトコルにおいて単軸ストレッチを受けた。

本プロトコルで使用されるバイオリアクターは、アクチュエータと培養チャンバーから構成された(図4)。本バイオリアクターの詳細は、以前の研究³⁷で入手できます。現在、腱に使用される最も一般的なアクチュエータには、空気圧アクチュエータ、リニアモーター、ステップモーターボールスクリュー^{3838、39、4039,40}が含まれていました。チャンバーは、統合された、分離されたチャンバー^41、42を42含んでいた。その中で、線形モーターを備えた分離されたチャンバーは正確な機械的負荷を提供し、ポータブルで^、43を調整することは容易であった。

TDSCを除いて、他のタイプの幹細胞は、本方法で使用される潜在的な細胞源である可能性がある。以前の研究では、他のタイプの幹細胞が潜在的な治療能力を有し、腱再生を改善する可能性があることを示している。従来の非細胞系管理で治療された負傷した馬腱と比較して、BMSCによって治療された腱の再傷害率は^44,45,45以下であった。さらに、腱障害モデルへのBMCの腱内注入は、腱再生を効果的に誘導する^{可能性がある46.}脂肪由来幹細胞は、馬腱症を効果的に治療し、完全な回復を導き、馬⁴⁷の正常な活動に戻ることができる。一緒に、TDSCを除く幹細胞が腱変性を治療できることを示唆する十分な証拠があった。しかし注意として、負傷した腱へのBMCの移植はウサギモデルにおいて子宮外性骨形成分化を誘導することが示されており、特定の組織由来の幹細胞が起源の組織^の望ましくない細胞に分化する傾向を有する可能性があることを示唆している。これまでの研究では、TDSCに対する負荷奪い治療は^{、骨形成だけでなく21}を引き起こす可能性があり、本方法は他の幹細胞の形新形成を誘発し、特定の負荷体制を有する骨形成を避ける可能性があるという提案につながった。他のタイプの幹細胞に対するこれらの特定の負荷体制を探求するには、さらなる研究が必要です。このシナリオが成立すると、腱障害を治療するためのより多くの細胞源が利用可能になります。

まだ認められる制限があります。まず、非腐食性およびオートクレーブ可能な材料であるが、ステンレス鋼、バイオリアクターシステムの構築に用いられたが、培養条件及び培養培地は依然としてスクリュー及びフックを含むチャンバを腐食させる。したがって、チャンバーの定期的な検査とタイムリーな錆除去が必要です。第2に、現在のバイオリアクターを経済的かつ携帯的なものにするために、環境制御及び中循環システムが存在しない。したがって、オペレータはバイオリアクターを輸送し、3日ごとに媒体交換のためにチャンバーを開く必要があり、汚染のリスクが高まります。オペレータは常にTDSCs環境を無菌に保つために注意を払わなければなりません。

腱障害の治療のためには、非外科的観点から病理学的プロセスを明確にすることが重要である。外科的処置の面では、効果的な方法は、設計された自己移植片を使用することです。TDSCを刺激して生体内での分化を模倣するプロセスは、腱障害の病理学的プロセスの調査に役立つ。設計された足場のない腱組織はラットの膝蓋腱の窓傷害モデルで腱の治癒を促進する機能を有する。また、以前の研究は、機械的負荷が培養腱の機械的特性を改善できることを証明しました。このように、このプロトコルは、TDSCを腱様組織に対して指向的に分化する再現性のある方法を提供し、潜在的に工学的な腱培養に対して簡単かつ実現可能に使用することができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-aldrich	PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS)	Gibcoä by Life Technologies	1908361
Histology processor	Leica	TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)	Gibcoä by Life Technologies	2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell			Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	441244
Streptomycin and penicillin mixture	Gibcoä by Life Technologies	15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System	Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia		Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin	Gibcoä by Life Technologies	1858331