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Medicine

Anwendung eines dreidimensionalen uniaxialen mechanischen Stimulations-Bioreaktorsystems zur Induzieren tenogener Differenzierung von tendonabgeleiteten Stammzellen

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61278
* These authors contributed equally

Summary

Ein dreidimensionales uniaxiales mechanisches Stimulations-Bioreaktorsystem ist ein idealer Bioreaktor für tenogen-spezifische Differenzierung von Sehnenstammzellen und Neotendonbildung.

Abstract

Die Tendinopathie ist eine häufige chronische Sehnenerkrankung im Zusammenhang mit Entzündungen und Degeneration in einem orthopädischen Bereich. Mit hoher Morbidität, begrenzter Selbstreparaturkapazität und vor allem ohne definitive Behandlungen beeinflusst die Tendinopathie die Lebensqualität der Patienten immer noch negativ. Tendon-abgeleitete Stammzellen (TDSCs), als primäre Vorläuferzellen von Sehnenzellen, spielen eine wesentliche Rolle sowohl bei der Entwicklung der Teninopathie als auch bei der funktionellen und strukturellen Wiederherstellung nach der Tendinopathie. Daher wäre eine Methode nützlich, die in vitro die In-vivo-Differenzierung von TDSCs in Sehnenzellen imitieren kann. Hier beschreibt das vorliegende Protokoll eine Methode, die auf einem dreidimensionalen (3D) uniaxialen Dehnsystem basiert, um die TDSCs zu stimulieren, sich in sehnenartige Gewebe zu differenzieren. Es gibt sieben Stadien des vorliegenden Protokolls: Isolierung von Mäuse-TDSCs, Kultur und Ausdehnung von Mäuse-TDSCs, Vorbereitung von Stimulationskulturmedium für die Zellblattbildung, Zellblattbildung durch Kultivierung im Stimulationsmedium, Vorbereitung des 3D-Sehnenstammzellkonstrukts, Montage des uniaxial-dehnenden mechanischen Stimulationskomplexes und Auswertung des mechanisch stimulierten in vitro tendonähnlichen Gewebes. Die Wirksamkeit wurde durch histologische Gezeigt. Das gesamte Verfahren dauert weniger als 3 Wochen. Zur Förderung der extrazellulären Matrixabscheidung wurde 4,4 mg/ml Ascorbinsäure im Stimulationskulturmedium verwendet. Eine getrennte Kammer mit Linearmotor sorgt für eine genaue mechanische Beladung und ist tragbar und leicht einzustellen, was für den Bioreaktor gilt. Das Laderegime im vorliegenden Protokoll betrug 6% Dehnung, 0,25 Hz, 8 h, gefolgt von 16 h Ruhe für 6 Tage. Dieses Protokoll könnte die Zelldifferenzierung in der Sehne imitieren, was für die Untersuchung des pathologischen Prozesses der Teninopathie hilfreich ist. Darüber hinaus wird das sehnenähnliche Gewebe potenziell verwendet, um die Sehnenheilung bei Sehnenverletzungen als technisches autologes Transplantat zu fördern. Zusammenfassend ist das vorliegende Protokoll einfach, wirtschaftlich, reproduzierbar und gültig.

Introduction

Tendinopathie ist eine der häufigsten Sportverletzungen. Es manifestiert sich vor allem durch Schmerzen, lokale Schwellung, verminderte Muskelverspannungen im betroffenen Bereich, und Dysfunktion. Die Inzidenz von Teninopathie ist hoch. Das Vorhandensein von Achillessehnenopathie ist am häufigsten bei Mittel- und Langstreckenläufern (bis zu 29%), während das Vorhandensein von Patellar-Tendinopathie ist auch bei Athleten von Volleyball (45%), Basketball (32%), Leichtathletik (23%), Handball (15%) und Fußball (13%)1,2,3,4,5. Aufgrund der begrenzten Selbstheilungsfähigkeit der Sehne und des Mangels an wirksamen Behandlungen beeinflusst die Tendinopathie jedoch immer noch das Leben der Patienten negativ6,7. Darüber hinaus bleibt die Pathogenese der Tendinopathie unklar. Es gab viele Untersuchungen über seine Pathogenese, vor allem einschließlich "Entzündungstheorie", "Degeneration Theorie", "Überbeanspruchung Theorie", und so weiter8. Derzeit glaubten viele Forscher, dass die Tendinopathie auf die fehlgeschlagene Selbstreparatur der Mikroverletzungen zurückzuführen ist, die durch übermäßige mechanische Belastung verursacht werden, die Sehnenerfahrungen9,10.

Tendon-abgeleitete Stammzellen (TDSCs), als primäre Vorläuferzellen von Sehnenzellen, spielen eine wesentliche Rolle sowohl bei der Entwicklung der Tendinopathie als auch bei der funktionellen und strukturellen Restauration nach der Tendinopathie11,12,13. Es wurde berichtet, dass mechanische Stressstimulation die Proliferation und Differenzierung von Osteozyten, Osteoblasten, glatten Muskelzellen, Fibroblasten, mesenchymalen Stammzellen und anderen kraftempfindlichen Zellen14,15,16,17,18verursachen könnte. Daher können TDSCs als eine der mechanosensitiven und multipotenten Zellen ähnlich stimuliert werden, um durch mechanische Belastung19,20zu differenzieren.

Unterschiedliche mechanische Belastungsparameter (Ladefestigkeit, Ladefrequenz, Ladeart und Ladezeit) können jedoch TDSCs dazu veranlassen, sich in verschiedene Zellen zu differenzieren21. Daher ist ein wirksames und gültiges mechanisches Belastungsregime für die Tenogenese von großer Bedeutung. Darüber hinaus gibt es verschiedene Arten von Bioreaktoren als Stimulationssysteme, die derzeit für die mechanische Beladung von TDSCs verwendet werden. Die Prinzipien jeder Art von Bioreaktor sind unterschiedlich, so dass auch die mechanischen Belastungsparameter, die verschiedenen Bioreaktoren entsprechen, unterschiedlich sind. Daher ist ein einfaches, wirtschaftliches und reproduzierbares Stimulationsprotokoll gefragt, einschließlich der Art des Bioreaktors, des entsprechenden Stimulationsmediums und des mechanischen Belastungsregimes.

Der vorliegende Artikel beschreibt eine Methode, die auf einem dreidimensionalen (3D) uniaxialen Dehnsystem basiert, um die TDSCs zu stimulieren, sich in sehnenartiges Gewebe zu differenzieren. Es gibt sieben Stadien des Protokolls: Isolierung von Mäuse-TDSCs, Kultur und Ausdehnung von Mäuse-TDSCs, Vorbereitung des Stimulationskulturmediums für die Zellblattbildung, Zellblattbildung durch Kultivierung im Stimulationsmedium, Vorbereitung des 3D-Sehnenstammzellkonstrukts, Montage des uniaxial-dehnenden mechanischen Stimulationskomplexes und Auswertung des mechanisch stimulierten in tendonähnlichen Gewebes. Das gesamte Verfahren dauert weniger als 3 Wochen, um das 3D-Zellkonstrukt zu erhalten, das weit kleiner ist als einige bestehende Methoden22,23. Das vorliegende Protokoll ist nachweislich in der Lage, TDSCs dazu zu bringen, sich in Sehnengewebe zu differenzieren, und es ist zuverlässiger als das derzeit häufig verwendete zweidimensionale (2D) Dehnsystem21. Die Wirksamkeit wurde durch histologische Gezeigt. Kurz gesagt, das vorliegende Protokoll ist einfach, wirtschaftlich, reproduzierbar und gültig.

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Protocol

Die beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften der University of Western Australia Animal Ethics Committee genehmigt und durchgeführt.

1. Isolierung von Mäusen TDSCs

  1. Euthanisieren Sie die 6-8 Wochen alten C57BL/6 Mäuse durch Zervixverrenkung.
  2. Patellasehne24 und Achillessehnen25ernten.
  3. Verdauungssehnen von einem mit 6 ml Typ I Kollagenase (3 mg/ml) für 3 h.
    HINWEIS: Da die Größe der Sehne in der Maus klein ist, sollten alle Sehnen, die von einer Maus geerntet werden, in diesem Schritt verwendet werden.
  4. Sammeln Sie die Zellen und die Kultur in vollständig minimal Essential Medium (Alpha-MEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Streptomycin und Penicillin-Mischung für 7 Tage.
  5. Identifizieren Sie TDSCs mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung durch Durchflusszytometrie (Expression von Zelloberflächenmarkern einschließlich CD44, CD90 und Sca-1; Fehlen der Expression von CD34 und CD45).
  6. Durchgangs- und Gefrierzellen (Durchgang 4 Zellen werden für weitere Schritte verwendet).

2. Kultur und Ausbau von Mäuse-TDSCs

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Biosicherheitshaube durch.

  1. Nehmen Sie die aufgewärmten Zellen (Mäuse TDSCs, 1 Million Zellen, Durchgang 4, bis 37 °C).
  2. Fügen Sie langsam zusätzliche 4-5 ml komplettes Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) hinzu.
  3. Das Gemisch mit einer Pipette in ein 15 ml Zentrifugenrohr geben.
  4. Aufladen mit einem Gesamtwert von bis zu 8 ml mit einer Pipette.
    1. Medium in einem 37 °C Ofen-Inkubator vorwärmen.
  5. Das Rohr in Zentrifuge geben und ausgleichen.
  6. Zentrifugen- und Pelletzellen bei 347 x g für 5 min.
  7. Nach der Zentrifuge herausnehmen und das Pellet unten überprüfen.
  8. Dekantieren Sie das Gefriermedium, und setzen Sie Zellen sanft in 1-2 ml des vollständigen Mediums (vermeiden Sie zu viele Blasen).
  9. Übertragen Sie resuspendierte Zellen mit einer Pipette in einen T-75-Kolben.
  10. Verwenden Sie eine Pipette, um dem Kolben ein vollständiges Alpha-MEM Medium hinzuzufügen, um ein Gesamtvolumen von 10 ml mit einer Endkonzentration von 13.000 Zellen/cm2zu erreichen.
  11. Legen Sie den Kolben in den Inkubator und Kultur bei 37 °C mit 5%CO2.
  12. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage.
  13. Beobachten und überwachen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, wenn sie das Medium verändern, bis die Zellen zu 100% Zusammenfluss kultiviert werden (ca. 40.000 Zellen/cm2).

3. Vorbereitung des Stimulationskulturmediums für die Zellblattbildung

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Biosicherheitshaube durch.

  1. 15 ml komplettes Alpha-MEM-Medium in ein 15 ml steriles Rohr gießen.
  2. Fügen Sie 6 l Ascorbinsäure (11 mg/ml) in 15 ml Medium für eine Endkonzentration von 4,4 g/ml hinzu.
    HINWEIS: Zusätzlich kann das Hinzufügen von 25 ng/ml Bindegewebswachstumsfaktor im Stimulationskulturmedium den gesamten Wachstums- und Differenzierungsprozess beschleunigen.
  3. Mischen Sie sanft, indem Sie auf und ab.

4. Zellblattbildung durch Kultivierung im Stimulationsmedium

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Biosicherheitshaube durch.

  1. Entsorgen Sie das normale vollständige Alpha-MEM-Medium sorgfältig, und vermeiden Sie es, die am Boden des Kolbens befestigten Zellen zu berühren.
  2. Fügen Sie 10 ml Stimulationsmedium langsam hinzu und vermeiden Sie Störungen der vollständig konfluenten Zellen.
  3. Kultur die Zellen in Stimulationsmedium für 9 Tage (ändern Sie das Medium alle 3 Tage), um ausreichend das Zellblatt bei 37 °C mit 5%CO2zu erzeugen.
    HINWEIS: Die extrazelluläre Matrix wird dick und wird von der Unterseite des Kolbens aus trüb, wenn sie durch Ascorbinsäure stimuliert wird, was bedeutet, dass das Zellblatt ausreichend erzeugt wird.

5. Vorbereitung des 3D-Sehnenstammzellkonstrukts

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Biosicherheitshaube durch.

  1. Nehmen Sie den Kolben aus dem Brutkasten.
  2. Entsorgen Sie das Stimulationsmedium vollständig.
  3. Waschen Sie das monolayer Zellblatt mit Phosphatpuffer-Saline (PBS), indem Sie den Kolben wirbeln.
  4. Entsorgen Sie die PBS vollständig.
  5. Verwenden Sie eine Pipette, um 1 ml 0,25% Trypsin in die Ecke des Kolbens hinzuzufügen.
  6. Tippen Sie auf die Ecke des Kolbens, um das monolayer Zellblatt zu de-attachisieren, bis sich die Ecke des Zellblatts von der Unterseite des Kolbens befindet.
  7. Fügen Sie sofort 9 ml komplettes Alpha-MEM-Medium hinzu, um die Trypsinisierung zu stoppen.
  8. Den Kolben weiter wirbeln, um das monolayer Zellblatt vollständig abzuziehen.
  9. Gießen Sie das gesamte de-attached Zellblatt in eine Petrischale mit Medium.
  10. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um eine Ecke des Zellblatts aufzunehmen und 15 Mal im Uhrzeigersinn zu drehen.
  11. Nehmen Sie ein anderes Ende des Zellblattes auf und drehen Sie 10 Mal gegen den Uhrzeigersinn, um fest ein sehnenartiges In-vitro-Konstrukt zu erzeugen (Abbildung 1A).

6. Montage des uniaxial-dehnenden mechanischen Stimulationskomplexes in einem einzigartigen Bioreaktor

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Biosicherheitshaube durch.

  1. Schließen Sie die Haken durch den Anschluss an und stellen Sie sich auf den gewünschten Abstand (2 cm) zwischen zwei Haken ein.
  2. Wickeln Sie die 3D-TDSCs an jedem Haken 3 Mal lang auf dem montierten Haken (Abbildung 1B).
  3. Sichern Sie die Haken mit Zellkonstrukt auf die Kammer des Bioreaktors, indem Sie die Schrauben an zwei Enden anziehen.
    HINWEIS: Die gesamte Kammer, einschließlich Schrauben und Haken, ist steril (Autoklav für 1,5 h bei 134 °C und UV-Strahlen für 24 Stunden vor Gebrauch belichten). Für den Metallhalter von Kammern, UV-Licht für 48 Stunden vor Gebrauch belichten.
  4. Füllen Sie die Kammer mit komplettem Alpha-MEM-Medium.
  5. Verbinden Sie den Aktuator über Kabel mit der Kulturkammer.
  6. Schneiden Sie die Haken Connecter durch sterile Schere.
  7. Schalten Sie die Stromversorgung und den entsprechenden Kanalregler ein, um die mechanische Stimulation zu starten.
  8. Legen Sie den Deckel auf die Kammer.
  9. Überprüfen Sie die Kontrollleuchten und stellen Sie sicher, dass der Bioreaktor ordnungsgemäß funktionieren kann.
  10. Legen Sie den Bioreaktor in den Inkubator und unterziehen Sie das 3D-Zellkonstrukt 6 Tage lang einer mechanischen Dehnung (6% Dehnung, 0,25 Hz, 8 h, gefolgt von 16 h Pause).

7. Bewertung des mechanisch stimulierten In-vitro-Sehnengewebes

  1. Lösen Sie die Schrauben mit einem Schraubendreher und nehmen Sie die Montage vorsichtig ab.
  2. Setzen Sie das sehnenartige Gewebe in 4% Paraformaldehyd zur Fixierung für 15 min.
  3. Legen Sie das fixierte sehnenartige Gewebe in eine Biopsiekassette mit Biopsieschaumpads.
  4. Verfahren zur Dehydrierung der Probe und schließlich Zur Bewertung durch h&E histologische Färbung.
  5. Wiederholen Sie das gesamte Protokoll und extrahieren Sie RNA aus dem sehnenähnlichen Gewebe, um die Expression tenogener Marker durch quantitative PCR (qPCR) zu bewerten. Primer für die ausgewählten Gene sind in Tabelle 1aufgeführt.
    HINWEIS: Histology-Protokoll und qPCR-Protokoll sind Standard und folgen einer früheren Studie21.

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Representative Results

Vor der mechanischen Stimulation wurden TDSCs in vollständigem Medium auf 100 % Zusammenfluss angewachsen und zeigten eine unorganisierte ultrastrukturelle Morphologie (Abbildung 2A). Nach 6 Tagen uniaxialer Dehnung waren mechanische Belastung, extrazelluläre Matrix (ECM) und Zellausrichtungen gut ausgerichtet (Abbildung 2B). Die Zellen waren gut bestückt und nach mechanischer Beladung gut in ECM eingehüllt. Die Zellmorphologie wurde als länsiert dargestellt und ähnelte eher der normalen Sehnenzelle im Vergleich zu der ohne Dehnung(Abbildung 2C). Die Zelldichte im Zellkonstrukt mit Belastung war höher als im ohne Belastung. QPCR-Ergebnisse zeigten, dass die vorliegende Methode die Expression der tenogenen Marker einschließlich Skleraxis, Mohawk, Tenomodulin und COL1A1 (Abbildung 3) im Vergleich zu denen erhöhte, die durch statische Kultur behandelt wurden.

Figure 1
Abbildung 1: Montage des dreidimensionalen (3D) Zellkonstrukts über die Haken des Bioreaktors. (A) Allgemeine Ansicht des 3D-Zellenkonstrukts über den Haken. (B) Das Diagramm zum Zusammenbauen des 3D-Zellenkonstrukts über den Haken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Zellmorphologie vor und nach der mechanischen Stimulation. (A) Tendon-abgeleitete Stammzellen wurden in vollständigem Medium zu 100% Zusammenfluss angebaut und zeigten eine unorganisierte ultrastrukturelle Morphologie vor mechanischer Stimulation. (B) Histologische Bilder zeigten h&E-Färbung des Zellkonstrukts nach mechanischer Stimulation. (C) Histologische Bilder zeigten die H&E-Färbung eines Kontrollzellenkonstrukts, das im Bioreaktor für 6 Tage ohne mechanische Stimulation kultiviert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Expressionsgehalt von Tenogenesemarkern. Die einzelnen Genexpressionsniveaus wurden zunächst gegen die interne Kontrolle, 36B4, normalisiert und dann gegen Genexpressionsniveaus aus statischen Kulturen normalisiert. Gezeigt werden Ergebnisse aus 3 Experimenten. Die für die qPCR-Analyse verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle 1aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Das dreidimensionale uniaxiale mechanische Stimulations-Bioreaktorsystem. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Gen Primer-Sequenz
Vorwärts 5'->3' Rückwärts 5'->3'
COL1A1 TGACTGGAAGAGCGGAGAGT GTTCGGGCTGATGTACCAGT
Scleraxis CCCAAACAGCTGCACCTT GGCTCTCTGTGACTCTTCAG
Mohawk GTCCGGCAGCCAGATTTAAG TCGCTGAGCTTTCCCCTTTA
Tenomodulin CCGCAGAAAAGCCTATTGAA GACCACCCATTGCTCTTCT
36B4 CTTCCCACTTGCTGAAAAGG CGAAGAGACCGAATCCCATA

Tabelle 1: Primersequenzen für die qPCR-Analyse

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Discussion

Die Sehne ist ein mechanosensitives faseriges Bindegewebe. Früheren Untersuchungen zufolge könnte eine übermäßige mechanische Belastung zu einer osteogenen Differenzierung von Sehnenstammzellen führen, während eine unzureichende Belastung zu einer gestörten Kollagenfaserstruktur während der Sehnendifferenzierung führen würde21.

Eine allgemeine Ansicht ist, dass der Schlüssel zu einem idealen Bioreaktor die Fähigkeit ist, die in vitro zelluläre Mikroumgebung zu simulieren, der Zellen in vivo durchmachen. Daher ist die Nachahmung der in vivo normalen Stressumgebung in vitro der Schlüssel zur Stimulierung der einzeiligen Differenzierung von TDSCs in Sehnenzellen. Im vorliegenden Protokoll betrug die Breite des TDSC-Konstrukts 2 cm, und der Bewegungsbereich des Hakens betrug 0,12 cm, was bedeutet, dass die Dehnung 0,12/2 (%) betrug. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass TDSCs in einem Bioreaktor für 6 Tage (6%, 0,25 Hz, 8 h, gefolgt von 16 h Ruhe) im vorliegenden Protokoll mechanisch stimuliert wurden. Nach der Auswertung haben sich die in diesem Protokoll verwendeten mechanischen Belastungsparameter als TDSCs erwiesen, um sehnenartiges Gewebe zu erzeugen. Es sei darauf hingewiesen, dass die Parameter des Bioreaktors speziell mit dem entsprechenden Dehnsystem entsprechen sollten. Beispielsweise unterscheiden sich die richtigen Parameter für die einschichtige Zelldehnung von der aktuellen 3D-Zellplatte, die26,27. Ein möglicher Grund sind die verschiedenen Kraftmodi21. Im 2D-Monolayer-Stretching-System heften sich Zellen durch fokale Adhäsionen am Boden an das Kultursubstrat an und verbinden sich über Zell-Zell-Knoten miteinander. In einem 3D-Zellblatt gibt es jedoch auch viel mehr Zell-ECM-Verbindungen, die durch die 3D-Nische gebildet werden, was bedeutet, dass die Zellen neben der Dehnung unter Druck stehen.

Die Wirksamkeit des vorliegenden Protokolls wurde durch die Morphologie und die Expressionsstufe tenogener Marker nachgewiesen. In Bezug auf die Morphologie ist die Verwendung der konfokalen Immunfluoreszenzmikroskopie zum Nachweis von Kollagen I eine gängige Möglichkeit, die Kollagenorganisation zu charakterisieren und dann die ECM-Ausrichtung zu bewerten. Vorherige Studie bestätigte die gut ausgerichtete KollagenTyp I Bündelbildung im TDSC-Konstrukt mit 6% uniaxialer mechanischer Stimulation für 6 Tage, aber nicht in der ohne Belastung21. Tenogene Marker wurden verwendet, um Sehnenzellen zu identifizieren, einschließlich Skleraxis (SCX), Mohawk (MKX), Tenomodulin (TNMD) und COL1A1. Nur TNMD war ein Nicht-Transkriptionsfaktor, und der Rest von ihnen sind Transkriptionsfaktoren28. Sie waren alle gut anerkannt. SCX könnte die Sehnenentwicklung im embryonalen Stadium29regulieren, während MKX die Sehnendifferenzierung und Reifung im postnatalen Stadium30regulieren könnte. Darüber hinaus wurden auch die mechanischen Eigenschaften (max. Belastung und Steifigkeit) des sehnenähnlichen Gewebes in früheren Studien bewertet, und es zeigte, dass die mechanischen Eigenschaften des TDSC-Konstrukts mit Belastung besser waren als im ohne Belastung21.

Das Medium kann das Zellwachstum und die Differenzierung beeinflussen. Im vorliegenden Protokoll wurden TDSCs, um das Zellblatt richtig zu bilden, in Standard-Unbeschichteten Kunststoffflaschen in vollständigem Medium auf 100 % Zusammenfluss angebaut, und dann wurden TDSCs angeregt, die ECM-Abscheidung durch Zugabe von 4,4 mg/ml Ascorbinsäure für 6 d zu fördern. Mehrere Wachstumsfaktoren, darunter Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor I, vaskulärer endothelialen Wachstumsfaktor, Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor, grundlegender Fibroblasten-Wachstumsfaktor, transformierender Wachstumsfaktor und Wachstumsdifferenzierungsfaktor 5, spielten eine wichtige Rolle bei der Sehnenbildung und Heilung31,32,33,34. Zusätzlich durch Zugabe von 25 ng/mL Bindegegegrowthfaktor in Stimulationskultur Medium, wie Ni et al. berichtet könnte den gesamten Wachstums- und Differenzierungsprozess beschleunigen35.

Derzeit ist das 2D-Zellblatt, auch als monolagierte Zelle bekannt, das am häufigsten verwendete System für mechanische Untersuchungen. Die biaxiale Dehnung sorgt für eine multidirektionale Spannung, sowohl längs als auch seitlich, da die uniaxiale Dehnung nur Längsspannung36bietet. So könnte monolayer Zellkultur mit biaxialer Dehnung die Wachstumsumgebung einiger Zelltypen nachahmen, wie Kardiomyozyten und epidermale Zellen. Das 3D-Zellkonstrukt ähnelt jedoch eher der realen Form einer Sehne, und die uniaxiale Dehnung ähnelt eher den Spannungseigenschaften von Sehnenzellen, verglichen mit 2D-Zellblech und biaxialer Dehnung. So ist die Kombination des 3D-Zellkonstrukts mit der uniaxialen Dehnung für ein besseres Verständnis der Sehne und ihrer mechanischen Mikroumgebung kompetenter. Dies bietet eine theoretische Grundlage für die Verwendung eines 3D-Uniaxial-Dehnsystems zur Stimulierung der Differenzierung von TDSCs. So wurde das 2D-Zellblech schließlich in ein 3D-Zellkonstrukt gerollt und im vorliegenden Protokoll einer uniaxialen Dehnung unterzogen.

Der im vorliegenden Protokoll verwendete Bioreaktor bestand aus Aktor und Kulturkammer (Abbildung 4). Die Einzelheiten des vorliegenden Bioreaktors sind in einer früheren Studie37verfügbar. Derzeit waren die gängigsten Aktuatoren für Sehnen pneumatische Aktuatoren, Linearmotoren und Step-Motorballschrauben38,39,40. Kammern enthalten integrierte und getrennte Kammern41,42. Darunter sorgte eine getrennte Kammer mit Linearmotor für eine genaue mechanische Beladung und war tragbar und leicht einzustellen43.

Außer TDSCs können andere Arten von Stammzellen eine potenzielle Zellquelle sein, die in dieser Methode verwendet werden kann. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass andere Arten von Stammzellen potenzielle therapeutische Fähigkeiten haben und die Sehnenregeneration verbessern könnten. Im Vergleich zu verletzten Pferdesehnen, die mit konventionellem nichtzellulärem Management behandelt wurden, war die Wiederverletzungsrate der von BMSCs behandelten Sehnen niedriger44,45. Darüber hinaus könnte die intratende Injektion von BMSCs in ein Teninopathie-Modell effektiv die Sehnenregeneration induzieren46. Adipose abgeleitete Stammzellen könnten Pferde-Tendinopathien effektiv behandeln, was zu einer vollständigen Genesung und Rückkehr zur normalen Aktivität bei Pferdenführt 47. Zusammen gab es genügend Hinweise darauf, dass Stammzellen, mit Ausnahme von TDSCs, die Sehnendegeneration behandeln könnten. Als Vorsichtsmaßnahme hat sich jedoch gezeigt, dass die Transplantation von BMSCs in verletzte Sehnen eine ektopische osteogene Differenzierung in einem Kaninchenmodell induziert, was darauf hindeutet, dass Stammzellen aus einem bestimmten Gewebe eine Tendenz haben könnten, sich in unerwünschte Zellen ihres Ursprungsgewebes zu differenzieren48. In früheren Forschungsarbeiten konnte die Belastung seinhaltter Behandlung von TDSCs ebenfalls zu Osteogenese führen21, was zu dem Vorschlag führte, dass die vorliegende Methode das Potenzial hat, die Tenogenese anderer Stammzellen zu induzieren und Osteogenese mit einem spezifischen Belastungsregime zu vermeiden. Weitere Forschung ist notwendig, um diese spezifischen Belastungsregime für andere Arten von Stammzellen zu untersuchen. Wenn dieses Szenario zutrifft, wird mehr Zellquelle zur Behandlung von Teninopathie zur Verfügung stehen.

Es gibt noch einige Einschränkungen, die anerkannt werden müssen. Erstens, obwohl ein nicht korrosives und autoklavierbares Material, Edelstahl, verwendet wurde, um das Bioreaktorsystem zu bauen, korrodieren die Kultivierungsbedingungen und das Kulturmedium immer noch die Kammer einschließlich der Schraube und des Hakens. Daher sind eine routinemäßige Inspektion der Kammer und eine rechtzeitige Rostentfernung erforderlich. Zweitens, um den gegenwärtigen Bioreaktor wirtschaftlich und tragbar zu machen, gibt es keine Umweltkontrolle und kein mittleres Zirkulationssystem. So muss der Bediener den Bioreaktor transportieren und die Kammer alle 3 Tage für den mittleren Austausch öffnen, was das Kontaminationsrisiko erhöht. Der Bediener muss immer darauf achten, dass die TDSCs-Umgebung steril bleibt.

Für die Behandlung der Tendinopathie ist es wichtig, den pathologischen Prozess aus nicht-chirurgischer Sicht zu klären. In Bezug auf die chirurgische Behandlung ist eine effektive Methode, technische autologe Transplantate zu verwenden. Der Prozess der Stimulierung von TDSCs zur Nachahmung der Differenzierung in vivo ist hilfreich für die Untersuchung des pathologischen Prozesses der Tendinopathie. Das konstruierte gerüstfreie Sehnengewebe hat die Fähigkeit, die Sehnenheilung in einem Rattenpatelsehnen-Verletzungsmodell zu fördern. Außerdem haben frühere Arbeiten bewiesen, dass die mechanische Belastung die mechanischen Eigenschaften der kultivierten Sehne verbessern kann. Somit bietet dieses Protokoll eine reproduzierbare Methode zur gezielten Differenzierung von TDSCs in sehnenartiges Gewebe, so dass es einfach und machbar für eine potentielle Sehnenkultur verwendet werden kann.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Forschung wurde durchgeführt, während der Autor "ein University of Western Australia International Fee Scholarship und einen University Postgraduate Award an der University of Western Australia" erhielt. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81802214) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Medizin Ausgabe 162 Mechanische Belastung Sehnenstammzelle Tendinopathie Bioreaktor Differenzierung Sehne Stammzelle
Anwendung eines dreidimensionalen uniaxialen mechanischen Stimulations-Bioreaktorsystems zur Induzieren tenogener Differenzierung von tendonabgeleiteten Stammzellen
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Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen,More

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).

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