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Applicazione di un sistema di bioreattore tridimensionale di stimolazione meccanica uniassiale per indurre la differenziazione tenogena delle cellule staminali derivate da Tendon

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61278
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia
* These authors contributed equally

Summary

Un sistema di bioreattore di stimolazione meccanica uniassiale tridimensionale è un bioreattore ideale per la differenziazione tenogenica-specifica delle cellule staminali derivate dal tendine e della formazione neo-tendina.

Abstract

La tendinopatia è una comune malattia cronica del tendine a cui si tratta di infiammazione e degenerazione in un'area ortopedica. Con un'elevata morbilità, una limitata capacità di auto-riparazione e, soprattutto, senza trattamenti definitivi, la tendinopatia influenza ancora negativamente la qualità della vita dei pazienti. Le cellule staminali derivate dal tendone (TDSC), come cellule precursori primarie delle cellule tendisuotiche, svolgono un ruolo essenziale sia nello sviluppo della tendinopatia, sia nel ripristino funzionale e strutturale dopo la tendinopatia. Pertanto, sarebbe utile un metodo che può in vitro imitare la differenziazione in vivo dei TDSC nelle cellule tendinee. Qui, il presente protocollo descrive un metodo basato su un sistema di stretching uniaxial tridimensionale (3D) per stimolare i TDSC a differenziarsi in tessuti simili a quelli tendoni. Ci sono sette stadi del protocollo attuale: isolamento dei topi TDSC, coltura ed espansione dei topi TDSC, preparazione del mezzo di coltura della stimolazione per la formazione di lamiere cellulari, formazione di lamiere cellulari mediante stimolazione in media, preparazione del costrutto di cellule staminali del tendine 3D, assemblaggio del complesso di stimolazione meccanica che si estende uniaxial e valutazione del tessuto tendineo stimolato meccanicamente stimolato in vitro. L'efficacia è stata dimostrata dall'istologia. L'intera procedura richiede meno di 3 settimane. Per promuovere la deposizione di matrici extracellulari, è stato utilizzato 4,4 mg/mL di acido ascorbico nel mezzo di coltura della stimolazione. Una camera separata con un motore lineare fornisce un carico meccanico accurato ed è portatile e facilmente regolabile, che viene applicato per il bioreattore. Il regime di carico nel protocollo attuale era di 4%, 0,25 Hz, 8 h, seguito da 16 h resto per 6 giorni. Questo protocollo potrebbe imitare la differenziazione cellulare nel tendine, che è utile per lo studio del processo patologico di tendinopatia. Inoltre, il tessuto tendineo è potenzialmente utilizzato per promuovere la guarigione del tendine in lesioni tendinee come un innesto autologo ingegnerizzato. Per riassumere, l'attuale protocollo è semplice, economico, riproducibile e valido.

Introduction

La tendinopatia è una delle lesioni sportive comuni. Si manifesta principalmente da dolore, gonfiore locale, diminuzione della tensione muscolare nella zona interessata, e disfunzione. L'incidenza della tendinopatia è elevata. La presenza di achille tendinopatia è più comune per i corridori di media e lunga distanza (fino al 29%), mentre la presenza di tendinopatia rotutare è anche alta negli atleti di pallavolo (45%), basket (32%), atletica leggera (23%), pallamano (15%) e calcio (13%)1 ,2,,,3,4. Tuttavia, a causa della limitata capacità di autoguarigione del tendine e della mancanza di trattamenti efficaci, la tendinopatia influenza ancora negativamente la vita dei pazienti6,7. Inoltre, la patogenesi della tendinopatia rimane poco chiara. Ci sono state molte indagini sulla sua patogenesi, principalmente tra cui "teoria dell'infiammazione", "teoria della degenerazione", "teoria dell'uso eccessivo", e così via8. Attualmente, molti ricercatori credevano che la tendinopatia fosse dovuta al fallimento dell'autoriparazione ai microlesioni causati da un carico meccanico eccessivo delle esperienze tendineee9,10.

Le cellule staminali derivate dal tendone (TDSC), come cellule precursori primarie delle cellule tendiche, svolgono un ruolo essenziale nello sviluppo della tendinopatia e del ripristino funzionale e strutturale dopo la tendinopatia11,12,13. È stato riferito che la stimolazione meccanica dello stress potrebbe causare la proliferazione e la differenziazione di osteociti, osteoblasti, cellule muscolari lisce, fibroblasti, cellule staminali mesenchymal e altre cellule sensibili alla forza14,15,1616,17,18. Pertanto, i TDSC, come una delle cellule meccanosensibili e multipotenti, possono essere stimolati a differenziarsi con il caricamento meccanico19,20.

Tuttavia, diversi parametri di caricamento meccanico (forza di caricamento, frequenza di caricamento, tipo di caricamento e periodo di caricamento) possono indurre i TDSC a differenziarsi in diverse celle21. Pertanto, un regime di carico meccanico efficace e valido è molto significativo per la tenogenesi. Inoltre, esistono diversi tipi di bioreattori come sistemi di stimolazione attualmente utilizzati per fornire carico meccanico ai TDSC. I principi di ogni tipo di bioreattore sono diversi, quindi anche i parametri di caricamento meccanico corrispondenti ai diversi bioreattori sono diversi. Pertanto, è richiesto un protocollo di stimolazione semplice, economico e riproducibile, che include il tipo di bioreattore, il mezzo di stimolazione corrispondente e il regime di carico meccanico.

Il presente articolo descrive un metodo basato su un sistema di stretching uniassiale tridimensionale (3D) per stimolare i TDSC a differenziarsi in tessuto tendineo. Ci sono sette fasi del protocollo: isolamento dei topi TDSC, coltura ed espansione dei topi TDSC, preparazione del mezzo di coltura di stimolazione per la formazione di lamiere cellulari, formazione di lamiere cellulari mediante coltura nel mezzo di stimolazione, preparazione del costrutto di cellule staminali 3D, assemblaggio del complesso di stimolazione meccanica allungamento uniaxiale e valutazione del tessuto tendineo stimolato meccanicamente stimolato in vitro. L'intera procedura richiede meno di 3 settimane per ottenere il costrutto di cella 3D, che è molto meno di alcuni metodi esistenti22,23. Il presente protocollo ha dimostrato di essere in grado di indurre i TDSC a differenziarsi in tessuto tendineo, ed è più affidabile dell'attuale sistema di stretching bidimensionale (2D) comunemente usato21. L'efficacia è stata dimostrata dall'istologia. In breve, il presente protocollo è semplice, economico, riproducibile e valido.

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Protocol

I metodi descritti sono stati approvati ed eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti del Comitato Etico Animale dell'Università dell'Australia Occidentale.

1. Isolamento dei topi TDSC

  1. Eutanasia i topi C57BL/6 di 6-8 settimane da lussazione cervicale.
  2. Tendini rotulare di raccolta24 e tendini di Achille25.
  3. Tendini digerivi da uno con 6 mL di collagenasi di tipo I (3 mg/mL) per 3 h.
    NOTA: Poiché la dimensione del tendine nel mouse è piccola, tutti i tendini raccolti da un topo devono essere utilizzati in questo passaggio.
  4. Raccogliere le cellule e la coltura in minimal Essential Medium (Alpha-MEM) contenente il 10% del siero bovino fetale (FBS) e l'1% della miscela di streptomicina e penicillina per 7 giorni.
  5. Identificare i TDSC utilizzando l'ordinamento delle celle attivate dalla fluorescenza per citometria di flusso (espressione di marcatori di superficie cellulare tra cui CD44, CD90 e Sca-1; mancanza dell'espressione di CD34 e CD45).
  6. Passaggio e congelamento delle celle (passaggio 4 celle saranno utilizzati per ulteriori passi).

2. Cultura ed espansione dei topi TDSC

NOTA: Condurre tutti i passaggi in un cappuccio sterile per la biosicurezza.

  1. Prendere le cellule riscaldate (topi TDSC, 1 milione di cellule, passaggio 4, a 37 gradi centigradi).
  2. Aggiungere lentamente 4-5 mL di minimo minimo medio essenziale completo (Alpha-MEM).
  3. Trasferire la miscela in un tubo di centrifuga di 15 mL con una pipetta.
  4. Ricaricare con un totale medio-alto 8 mL con una pipetta.
    1. Mezzo preriscaldato in un'incubatrice da forno a 37 gradi centigradi.
  5. Collocare il tubo in centrifuga ed equilibrio.
  6. Centrifuga e pellet a 347 x g per 5 min.
  7. Estrarre dopo la centrifuga e controllare il pellet nella parte inferiore.
  8. Decant il mezzo di congelamento, e resospendere le cellule delicatamente in 1-2 mL di mezzo completo (evitare di fare troppe bolle).
  9. Trasferire le cellule risospese su un flacone T-75 da una pipetta.
  10. Utilizzare una pipetta per aggiungere alfa-MEM mezzo completo al pallone per raggiungere un volume totale di 10 mL con concentrazione finale di 13.000 cellule/cm2.
  11. Collocare il flacone nell'incubatrice e nella coltura a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
  12. Cambiare il mezzo ogni 3 giorni.
  13. Osservare e monitorare le cellule al microscopio quando si cambia il mezzo fino a quando le cellule vengono coltivate al 100% di confluenza (circa 40.000 cellule/cm2).

3. Preparazione del mezzo di coltura di stimolazione per la formazione di fogli cellulari

NOTA: Condurre tutti i passaggi in un cappuccio sterile per la biosicurezza.

  1. Versare 15 mL di mezzo Alpha-MEM completo in un tubo sterile da 15 mL.
  2. Aggiungere 6 ldi di acido ascorbico (11 mg/mL) in 15 mL di mezzo per una concentrazione finale di 4,4 g/mL.
    NOTA: Inoltre l'aggiunta di 25 fattore di crescita del tessuto connettivo ng/mL nel mezzo di stimolazione della coltura può accelerare l'intero processo di crescita e differenziazione.
  3. Mescolare delicatamente invertendo su e giù.

4. Formazione di fogli cellulari mediante coltura nel mezzo di stimolazione

NOTA: Condurre tutti i passaggi in un cappuccio sterile per la biosicurezza.

  1. Eliminare con attenzione il normale mezzo alfa-MEM completo ed evitare di toccare le cellule attaccate alla parte inferiore del pallone.
  2. Aggiungere 10 mL di mezzo di stimolazione lentamente ed evitare di causare qualsiasi disturbo alle cellule completamente confluenti.
  3. Cultura le cellule in mezzo di stimolazione per 9 giorni (cambiare il mezzo ogni 3 giorni) per generare sufficientemente il foglio cellulare a 37 sC con 5% CO2.
    NOTA: La matrice extracellulare diventerà spessa e presente per essere torbida se osservata dal fondo del pallone dopo essere stimolata dall'acido ascorbico, il che significa che il foglio cellulare è sufficientemente generato.

5. Preparazione del costrutto di cellule staminali del tendine 3D

NOTA: Condurre tutti i passaggi in un cappuccio sterile per la biosicurezza.

  1. Togliere la fiaschetta dall'incubatrice.
  2. Scartare completamente il mezzo di stimolazione.
  3. Lavare il foglio cellulare monostrato con il buffer salina fosfato (PBS) ruotando il pallone.
  4. Eliminare completamente il PBS.
  5. Utilizzare una pipetta per aggiungere 1 mL di 0,25% di prova nell'angolo del pallone.
  6. Tocca l'angolo del pallone per defissare il foglio cellulare del monostrato finché l'angolo del foglio cellulare non si trova fuori dalla parte inferiore del pallone.
  7. Aggiungere immediatamente 9 mL di mezzo Alpha-MEM completo per arrestare la ritentatizzazione.
  8. Continuare a turbinare il pallone per staccare completamente il foglio cellulare monostrato.
  9. Versare il foglio di cellule totale disattaccato in un piatto Petri con mezzo.
  10. Utilizzare una pinzetta sterile per raccogliere un angolo del foglio cellulare e ruotare in senso orario per 15 volte.
  11. Raccogliere un'altra estremità del foglio cellulare e ruotare in senso antiorario per 10 volte per generare saldamente un costrutto in vitro simile a un tendine (Figura 1A).

6. Assemblaggio del complesso di stimolazione meccanica che si estende in un unico bioreattore progettato

NOTA: Condurre tutti i passaggi in un cappuccio sterile per la biosicurezza.

  1. Collegare i ganci dal collegatore e regolare alla distanza desiderata (2 cm) tra due ganci.
  2. Avvolgere delicatamente il costrutto TDSCs 3D sul gancio assemblato per 3 volte su ogni gancio (Figura 1B).
  3. Fissare i ganci con il costrutto cellulare sulla camera del bioreattore stringendo le viti su due estremità.
    NOTA: L'intera camera, comprese le viti e i ganci, è sterile (autoclave per 1,5 h a 134 gradi centigradi e i raggi ultravioletti (UV) espongono per 24 ore prima dell'uso). Per il supporto metallico delle camere, la luce UV espongono per 48 ore prima dell'uso.
  4. Riempi la camera con un supporto Alpha-MEM completo.
  5. Collegare l'attuatore alla camera di coltura via cavo.
  6. Tagliare il collegatore ganci da forbici sterili.
  7. Accendere l'alimentazione e il controller di canale corrispondente per avviare la stimolazione meccanica.
  8. Metti il coperchio sulla camera.
  9. Controllare le luci dell'indicatore e assicurarsi che il bioreattore possa funzionare correttamente.
  10. Mettere il bioreattore nell'incubatrice e sottoporre il costrutto di cellule 3D allo stretching meccanico per 6 giorni (6% stretching, 0,25 Hz, 8 h, seguito da 16 h di riposo).

7. Valutazione del tessuto meccanico stimolato in vitro simile a un tendine

  1. Allentare le viti con un cacciavite e togliere l'assemblaggio con attenzione.
  2. Mettere il tessuto tendineo-come in 4% paraformaldeide per la fissazione per 15 min.
  3. Collocare il tessuto tipo tendineo fisso in una cassetta di biopsia con cuscinetti di schiuma biopsia.
  4. Processo per disidratare il campione e infine valutare con colorazione istologica H&E.
  5. Ripetere l'intero protocollo ed estrarre l'RNA dal tessuto tendineo per valutare l'espressione dei marcatori tenogenici mediante PCR quantitativo (qPCR). I Primer per i geni selezionati sono elencati nella Tabella 1.
    NOTA: il protocollo di istologia e il protocollo qPCR sono standard e seguono uno studio precedente21.

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Representative Results

Prima della stimolazione meccanica, i TDSC erano cresciuti al 100% di confluenza in mezzo completo e mostravano una morfologia ultrastrutturale disorganizzata (Figura 2A). Dopo 6 giorni di carico meccanico di stretching uniassiale, matrice extracellulare (ECM) e allineamenti cellulari erano ben orientati (Figura 2B). Le celle erano ben popolate e ben avvolte in ECM dopo il caricamento meccanico. La morfologia cellulare è stata presentata per essere allungata ed era più simile alla normale cellula tendina rispetto a quella senza stretching (Figura 2C). La densità cellulare nel costrutto cellulare con carico era superiore a quella di quella senza carico. I risultati di QPCR hanno mostrato che l'attuale metodo ha aumentato l'espressione dei marcatori tenogenici, tra cui Scleraxis, Mohawk, Tenomodulin e COL1A1 (Figura 3) rispetto a quelli trattati dalla coltura statica.

Figure 1
Figura 1: Assemblaggio del costrutto cellulare tridimensionale (3D) sopra i ganci del bioreattore. (A) Vista generale del costrutto di cellule 3D sopra i ganci. (B) Il diagramma per assemblare il costrutto di cellule 3D sopra gli ganci. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: morfologia cellulare prima e dopo la stimolazione meccanica. (A) Le cellule staminali derivate dal Tendon sono state coltivate al 100% di confluenza in mezzo completo e hanno mostrato una morfologia ultrastrutturale disorganizzata prima della stimolazione meccanica. (B) Le immagini istologiche mostravano una colorazione H&E del costrutto cellulare dopo la stimolazione meccanica. (C) Le immagini istologiche hanno mostrato la colorazione H&E di un costrutto a cellule di controllo coltivato in bioreattore per 6 giorni senza stimolazione meccanica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Livello di espressione dei marcatori di tenogenesi. I singoli livelli di espressione genica sono stati prima normalizzati rispetto al controllo interno, 36B4, e poi normalizzati rispetto ai livelli di espressione genica delle culture statiche. Vengono mostrati i risultati di 3 esperimenti. Le sequenze di primer utilizzate per l'analisi qPCR sono riportate nella tabella 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Il sistema bioreattore tridimensionale di stimolazione meccanica uniassiale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gene Sequenza primer
Avanti 5'->3' Inverti 5'->3'
COL1A1 TGACTGGAGAGAGGAGAGT GTTCGGGCTGATTACCAGT
Scleraxis CCCAAACAGATCTCTCTCTCT GGCTCTCTGTGACTCTTCAG
Mohawk GTCCGGCAGCCAGATATAG TCGCTGAGCTCTCCCTTTA
Tenomodulina CCGCAGAAAAGCCTATTGAA GACCACCCATTGCTCT
36B4 CTTCCCACTTGCTGAAAAGG CGAAGAGACCGAATCCCATA

Tabella 1: Sequenze di primer utilizzate per l'analisi qPCR

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Discussion

Il tendine è un tessuto connettivo fibroso meccanosensibile. Secondo precedenti ricerche, l'eccesso di carico meccanico potrebbe portare a differenziazione osteogenica delle cellule staminali del tendine, mentre un carico insufficiente porterebbe a una struttura disordinata della fibra di collagene durante la differenziazione del tendine21.

Una visione comune è che la chiave per un bioreattore ideale è la capacità di simulare il microambiente cellulare in vitro a cui subiscono le cellule in vivo. Pertanto, imitare l'ambiente di stress normale in vivo in vitro è la chiave per stimolare la differenziazione single-lineage dei TDSC nelle cellule tendinee. Nel protocollo attuale, la larghezza del costrutto TDSC era di 2 cm, e la gamma di movimento del gancio era di 0,12 cm, il che significa che la deformazione era di 0,12/2 (%). In conclusione, i TDSC sono stati stimolati meccanicamente in un bioreattore per 6 giorni (6%, 0,25 Hz, 8 h, seguiti da 16 h di riposo) nel presente protocollo. Dopo la valutazione, i parametri di caricamento meccanico utilizzati in questo protocollo hanno dimostrato di indurre i TDSC a generare tessuti simili a quelli dei tendini. Va notato che i parametri del bioreattore dovrebbero corrispondere specificamente al tipo corrispondente di sistema di stretching. Ad esempio, i parametri appropriati per l'allungamento delle celle con livello monolivello sono diversi dall'attuale foglio di celle 3D che si estendesu 26,27. Una possibile ragione è la diversa forza modalità21. Nel sistema di allungamento del monostrato 2D, le cellule si attaccano al substrato di coltura mediante aderenti focali nella parte inferiore e si connettono tra loro tramite giunzioni cellula-cellula. Tuttavia, in un foglio di cellule 3D, ci sono anche molte altre connessioni cella-ECM formate come risultato della nicchia 3D, il che significa che le celle sono sotto pressione oltre allo stretching.

L'efficacia del protocollo attuale è stata dimostrata dalla morfologia e dal livello di espressione dei marcatori tenogenici. In termini di morfologia, a parte l'istologia, l'uso della microscopia immunofluorescenza confocale per rilevare il collagene I è un modo comune per caratterizzare l'organizzazione del collagene e quindi valutare l'allineamento ECM. Uno studio precedente ha confermato la formazione di fascio di collagene ben allineato di tipo I nel costrutto TDSC con 6% stimolazione meccanica uniassiale per 6 giorni, ma non in quello senza carico21. Sono stati utilizzati marcatori tenogenici per identificare le cellule del tendine, tra cui Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX), Tenomodulin (TNMD) e COL1A1. Solo il TNMD era un fattore di non trascrizione, e il resto di loro sono fattori di trascrizione28. Erano tutti ben riconosciuti. SCX potrebbe regolare lo sviluppo del tendine nello stadio embrionale29, mentre l'MKX potrebbe regolare la differenziazione e la maturazione del tendine nello stadio postnatale30. Inoltre, le proprietà meccaniche (carico massimo e rigidità) del tessuto tendineo sono state valutate anche in studio precedente, e ha mostrato le proprietà meccaniche del costrutto TDSC con carico erano migliori rispetto a quella senza carico21.

Il mezzo può influenzare la crescita cellulare e la differenziazione. Nel presente protocollo, al fine di formare il foglio cellulare in modo corretto, i TDSC sono stati aumentati al 100% di confluenza in flaconi di plastica standard non rivestiti in mezzo completo, e poi i TDSC sono stati stimolati a promuovere la deposizione di ECM aggiungendo 4,4 mg/mL di acido ascorbico per 6 d. Diversi fattori di crescita, tra cui il fattore di crescita insulino-simile I, fattore di crescita endoteliale vascolare, fattore di crescita derivato dalle piastrine, fattore di crescita del fibroblasto di base, trasformazione del fattore di crescita, e fattore di differenziazione della crescita 5, ha svolto un ruolo importante nella formazione del tendine e guarigione31,32,33,34. Inoltre aggiungendo 25 ng/mL fattore di crescita del tessuto connettivo nel mezzo di coltura di stimolazione come Ni et al. ha riferito potrebbe accelerare l'intero processo di crescita e differenziazione35.

Attualmente, il foglio cellulare 2D, noto anche come cellula monostrato, è il sistema più comune utilizzato per le indagini meccaniche. Tratto biassiale fornisce tensione multidirezionale, sia longitudinale che lateralmente, in quanto il tratto uniaxiale fornisce solo tensione longitudinale36. Pertanto, la coltura cellulare a più monostrato con tratto biassiale potrebbe imitare l'ambiente di crescita di alcuni tipi di cellule, come i cardiomiociti e le cellule epidermiche. Tuttavia, il costrutto di cellule 3D è più simile alla forma reale di un tendine, e tratto uniaxiale è più simile alle caratteristiche di stress delle cellule tendinee, rispetto al foglio cellulare 2D e all'allungamento biassiale. Pertanto, la combinazione del costrutto di cellule 3D e dello stretching uniassiale è più competente per una migliore comprensione del tendine e del suo microambiente meccanico. Questo fornisce una base teorica per l'utilizzo di un sistema di stretching uniassiale 3D per stimolare la differenziazione dei TDSC. Così, il foglio di cellule 2D è stato finalmente arrotolato in un costrutto di cellule 3D e ha subito un tratto uniaxiale nel protocollo attuale.

Il bioreattore utilizzato nel protocollo attuale consisteva nell'attuatore e nella camera di coltura (Figura 4). I dettagli dell'attuale bioreattore sono disponibili in uno studio precedente37. Attualmente, gli attuatori più comuni utilizzati per tendini includevano attuatori pneumatici, motori lineari e viti a passo38,39,40. Le camere comprendevano camere integrate e separate41,42. Tra questi, una camera separata con un motore lineare ha fornito un carico meccanico accurato ed era portatile e facile da regolare43.

Ad eccezione dei TDSC, altri tipi di cellule staminali potrebbero essere una potenziale fonte cellulare da utilizzare nel metodo attuale. Ricerche precedenti hanno dimostrato che altri tipi di cellule staminali potrebbero avere una potenziale capacità terapeutica e potrebbero migliorare la rigenerazione dei tendini. Rispetto ai tendini equini feriti trattati con la gestione convenzionale non cellulare, il tasso di relesionista dei tendini trattati dai BMSC era inferiorea 44,45. Inoltre, l'iniezione intratensadica di BMSC in un modello di tendinopatia potrebbe effettivamente indurre la rigenerazione dei tendini46. Le cellule staminali derivate adipose potrebbero trattare efficacemente le tendinopatie equine che portano al completo recupero e al ritorno alla normale attività nei cavalli47. Insieme, c'erano prove sufficienti per suggerire che le cellule staminali, ad eccezione dei TDSC, potevano trattare la degenerazione dei tendini. Tuttavia, come nota cautelativa, il trapianto di BMSC in tendini feriti ha dimostrato di indurre differenziazione osteogenica ectopica in un modello di coniglio, suggerendo che le cellule staminali da un tessuto specifico potrebbero avere la tendenza a differenziarsi in cellule indesiderate del loro tessuto di origine48. In precedenti ricerche, il trattamento privato del carico ai TDSC potrebbe provocare l'osteogenesi e21, il che ha portato alla proposta che l'attuale metodo ha il potenziale per indurre la tenogenesi di altre cellule staminali ed evitare l'osteogenesi con regime di carico specifico. Ulteriori ricerche sono necessarie per esplorare questi regimi di carico specifici per altri tipi di cellule staminali. Se questo scenario è valido, sarà disponibile più origine cellulare per il trattamento della tendinopatia.

Ci sono ancora alcune limitazioni da riconoscere. In primo luogo, anche se un materiale non corrosivo e autoclante, l'acciaio inossidabile, è stato utilizzato per costruire il sistema di bioreattore, le condizioni di coltura e il mezzo di coltura corrodono ancora la camera compresa la vite e il gancio. Pertanto, sono necessarie l'ispezione di routine della camera e la rimozione tempestiva della ruggine. In secondo luogo, al fine di rendere l'attuale bioreattore economico e portatile, non vi è un sistema di controllo ambientale e di circolazione media. Pertanto, l'operatore deve trasportare il bioreattore e aprire la camera per uno scambio medio ogni 3 giorni, il che aumenta il rischio di contaminazione. L'operatore deve sempre prestare attenzione a mantenere sterile l'ambiente TDSCs .

Per il trattamento della tendinopatia, è fondamentale chiarire il processo patologico da una prospettiva non chirurgica. In termini di trattamento chirurgico, un metodo efficace è quello di utilizzare innesti autologi ingegnerizzati. Il processo di stimolazione delle TDSC a imitare la differenziazione in vivo è utile per lo studio del processo patologico della tendinopatia. Il tessuto tendineo senza scaffold ingegnerizzato ha la capacità di promuovere la guarigione del tendine in un modello di lesione della finestra del tendine rotuleo di ratto. Inoltre, i lavori precedenti hanno dimostrato che il carico meccanico poteva migliorare le proprietà meccaniche del tendine colto. Pertanto, questo protocollo fornisce un metodo riproducibile per la differenziazione diretta dei TDSC in tessuto simile a quello tendineo in modo che possa essere utilizzato in modo semplice e fattibile per una potenziale cultura del tendine ingegnerizzata.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

La ricerca è stata condotta mentre l'autore stava ricevimentando "una borsa di studio della University of Western Australia International Fee e un premio post-laurea dell'Università dell'Australia Occidentale". Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81802214).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331

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References

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Medicina Numero 162 Carico meccanico cellule staminali derivate dal tendine tendinopatia bioreattore differenziazione tendine cellule staminali
Applicazione di un sistema di bioreattore tridimensionale di stimolazione meccanica uniassiale per indurre la differenziazione tenogena delle cellule staminali derivate da Tendon
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Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).

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