Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bruke et tredimensjonalt uniaxial mekanisk stimulering bioreactor system for å indusere tenogen differensiering av sene-avledede stamceller

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61278
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia
* These authors contributed equally

Summary

Et tredimensjonalt uniaxial mekanisk stimulering bioreaktorsystem er en ideell bioreaktor for tenogen-spesifikk differensiering av sene-avledede stamceller og neo-senedannelse.

Abstract

Tendinopati er en vanlig kronisk senesykdom knyttet til betennelse og degenerasjon i et ortopedisk område. Med høy sykelighet, begrenset selvreparerende kapasitet og, viktigst, ingen definitive behandlinger, påvirker tendinopati fortsatt pasientenes livskvalitet negativt. Sene-avledede stamceller (TDSCs), som primære forløperceller av seneceller, spiller en viktig rolle i både utviklingen av tendinopati, og funksjonell og strukturell restaurering etter tendinopati. Dermed vil en metode som in vitro etterligne in vivo differensiering av TDSCer i seneceller være nyttig. Her beskriver den nåværende protokollen en metode basert på et tredimensjonalt (3D) uniaxial stretching system for å stimulere TDSCs å differensiere til senelignende vev. Det er syv stadier av den nåværende protokollen: isolering av mus TDSCs, kultur og utvidelse av mus TDSCs, utarbeidelse av stimulering kultur medium for celleplatedannelse, cellearkdannelse ved kulturing i stimuleringsmedium, utarbeidelse av 3D sene stamcellekonstruksjon, montering av det uniaxial-stretching mekaniske stimuleringskomplekset, og evaluering av det mekaniske stimulerte in vitro senelignende vevet. Effektiviteten ble demonstrert av histologi. Hele prosedyren tar mindre enn 3 uker. For å fremme ekstracellulær matrisedeponering ble 4,4 mg/ml askorbinsyre brukt i stimuleringskulturmediet. Et separert kammer med en lineær motor gir nøyaktig mekanisk lasting og er bærbar og lett justert, som brukes for bioreaktoren. Lasteregimet i den nåværende protokollen var 6% belastning, 0,25 Hz, 8 h, etterfulgt av 16 h hvile i 6 dager. Denne protokollen kan etterligne celledifferensiering i senen, noe som er nyttig for undersøkelse av den patologiske prosessen med tendinopati. Videre, sene-lignende vev er potensielt brukt til å fremme sene healing i sene skade som en konstruert autolog graft. For å oppsummere er den nåværende protokollen enkel, økonomisk, reproduserbar og gyldig.

Introduction

Tendinopati er en av de vanlige idrettsskadene. Det manifesteres hovedsakelig av smerte, lokal hevelse, redusert muskelspenning i det berørte området og dysfunksjon. Forekomsten av tendinopati er høy. Tilstedeværelsen av Achilles tendinopati er mest vanlig for mellom- og langdistanseløpere (opptil 29%), mens tilstedeværelsen av patellar tendinopati er også høy i idrettsutøvere av volleyball (45%), basketball (32%), friidrett (23%), håndball (15%), og fotball (13%)1,2,3,4,5. Men på grunn av den begrensede selvhelbredende evnen til senen, og mangelen på effektive behandlinger, påvirker tendinopati fortsatt pasientenes liv negativt6,7. Videre er patogenesen av tendinopati fortsatt uklart. Det har vært mange undersøkelser om patogenesen, hovedsakelig inkludert "betennelsesteori", "degenerasjonsteori", "overforbruksteori", og så videre8. I dag trodde mange forskere at tendinopati skyldtes den mislykkede selvreparasjonen til mikroskadene forårsaket av overdreven mekanisk lasting av seneopplevelsene9,10.

Sene-avledede stamceller (TDSCs), som primære forløperceller av seneceller, spiller en viktig rolle i både utvikling av tendinopati og funksjonell og strukturell restaurering etter tendinopati11,12,13. Det ble rapportert at mekanisk stressstimulering kan føre til spredning og differensiering av osteocytter, osteoblaster, glatte muskelceller, fibroblaster, mesenchymale stamceller og andre kraftfølsomme celler14,15,16,17,18. Derfor kan TDSCer, som en av mekanosensitive og multipotente celler, på samme måte stimuleres til å skille ved mekanisk lasting19,20.

Imidlertid kan ulike mekaniske lasteparametere (lastestyrke, lastefrekvens, lastingstype og lastingsperiode) indusere TDSCer for å skille seg inn i forskjellige celler21. Dermed er et effektivt og gyldig mekanisk lastingsregime svært viktig for tenogenese. Videre er det forskjellige typer bioreaktorer som stimuleringssystemer som i dag brukes for å gi mekanisk lasting til TDSCs. Prinsippene for hver type bioreaktor er forskjellige, så de mekaniske lasteparametrene som tilsvarer forskjellige bioreaktorer er også forskjellige. Derfor er en enkel, økonomisk og reproduserbar stimuleringsprotokoll etterspurt, inkludert typen bioreaktor, det tilsvarende stimuleringsmediet og det mekaniske lasteregimet.

Den nåværende artikkelen beskriver en metode basert på et tredimensjonalt (3D) uniaxial stretching system for å stimulere TDSCs å skille seg inn i senelignende vev. Det er syv stadier av protokollen: isolering av mus TDSCer, kultur og utvidelse av mus TDSCer, utarbeidelse av stimulering kultur medium for celleplatedannelse, cellearkdannelse ved kulturing i stimuleringsmedium, utarbeidelse av 3D sene stamcellekonstruksjon, montering av uniaxial-stretching mekanisk stimulering kompleks, og evaluering av mekanisk stimulert in vitro senelignende vev. Hele prosedyren tar mindre enn 3 uker å få 3D-cellekonstruksjonen, som er langt mindre enn noen eksisterende metoder22,23. Den nåværende protokollen har vist seg å være i stand til å indusere TDSCer å skille seg inn i senevev, og det er mer pålitelig enn dagens brukte todimensjonale (2D) stretching system21. Effektiviteten ble demonstrert av histologi. Kort sagt, den nåværende protokollen er enkel, økonomisk, reproduserbar og gyldig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Metodene som er beskrevet ble godkjent og utført i samsvar med retningslinjene og forskriftene til University of Western Australia Animal Ethics Committee.

1. Isolering av mus TDSCer

  1. Euthanize den 6-8 uker gamle C57BL/6 mus ved cervical dislokasjon.
  2. Harvest patellar sener24 og Achilles sener25.
  3. Fordøy sener fra en med 6 ml av type I collagenase (3 mg/ml) i 3 timer.
    MERK: Siden størrelsen på senen i musen er liten, bør alle sener høstet fra en mus brukes i dette trinnet.
  4. Samle celler og kultur i komplett Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) som inneholder 10% av føtal storfe serum (FBS) og 1% av streptomycin og penicillin blanding i 7 dager.
  5. Identifiser TDSCer ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering etter strømningscytometri (uttrykk for celleoverflatemarkører, inkludert CD44, CD90 og Sca-1; mangel på uttrykk for CD34 og CD45).
  6. Passasje og fryse celler (passasje 4 celler vil bli brukt for ytterligere trinn).

2. Kultur og utvidelse av mus TDSCer

MERK: Utfør alle trinnene i en steril biosikkerhetshette.

  1. Ta de oppvarmede cellene (mus TDSCer, 1 million celler, passasje 4, til 37 °C).
  2. Legg sakte til ekstra 4-5 ml komplett Minimal Essential Medium (Alpha-MEM).
  3. Overfør blandingen til et 15 ml sentrifugerør med pipette.
  4. Fyll opp med middels til 8 ml totalt med pipette.
    1. Prewarm medium i en 37 °C ovn inkubator.
  5. Plasser røret i sentrifuge og balanse.
  6. Sentrifuge- og pelletceller ved 347 x g i 5 min.
  7. Ta ut etter sentrifuge og sjekk pellet nederst.
  8. Dekanter frysemediet, og resuspend celler forsiktig i 1-2 ml komplett medium (unngå å lage for mange bobler).
  9. Overfør resuspended celler til en T-75 kolbe med en pipette.
  10. Bruk en pipette til å legge til komplett Alpha-MEM Medium i kolben for å nå et totalt volum på 10 ml med endelig konsentrasjon på 13 000 celler/cm2.
  11. Plasser kolben i inkubatoren og kulturen ved 37 °C med 5 % CO2.
  12. Endre mediet hver tredje dag.
  13. Observer og overvåk cellene under et mikroskop når du endrer mediet til cellene er kultivert til 100% samløpet (ca. 40 000 celler/cm2).

3. Utarbeidelse av stimuleringskulturmedium for celleplatedannelse

MERK: Utfør alle trinnene i en steril biosikkerhetshette.

  1. Hell 15 ml komplett Alpha-MEM medium i et 15 ml sterilt rør.
  2. Tilsett 6 μL askorbinsyre (11 mg/ml) i 15 ml medium for en endelig konsentrasjon på 4,4 μg/ml.
    MERK: I tillegg kan det å legge til 25 ng/ml bindevevsvekstfaktor i stimuleringskulturmediet akselerere hele vekst- og differensieringsprosessen.
  3. Bland forsiktig ved å invertere opp og ned.

4. Cellearkdannelse ved å klult i stimuleringsmedium

MERK: Utfør alle trinnene i en steril biosikkerhetshette.

  1. Kast det normale komplette alfa-MEM-mediet forsiktig, og unngå å berøre cellene som er festet til bunnen av kolben.
  2. Tilsett 10 ml stimuleringsmedium sakte og unngå å forårsake forstyrrelser i de fullstendig samløpetscellene.
  3. Kultur cellene i stimuleringsmedium i 9 dager (endre mediet hver tredje dag) for å tilstrekkelig generere cellearket ved 37 °C med 5% CO2.
    MERK: Ekstracellulær matrise vil bli tykk og til stede for å være overskyet når den observeres fra bunnen av kolben etter stimulert av askorbinsyre, noe som betyr at cellearket er tilstrekkelig generert.

5. Utarbeidelse av 3D sene stamcelle konstruere

MERK: Utfør alle trinnene i en steril biosikkerhetshette.

  1. Ta kolben ut av inkubatoren.
  2. Kast stimuleringsmediet helt.
  3. Vask monolayercellearket med fosfatbuffer saltvann (PBS) ved å virvle kolben.
  4. Kast PBS helt.
  5. Bruk en pipette for å legge til 1 ml 0,25% trypsin til hjørnet av kolben.
  6. Trykk hjørnet av kolben for å de-feste monolayer cellearket til hjørnet av cellearket er av bunnen av kolben.
  7. Legg umiddelbart til 9 ml komplett Alpha-MEM-medium for å stoppe trypsiniseringen.
  8. Fortsett å virvle kolben for å skrelle av monolayer cellearket helt.
  9. Hell det totale de-vedlagte cellearket i en petriskål med medium.
  10. Bruk en steril pinsett til å plukke opp ett hjørne av cellearket og rotere med urviseren i 15 ganger.
  11. Plukk opp en annen ende av cellearket og roter i retning mot urviseren i 10 ganger for å generere en senelignende in vitrokonstruksjon (figur 1A).

6. Montering av det uniaxial-stretching mekaniske stimuleringskomplekset i unik designet bioreaktor

MERK: Utfør alle trinnene i en steril biosikkerhetshette.

  1. Koble krokene ved hjelp av connectren og juster til ønsket avstand (2 cm) mellom to kroker.
  2. Vikle forsiktig 3D-TDSCene på den monterte kroken i 3 ganger på hver krok (Figur 1B).
  3. Fest krokene med cellekonstruksjon på bioreaktorens kammer ved å stramme skruene på to ender.
    MERK: Hele kammeret, inkludert skruer og kroker, er sterilt (autoklav i 1,5 timer ved 134 °C og ultrafiolette stråler (UV) eksponerer i 24 timer før bruk). For metallholderen av kamre, UV-lys utsette i 48 timer før bruk.
  4. Fyll opp kammeret med komplett Alpha-MEM medium.
  5. Koble aktuatoren til kulturkammeret med kabel.
  6. Klipp krokene connecter av steril saks.
  7. Slå på strømmen og den tilsvarende kanalkontrolleren for å starte mekanisk stimulering.
  8. Sett lokket på kammeret.
  9. Kontroller indikatorlampene og forsikre at bioreaktoren kan fungere som den skal.
  10. Sett bioreaktoren i inkubatoren og subjekt 3D-cellekonstruksjonen til mekanisk strekking i 6 dager (6% strekking, 0,25 Hz, 8 h, etterfulgt av 16 h hvile).

7. Evaluering av det mekaniske stimulerte in vitro senelignende vev

  1. Løsne skruene med en skrutrekker og ta av enheten forsiktig.
  2. Sett senelignende vev i 4% paraformaldehyd for fiksering i 15 min.
  3. Plasser det faste senelignende vevet i en biopsikassett med biopsiskumputer.
  4. Prosess for å dehydrere prøven og til slutt evaluere ved H&E histologisk farging.
  5. Gjenta hele protokollen og trekk ut RNA fra senelignende vev for å evaluere uttrykket av tenogene markører ved kvantitativ PCR (qPCR). Primere for de valgte genene er oppført i tabell 1.
    MERK: Histologiprotokoll og qPCR-protokollen er standard og følger en tidligere studie21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før mekanisk stimulering ble TDSCs dyrket til 100% samløpet i komplett medium og viste en uorganisert ultrastrukturell morfologi (figur 2A). Etter 6 dager med uniaxial strekking mekanisk lasting, ekstracellulær matrise (ECM) og celle justeringer var godt orientert (Figur 2B). Cellene var godt befolket og godt innhyllet i ECM etter mekanisk lasting. Cellemorfologi ble presentert for å være langstrakt og var mer lik normal senecelle sammenlignet med den uten strekking (figur 2C). Celletetthet i cellekonstruksjon med lasting var høyere enn i den uten lasting. QPCR-resultatene viste at den nåværende metoden økte uttrykket for de tenogene markørene, inkludert Scleraxis, Mohawk, Tenomodulin og COL1A1 (figur 3) sammenlignet med de som behandles av statisk kultur.

Figure 1
Figur 1: Montering av tredimensjonal (3D) celle konstruere over krokene av bioreaktoren. (A)Generell visning av 3D-cellen konstruere over krokene. (B) Diagrammet for å montere 3D-cellekonstruksjonen over krokene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Cellemorfologi før og etter mekanisk stimulering. (A) Sene-avledede stamceller ble dyrket til 100% samløpet i komplett medium og viste en uorganisert ultrastrukturell morfologi før mekanisk stimulering. (B)Histologiske bilder viste H&E farging av cellekonstruksjon etter mekanisk stimulering. (C)Histologiske bilder viste H&E farging av en kontrollcellekonstruksjon dyrket i bioreaktor i 6 dager uten mekanisk stimulering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Uttrykksnivå for tenogenesemarkører. Individuelle genuttrykksnivåer ble først normalisert mot internkontroll, 36B4, og deretter normalisert mot genuttrykksnivåer fra statiske kulturer. Resultater fra 3 eksperimenter vises. Primersekvensene som brukes til qPCR-analyse, leveres i tabell 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Det tredimensjonale uniaxial mekaniske stimuleringsbioreaktorsystemet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Genet Primer sekvens
Fremover 5'->3' Omvendt 5'->3'
Col1a1 (andre) TGACTGGAAGAGCGGAGAGT GttCGGGCTGATGTACCAGT
Skleraxis (andre) CCCAAACAGATCTGCACCTT (ANDRE) GGCTCTCCGTGACTCTTCAG
Mohawk GTCCGGCAGCCAGATTTAAG LEILIGHET TCGCTGAGCTTTCCCCTTTA (Nær TCGCTGAGCTTTCCCCTTTA)
Tenomodulin (andre) Ccgcagaaaagcctattgaa (nær CCGCAGAAAAGCCTATTGAA) Gaccacccattgctcattct
36B4 (andre) CTTCCCACTTGCTGAAAAGG CGAAGAGACCGAATCCCATA (Nær CGAAGAGACCGAATCCCATA)

Tabell 1: Primersekvenser som brukes til qPCR-analyse

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Senen er et mekanosensitivt fibrøs bindevev. Ifølge tidligere forskning, overflødig mekanisk lasting kan føre til osteogen differensiering av sene stamceller, mens utilstrekkelig lasting ville føre til uorden kollagen fiber struktur under sene differensiering21.

Et vanlig syn er at nøkkelen til en ideell bioreaktor er evnen til å simulere in vitro cellulær mikromiljø som celler in vivo gjennomgår. Derfor, etterligne in vivo normal stress miljø in vitro er nøkkelen til å stimulere single-lineage differensiering av TDSCs i sene celler. I den nåværende protokollen var bredden på TDSC-konstruksjonen 2 cm, og bevegelsesområdet til kroken var 0,12 cm, noe som betyr at belastningen var 0,12/2 (%). Til slutt ble TDSCer mekanisk stimulert i en bioreaktor i 6 dager (6%, 0,25 Hz, 8 h, etterfulgt av 16 h hvile) i den nåværende protokollen. Etter evalueringen har de mekaniske lasteparametrene som brukes i denne protokollen vist seg å indusere TDSCer for å generere senelignende vev. Det bør bemerkes at bioreactor parametrene bør spesifikt samsvare med tilsvarende type strekksystem. For eksempel er de riktige parametrene for monolayered cellestrekking forskjellig fra det nåværende 3D-cellearket som strekker seg26,27. En mulig årsak er de forskjellige kraftmodusene21. I 2D monolayer stretching system, celler feste til kultur substrat ved fokal adhesjoner nederst og koble til hverandre via celle-celle veikryss. Men i et 3D-celleark er det også mange flere celle-ECM-tilkoblinger dannet som følge av 3D-nisjen, noe som betyr at cellene er under trykk i tillegg til å strekke seg.

Effektiviteten av den nåværende protokollen ble demonstrert av morfologi og uttrykksnivået av tenogene markører. Når det gjelder morfologi, bortsett fra histologi, ved hjelp av konfokal immunfluorescensmikroskopi for å oppdage kollagen, er jeg en vanlig måte å karakterisere kollagenorganisasjonen på og deretter evaluere ECM-justeringen. Forrige studie bekreftet godt justert kollagen type jeg bunt formasjon i TDSC konstruere med 6% uniaxial mekanisk stimulering i 6 dager, men ikke i den uten lasting21. Tenogene markører ble brukt til å identifisere seneceller, inkludert Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX), Tenomodulin (TNMD) og COL1A1. Bare TNMD var en ikke-transkripsjonsfaktor, og resten av dem er transkripsjonsfaktorer28. De var alle godt anerkjent. SCX kan regulere seneutvikling i embryonale stadium29,mens MKX kunne regulere sene differensiering og modning i postnatal stadium30. Videre har de mekaniske egenskapene (maks belastning og stivhet) av senelignende vev blitt evaluert i tidligere studier også, og det viste de mekaniske egenskapene til TDSC konstruksjon med lasting var bedre enn i den uten å laste21.

Mediet kan påvirke cellevekst og differensiering. I den nåværende protokollen, for å danne cellearket på en riktig måte, ble TDSCs dyrket til 100% samløpet i standard ubestrøket plastflasker i komplett medium, og deretter TDSCs ble stimulert for å fremme ECM deponering ved å legge til 4.4 mg / ml askorbinsyre for 6 d. Flere vekstfaktorer, inkludert insulin-lignende vekstfaktor jeg, vaskulær endotelvekstfaktor, blodplate-avledet vekstfaktor, grunnleggende fibroblast vekstfaktor, transformere vekstfaktor, og vekst differensiering faktor 5, spilte en viktig rolle i sene dannelse og healing31,32,33,34. I tillegg legge 25 ng / ml bindevev vekstfaktor i stimulering kultur medium som Ni et al. rapportert kan akselerere hele vekst og differensiering prosess35.

I dag er 2D-cellearket, også kjent som monolayered cellen, det vanligste systemet som brukes til mekaniske undersøkelser. Biaxial stretch gir multidirectional spenning, både langsgående og lateralt, da den uniaxial strekningen bare gir langsgående spenning36. Dermed kan monolayered cellekultur med biaksial stretch etterligne vekstmiljøet til noen typer celler, som kardiomyocytter og epidermale celler. 3D-cellekonstruksjonen ligner imidlertid mer på den virkelige formen på en sene, og uniaxial stretch er mer lik stressegenskapene til seneceller, sammenlignet med 2D-celleark og biaksial stretch. Dermed er kombinasjonen av 3D-cellekonstruksjonen og den uniaxial stretching mer kompetent for bedre forståelse av senen og dets mekaniske mikromiljø. Dette gir et teoretisk grunnlag for bruk av et 3D-uniaxial stretching system for å stimulere differensieringen av TDSCer. Dermed ble 2D-cellearket endelig rullet inn i en 3D-cellekonstruksjon og gjennomgikk en uniaxial strekning i den nåværende protokollen.

Bioreaktoren som ble brukt i den nåværende protokollen besto av aktuator og kulturkammer (figur 4). Detaljene i dagens bioreaktor er tilgjengelig i en tidligere studie37. Foreløpig de vanligste aktuatorer som brukes for sene inkludert pneumatiske aktuatorer, lineære motorer, og trinn motorball skruer38,,39,40. Kamre inkludert integrerte og separertekamre 41,,42. Blant dem, et separert kammer med en lineær motor gitt nøyaktig mekanisk lasting og var bærbar og lett å justere43.

Bortsett fra TDSCer, kan andre typer stamceller være en potensiell cellekilde som skal brukes i den nåværende metoden. Tidligere forskning har vist at andre typer stamceller kan ha potensiell terapeutisk evne og kan forbedre sene regenerering. Sammenlignet med skadde hestesener behandlet med konvensjonell ikke-cellulær basert ledelse, var re-skadefrekvensen av senene behandlet av BMSCs lavere44,,45. Videre kan intratendinous injeksjon av BMSCer i en tendinopati modell effektivt indusere sene regenerering46. Fett avledede stamceller kan effektivt behandle equine tendinopathies fører til fullstendig utvinning og gå tilbake til normal aktivitet i hester47. Sammen var det nok bevis som tyder på at stamceller, unntatt TDSCs, kunne behandle senegenerasjon. Men som et advarende notat har transplantasjon av BMSCer i skadede sener vist seg å indusere ektopisk osteogen differensiering i en kaninmodell, noe som tyder på at stamceller fra et bestemt vev kan ha en tendens til å differensiere til uønskede celler av deres opprinnelsesvev48. I tidligere forskning kan lasting-fratatt behandling til TDSCer føre til osteogenese samt21, noe som førte til forslaget om at den nåværende metoden har potensial til å indusere tenogenese av andre stamceller og unngå osteogenese med spesifikt lasting regime. Videre forskning er nødvendig for å utforske disse spesifikke lasteregimer for andre typer stamceller. Hvis dette scenariet holder, vil mer cellekilde for å behandle tendinopati være tilgjengelig.

Det er fortsatt noen begrensninger som skal anerkjennes. For det første, selv om et ikke-korroderende og autoklaverbart materiale, rustfritt stål, ble brukt til å bygge bioreaktorsystemet, de kulterende forholdene og kulturmediet korroderer fortsatt kammeret, inkludert skruen og kroken. Dermed er rutinemessig inspeksjon av kammeret og rettidig rustfjerning nødvendig. For det andre, for å gjøre dagens bioreaktor økonomisk og bærbar, er det ikke et miljøkontroll og middels sirkulasjonssystem i den. Dermed må operatøren transportere bioreaktoren og åpne kammeret for middels utveksling hver tredje dag, noe som øker risikoen for forurensning. Operatøren må alltid være oppmerksom for å holde TDSCs miljø steril .

For behandling av tendinopati er det viktig å klargjøre den patologiske prosessen fra et ikke-kirurgisk perspektiv. Når det gjelder kirurgisk behandling, er en effektiv metode å bruke konstruerte autologe grafts. Prosessen med å stimulere TDSCs å etterligne differensiering in vivo er nyttig for undersøkelse av patologisk prosess med tendinopati. Det konstruerte stillasfrie senevevet har evnen til å fremme senehelbredelse i en rotte patellar senevindu skade modell. Dessuten viste tidligere arbeid at den mekaniske belastningen kunne forbedre de mekaniske egenskapene til kultivert sene. Dermed gir denne protokollen en reproduserbar metode for rettet differensiering av TDSCer i senelignende vev, slik at den kan brukes enkelt og mulig for potensiell konstruert senekultur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskningen ble utført mens forfatteren var i mottak av "en University of Western Australia International Fee Scholarship og en University Postgraduate Award ved The University of Western Australia". Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81802214).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper's knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper's knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), Bristol, Avon. 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), Oxford, England. 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), Oxford, England. 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), Bristol, England. 014109 (2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), Cambridge, England. 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

Tags

Medisin Utgave 162 Mekanisk lasting seneavledet stamcelle tendinopati bioreaktor differensiering sene stamcelle
Bruke et tredimensjonalt uniaxial mekanisk stimulering bioreactor system for å indusere tenogen differensiering av sene-avledede stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen,… More

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter