Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Toepassing van een drie-dimensionale uniaxiale mechanische stimulatie bioreactor systeem om tenogene differentiatie van pees-afgeleide stamcellen induceren

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61278
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia
* These authors contributed equally

Summary

Een driedimensionaal uniaxiale mechanische stimulatie bioreactorsysteem is een ideale bioreactor voor tenogeen-specifieke differentiatie van pees-afgeleide stamcellen en neo-peesvorming.

Abstract

Tendinopathie is een veel voorkomende chronische peesziekte met betrekking tot ontsteking en degeneratie in een orthopedisch gebied. Met een hoge morbiditeit, beperkte zelfherstellende capaciteit en, belangrijker nog, geen definitieve behandelingen, tendinopathie nog steeds van invloed op de kwaliteit van het leven van patiënten negatief. Pees-afgeleide stamcellen (TDC's), als primaire voorloper cellen van peescellen, spelen een essentiële rol in zowel de ontwikkeling van tendinopathie, en functionele en structurele restauratie na tendinopathie. Zo zou een methode die in vitro de in vivo differentiatie van TSCs in peescellen kan nabootsen nuttig zijn. Hier beschrijft het huidige protocol een methode op basis van een driedimensionaal (3D) uniaxial stretchingsysteem om de TSCs te stimuleren om zich te onderscheiden in peesachtige weefsels. Er zijn zeven stadia van het huidige protocol: isolatie van muizen-TSCs, cultuur en uitbreiding van muizen-TSCs, voorbereiding van stimulatiecultuurmedium voor celbladvorming, celbladvorming door culturing in stimulatiemedium, voorbereiding van 3D-peesstamcelconstructie, assemblage van het uniaxiale mechanische stimulatiecomplex en evaluatie van het mechanische gestimuleerde in vitropepeweefsel. De effectiviteit werd aangetoond door histologie. De hele procedure duurt minder dan 3 weken. Om extracellulaire matrixdepositie te bevorderen, werd 4,4 mg/mL ascorbinezuur gebruikt in het stimulatiecultuurmedium. Een gescheiden kamer met een lineaire motor zorgt voor nauwkeurige mechanische belasting en is draagbaar en gemakkelijk af te stellen, die wordt toegepast voor de bioreactor. Het laadregime in het huidige protocol was 6% spanning, 0,25 Hz, 8 uur, gevolgd door 16 uur rust gedurende 6 dagen. Dit protocol kan celdifferentiatie in de pees nabootsen, wat nuttig is voor het onderzoek van het pathologische proces van tendinopathie. Bovendien wordt het peesachtige weefsel mogelijk gebruikt om de genezing van pees bij peesletsel als een gemanipuleerde autologe graft te bevorderen. Kortom, het huidige protocol is eenvoudig, economisch, reproduceerbaar en geldig.

Introduction

Tendinopathie is een van de gemeenschappelijke sportblessures. Het manifesteert zich voornamelijk door pijn, lokale zwelling, verminderde spierspanning in het getroffen gebied, en disfunctie. De incidentie van tendinopathie is hoog. De aanwezigheid van achilles tendinopathie komt het meest voor bij midden- en langeafstandslopers (tot 29%), terwijl de aanwezigheid van patellar tendinopathie ook hoog is bij volleyballers (45%), basketbal (32%), atletiek (23%), handbal (15%), en voetbal (13%)1,2,3,4,5. Echter, als gevolg van de beperkte zelfhelende vermogen van de pees, en het gebrek aan effectieve behandelingen, tendinopathie nog steeds van invloed op het leven van patiënten negatief6,7. Bovendien blijft de pathogenese van tendinopathie onduidelijk. Er zijn veel onderzoeken geweest naar de pathogenese, voornamelijk met inbegrip van "ontstekingstheorie", "degeneratietheorie", "overmatig gebruikstheorie", enzovoort8. Op dit moment, veel onderzoekers geloofden dat tendinopathie was te wijten aan de mislukte zelf-reparatie aan de micro-verwondingen veroorzaakt door overmatige mechanische belasting van de pees ervaringen9,10.

Tendon-afgeleide stamcellen (TSCs), als primaire voorloper cellen van peescellen, spelen een essentiële rol in zowel de ontwikkeling van tendinopathie en functionele en structurele restauratie na tendinopathie11,12,13. Er werd gemeld dat mechanische stressstimulatie de proliferatie en differentiatie van osteocyten, osteoblasten, gladde spiercellen, fibroblasten, mesenchymale stamcellen en andere krachtgevoelige cellen14,15,16,17,18kan veroorzaken . Daarom kunnen TSC's, als een van de mechanosensitive en multipotent cellen , eveneens worden gestimuleerd om te differentiëren door mechanische belasting19,20.

Verschillende mechanische belastingparameters (laadsterkte, laadfrequentie, laadtype en laadperiode) kunnen tdsc's er echter toe aanzetten zich te onderscheiden in verschillende cellen21. Een effectief en geldig mechanisch belastingregime is dus zeer belangrijk voor tenogenese. Bovendien zijn er verschillende soorten bioreactoren als stimulatiesystemen die momenteel worden gebruikt voor het leveren van mechanische belasting aan TSC's. De principes van elk soort bioreactor zijn verschillend, zodat zijn de mechanische ladingsparameters die aan verschillende bioreactoren overeenkomen ook verschillend. Daarom is er een eenvoudig, economisch en reproduceerbaar stimulatieprotocol in trek, inclusief het type bioreactor, het bijbehorende stimulatiemedium en het mechanische belastingregime.

Het onderhavige artikel beschrijft een methode op basis van een driedimensionaal (3D) uniaxial stretching systeem om de TSCs te stimuleren om zich te onderscheiden in peesachtig weefsel. Er zijn zeven stadia van het protocol: isolatie van muizen-TSCs, cultuur en uitbreiding van muizen-TSCs, voorbereiding van stimulatiecultuurmedium voor celbladvorming, celbladvorming door te kweken in stimulatiemedium, voorbereiding van 3D-peesstamcelconstructie, assemblage van het uniaxiale mechanische stimulatiecomplex en evaluatie van het mechanische gestimuleerde in vitrodonpees-achtige weefsel. De hele procedure duurt minder dan 3 weken om de 3D-celconstructie te verkrijgen, wat veel minder is dan sommige bestaande methoden22,23. Het huidige protocol is bewezen te kunnen tdc's te onderscheiden in peesweefsel, en het is betrouwbaarder dan de huidige veelgebruikte tweedimensionale (2D) stretching systeem21. De effectiviteit werd aangetoond door histologie. Kortom, het huidige protocol is eenvoudig, economisch, reproduceerbaar en geldig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De beschreven methoden werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van de University of Western Australia Animal Ethics Committee.

1. Isolatie van muizen-TDC's

  1. Euthanaseer de 6-8 weken oude C57BL/6 muizen door cervicale dislocatie.
  2. Oogst patellar pezen24 en achillespezen25.
  3. Verteren pezen van een met 6 mL van het type I collagenase (3 mg/mL) voor 3 uur.
    OPMERKING: Aangezien de grootte van de pees in de muis klein is, moeten alle pezen die van één muis worden geoogst, in deze stap worden gebruikt.
  4. Verzamel de cellen en cultuur in volledig Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% van streptomycine en penicilline mengsel gedurende 7 dagen.
  5. Identificeer TDSC's met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsorling op basis van stroomcytometrie (expressie van celoppervlakmarkeringen, waaronder CD44, CD90 en Sca-1; gebrek aan expressie van CD34 en CD45).
  6. Passage- en vriescellen (passage 4 cellen worden gebruikt voor verdere stappen).

2. Cultuur en uitbreiding van muizen-TDC's

OPMERKING: Voer alle stappen uit in een steriele bioveiligheidskap.

  1. Neem de opgewarmde cellen (muizen-TSC's, 1 miljoen cellen, passage 4, tot 37 °C).
  2. Voeg langzaam extra 4-5 mL van compleet Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) toe.
  3. Breng het mengsel met een pipet over op een 15 mL centrifugebuis.
  4. Herhoog met een totaal van gemiddeld tot 8 mL met een pipet.
    1. Voorwarm medium in een 37 °C oven incubator.
  5. Plaats de buis in centrifuge en balans.
  6. Centrifuge- en pelletcellen op 347 x g gedurende 5 minuten.
  7. Neem na centrifuge en controleer de pellet aan de onderkant.
  8. Decanteer het vriesmedium en resuspend cellen zachtjes in 1-2 mL van compleet medium (vermijd het maken van te veel bubbels).
  9. Breng geresuspended cellen over naar een T-75 fles door een pipet.
  10. Gebruik een pipet om complete Alpha-MEM Medium toe te voegen aan de kolf om een totaal volume van 10 mL te bereiken met een uiteindelijke concentratie van 13.000 cellen/cm2.
  11. Plaats de kolf in de couveuse en cultuur op 37 °C met 5% CO2.
  12. Verander het medium om de 3 dagen.
  13. Observeer en monitor de cellen onder een microscoop bij het veranderen van het medium totdat cellen worden gekweekt tot 100% samenvloeiing (ongeveer 40.000 cellen/cm2).

3. Voorbereiding van stimulatiecultuurmedium voor celbladvorming

OPMERKING: Voer alle stappen uit in een steriele bioveiligheidskap.

  1. Giet 15 mL van volledig Alpha-MEM medium in een 15 mL steriele buis.
  2. Voeg 6 μL ascorbinezuur (11 mg/mL) toe aan 15 mL medium voor een uiteindelijke concentratie van 4,4 μg/mL.
    OPMERKING: Daarnaast kan het toevoegen van 25 ng/mL bindweefselgroeifactor in het stimulatiecultuurmedium het hele groei- en differentiatieproces versnellen.
  3. Meng zachtjes door op en neer te keren.

4. Celbladvorming door te kweken in stimulatiemedium

OPMERKING: Voer alle stappen uit in een steriele bioveiligheidskap.

  1. Gooi het normale complete alfa-MEM-medium voorzichtig weg en raak de cellen aan de onderkant van de kolf niet aan.
  2. Voeg 10 mL stimulatiemedium langzaam toe en voorkom dat er geen verstoring van de volledig samenvloeiende cellen ontstaat.
  3. Kweek de cellen gedurende 9 dagen in stimulatiemedium (verander het medium om de 3 dagen) om het celblad bij 37 °C voldoende te genereren met 5% CO2.
    OPMERKING: Extracellulaire matrix wordt dik en aanwezig om troebel te zijn wanneer deze vanaf de onderkant van de kolf wordt waargenomen na gestimuleerd door ascorbinezuur, wat betekent dat het celblad voldoende wordt gegenereerd.

5. Voorbereiding van de 3D-peesstamcelconstructie

OPMERKING: Voer alle stappen uit in een steriele bioveiligheidskap.

  1. Haal de kolf uit de couveuse.
  2. Gooi het stimulatiemedium volledig weg.
  3. Was de monolaagcelplaat met fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) door de kolf te wervelen.
  4. Gooi de PBS volledig weg.
  5. Gebruik een pipet om 1 mL van 0,25% trypsine toe te voegen aan de hoek van de kolf.
  6. Tik op de hoek van de kolf om het celvel van de monolaag te de-hechten totdat de hoek van het celvel van de onderkant van de kolf is verwijderd.
  7. Voeg onmiddellijk 9 mL van compleet Alpha-MEM medium toe om de trypsinisatie te stoppen.
  8. Blijf de kolf wervelen om het monolaagcelblad volledig af te pellen.
  9. Giet het totale de-attached celblad in een Petri schotel met medium.
  10. Gebruik een steriele pincet om een hoek van het celblad op te rapen en 15 keer met de klok mee te draaien.
  11. Pak een ander uiteinde van het celblad op en draai 10 keer tegen de klok in om een peesachtige in vitro construct(figuur 1A)stevig te genereren.

6. Montage van het uniaxial-stretching mechanische stimulatiecomplex in uniek ontworpen bioreactor

OPMERKING: Voer alle stappen uit in een steriele bioveiligheidskap.

  1. Sluit de haken aan door de connecter en pas aan de gewenste afstand (2 cm) tussen twee haken.
  2. Wind de 3D TDSC's voorzichtig 3 keer op de gemonteerde haak aan elke haak(figuur 1B).
  3. Zet de haken met celconstructie op de kamer van de bioreactor door de schroeven aan twee uiteinden aan te draaien.
    LET OP: De hele kamer, inclusief schroeven en haken, is steriel (autoclave voor 1,5 uur bij 134 °C en ultraviolette stralen (UV) bloot gedurende 24 uur voor gebruik). Voor de metalen houder van kamers, UV-licht bloot voor 48 uur voor gebruik.
  4. Vul de kamer met compleet Alpha-MEM medium.
  5. Sluit de actuator via de kabel aan op de cultuurkamer.
  6. Snijd de haken connecter door steriele schaar.
  7. Schakel de voeding en de bijbehorende kanaalcontroller in om mechanische stimulatie te starten.
  8. Doe het deksel op de kamer.
  9. Controleer de indicatorlampen en zorg ervoor dat de bioreactor goed kan functioneren.
  10. Zet de bioreactor in de couveuse en onderwerp de 3D-cel constructie aan mechanische stretching voor 6 dagen (6% stretching, 0,25 Hz, 8 uur, gevolgd door 16 uur rust).

7. Evaluatie van het mechanische gestimuleerde in vitro pees-achtig weefsel

  1. Maak de schroeven los met een schroevendraaier en haal de montage voorzichtig af.
  2. Zet de pees-achtige weefsel in 4% paraformaldehyde voor fixatie gedurende 15 min.
  3. Plaats het vaste peesachtig weefsel in een biopsiecassette met biopsieschuimkussens.
  4. Proces om het monster te dehydrateren en uiteindelijk te evalueren door H&E histologische kleuring.
  5. Herhaal het hele protocol en extract RNA uit het pees-achtig weefsel voor de evaluatie van de expressie van tenogene markers door kwantitatieve PCR (qPCR). Primers voor de geselecteerde genen staan vermeld in tabel 1.
    OPMERKING: Histologie protocol en qPCR protocol zijn standaard en na een eerdere studie21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vóór mechanische stimulatie werden TSC's tot 100% samenvloeiing in compleet medium en vertoonden ze een ongeorganiseerde ultrastructurele morfologie(figuur 2A). Na 6 dagen van uniaxiale stretching mechanische belasting, extracellulaire matrix (ECM) en cel uitlijningen waren goed georiënteerd (Figuur 2B). Cellen waren goed bevolkt en goed gehuld in ECM na mechanische belasting. Celmorfologie werd gepresenteerd om langwerpig te zijn en leek meer op normale peescel in vergelijking met die zonder stretching(figuur 2C). Celdichtheid in celconstructie met belasting was hoger dan in de celdichtheid zonder belasting. QPCR resultaten toonden aan dat de huidige methode verhoogde de expressie van de tenogene markers met inbegrip van Scleraxis, Mohawk, Tenomodulin, en COL1A1 (Figuur 3) in vergelijking met degenen die worden behandeld door statische cultuur.

Figure 1
Figuur 1: Assemblage van driedimensionale (3D) celconstructie over de haken van de bioreactor. (A) Algemene weergave van de 3D-cel constructie over de haken. (B) Het diagram voor het monteren van de 3D-cel constructie over de haken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Celmorfologie voor en na mechanische stimulatie. (A) Pees-afgeleide stamcellen werden gekweekt tot 100% samenvloeiing in compleet medium en vertoonden een ongeorganiseerde ultrastructurele morfologie vóór mechanische stimulatie. (B) Histologic beelden toonden H & E kleuring van cel constructie na mechanische stimulatie. (C) Histologische beelden toonden H & E kleuring van een controlecel constructie gekweekt in bioreactor voor 6 dagen zonder mechanische stimulatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Expressieniveau van tenogenesemarkers. Individuele genexpressieniveaus werden eerst genormaliseerd tegen de interne controle, 36B4, en vervolgens genormaliseerd tegen genexpressieniveaus uit statische culturen. De resultaten van 3 experimenten worden getoond. De primersequenties die worden gebruikt voor qPCR-analyse zijn opgenomen in tabel 1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Het driedimensionale uniaxiale mechanische stimulatie bioreactorsysteem. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Gen Primer-reeks
Voorwaarts 5%->3" Reverse 5'->3'
COL1A1 TGACTGGAAGAGCGGAGAGT GTTCGGGCTGATGTACCAGT
Scleraxis CCCAAACAGATCTGCACCTT GGCTCTCCGTGACTCTTCAG
Mohawk GTCCGGCAGCCAGATTTA TCGCTGAGCTTTCCCCTTTA
Tenomodulin Tenomodulin CCGCAGAAAAGCCTATTGAA GACCACCCATTGCTCATTCT
36B4 CTTCCCACTTGCTGAAAAGG CGAAGAGACCGAATCCCATA

Tabel 1: Primer-sequenties die worden gebruikt voor qPCR-analyse

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De pees is een mechanosensitive vezelig bindweefsel. Volgens eerder onderzoek kan overtollige mechanische belasting leiden tot osteogene differentiatie van peesstamcellen, terwijl onvoldoende belasting zou leiden tot een verstoorde collageenvezelstructuur tijdens peesdifferentiatie21.

Een gemeenschappelijke mening is dat de sleutel tot een ideale bioreactor de capaciteit is om de in vitro cellulaire micro-omgeving te simuleren die de cellen in vivo ondergaan. Daarom is het nabootsen van de in vivo normale stressomgeving in vitro de sleutel tot het stimuleren van de single-lineage differentiatie van TSC's in peescellen. In het huidige protocol was de breedte van de TDSC-constructie 2 cm en het bewegingsbereik van de haak 0,12 cm, wat betekent dat de stam 0,12/2 (%). Kortom, TSC's werden mechanisch gestimuleerd in een bioreactor gedurende 6 dagen (6%, 0,25 Hz, 8 uur, gevolgd door 16 uur rust) in het huidige protocol. Na evaluatie is bewezen dat de mechanische belastingparameters die in dit protocol worden gebruikt, TDC's ertoe aanzetten om peesachtig weefsel te genereren. Opgemerkt moet worden dat de parameters van de bioreactor specifiek overeenkomen met het overeenkomstige type reksysteem. De juiste parameters voor monolayered celrekken verschillen bijvoorbeeld van de huidige 3D-celplaat diezich uitstrekt tussen 26en27. Een mogelijke reden is de verschillende krachtmodi21. In 2D monolayer stretching systeem, cellen hechten aan de cultuur substraat door focale verklevingen aan de onderkant en verbinding met elkaar via cel-cel knooppunten. Echter, in een 3D-cel blad, zijn er ook veel meer cel-ECM verbindingen gevormd als gevolg van de 3D-niche, wat betekent dat de cellen onder druk staan naast stretching.

De effectiviteit van het huidige protocol werd aangetoond door morfologie en het expressieniveau van tenogene markers. In termen van morfologie, afgezien van histologie, met behulp van confocale immunofluorescentie microscopie om collageen te detecteren I is een veel voorkomende manier om de collageen organisatie te karakteriseren en vervolgens evalueren van de ECM uitlijning. Eerdere studie bevestigde de goed uitgelijnde collageen type I bundel vorming in de TDSC constructie met 6% uniaxiale mechanische stimulatie voor 6 dagen, maar niet in de ene zonder belasting21. Tenogene markers werden gebruikt om peescellen te identificeren, waaronder Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX), Tenomodulin (TNMD) en COL1A1. Alleen TNMD was een niet-transcriptie factor, en de rest van hen zijn transcriptie factoren28. Ze werden allemaal goed herkend. SCX kan de peesontwikkeling in het embryonale stadium29reguleren, terwijl MKX peesdifferentiatie en rijping in postnatale fase30kan reguleren . Bovendien zijn de mechanische eigenschappen (maximale belasting en stijfheid) van het peesachtige weefsel ook geëvalueerd in eerdere studie, en het toonde aan dat de mechanische eigenschappen van TDSC-constructie met belasting beter waren dan in de constructie zonder21te laden.

Het medium kan de celgroei en -differentiatie beïnvloeden. In het huidige protocol werden TDS's, om het celblad op de juiste manier te vormen, tot 100% samenvloeiing in standaard ongecoate plastic kolven in compleet medium geteeld, waarna TDC's werden gestimuleerd om ECM-depositie te bevorderen door 4,4 mg/mL-ascorbinezuur toe te voegen voor 6 d. Verschillende groeifactoren, waaronder insuline-achtige groeifactor I, vasculaire endotheelgroeifactor, bloedplaatjes-afgeleide groeifactor, basisfiblast groeifactor, transformerende groeifactor, en groeidifferentiatie factor 5 , speelden een belangrijke rol bij de vorming van pees en genezing31,32,33,34. Daarnaast kan het toevoegen van 25 ng/mL bindweefselgroeifactor in stimulatiecultuurmedium als Ni et al. gerapporteerde de hele groei en differentiatie proces35versnellen.

Op dit moment is het 2D-celblad, ook wel bekend als de monolaagcel, het meest voorkomende systeem dat wordt gebruikt voor mechanische onderzoeken. Biaxiale stretch biedt multidirectionele spanning, zowel langs- als zijwaarts, omdat het uniaxiale stuk alleen longitudinale spanning36biedt. Zo kan monolaagcelcultuur met biaxiale stretch de groeiomgeving van sommige soorten cellen nabootsen, zoals cardiomyocyten en opperhuidcellen. Echter, de 3D-cel constructie is meer vergelijkbaar met de werkelijke vorm van een pees, en uniaxiale stretch is meer vergelijkbaar met de stress kenmerken van peescellen, in vergelijking met 2D-cel blad en biaxiale stretch. Zo is de combinatie van de 3D-celconstructie en de uniaxiale stretching competenter voor een beter begrip van de pees en de mechanische micro-omgeving. Dit biedt een theoretische basis voor het gebruik van een 3D uniaxial stretching systeem om de differentiatie van TSCs te stimuleren. Zo werd de 2D-cel blad uiteindelijk gerold in een 3D-cel constructie en onderging een uniaxiale stretch in het huidige protocol.

De bioreactor die in het huidige protocol werd gebruikt, bestond uit actuator en kweekkamer (figuur 4). De details van de huidige bioreactor zijn beschikbaar in een eerdere studie37. Momenteel, de meest voorkomende actuatoren gebruikt voor pees opgenomen pneumatische actuatoren, lineaire motoren, en stap motorbal schroeven38,39,40. Kamers opgenomen geïntegreerde en gescheiden kamers41,42. Onder hen, een gescheiden kamer met een lineaire motor verstrekt nauwkeurige mechanische belasting en was draagbaar en gemakkelijk te worden aangepast43.

Behalve TSC's kunnen andere soorten stamcellen een potentiële celbron zijn die in de huidige methode moet worden gebruikt. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat andere soorten stamcellen potentieel therapeutisch vermogen kunnen hebben en de peesregeneratie kunnen verbeteren. In vergelijking met gewonde paardenpezen die met conventioneel niet-cellulair beheer werden behandeld , was het herletselpercentage van de door BMC's behandelde pezen lager44,45. Bovendien zou intratendineuze injectie van BMSCs in een tendinopathiemodel effectief peesregeneratie46kunnen veroorzaken . Vethoudende stamcellen kunnen effectief de tendinopathieën van paarden behandelen die leiden tot volledig herstel en terugkeer naar normale activiteit bij paarden47. Samen was er genoeg bewijs om te suggereren dat stamcellen, behalve TDC's, peesdegeneratie konden behandelen. Echter, als een waarschuwende opmerking, transplantatie van BMSCs in gewonde pezen is aangetoond dat ectopische osteogene differentiatie induceren in een konijn model, wat suggereert dat stamcellen uit een specifiek weefsel zou kunnen hebben een neiging om te differentiëren in ongewenste cellen van hun weefsel van oorsprong48. In eerder onderzoek zou een behandeling met achterstachtering aan TSC's ook tot osteogenese kunnenleiden,wat leidde tot het voorstel dat de huidige methode tenogenese van andere stamcellen kan veroorzaken en osteogenese met een specifiek belastingregime kan voorkomen. Verder onderzoek is nodig om deze specifieke belastingsregimes voor andere soorten stamcellen te onderzoeken. Als dit scenario geldt, meer celbron voor de behandeling van tendinopathie zal beschikbaar zijn.

Er zijn nog enkele beperkingen te erkennen. Ten eerste, hoewel een niet-corrosief en autolavable materiaal, roestvrij staal, werd gebruikt om de bioreactor systeem te bouwen, de kweekomstandigheden en de cultuur medium nog steeds corroderen de kamer met inbegrip van de schroef en de haak. Zo zijn routinematige inspectie van de kamer en tijdige roestverwijdering noodzakelijk. Ten tweede, om de huidige bioreactor economisch en draagbaar te maken, is er geen milieucontrole en een medium circulatiesysteem in. Zo moet de operator de bioreactor vervoeren en de kamer elke 3 dagen openen voor middelgrote uitwisseling, wat het risico op besmetting verhoogt. De operator moet altijd opletten om de TSCs-omgeving steriel te houden.

Voor de behandeling van tendinopathie is het van vitaal belang om het pathologische proces vanuit een niet-chirurgisch perspectief te verduidelijken. In termen van chirurgische behandeling, een effectieve methode is het gebruik van gemanipuleerde autologe grafts. Het proces van het stimuleren van TDC's om differentiatie in vivo na te bootsen is nuttig voor het onderzoek van pathologisch proces van tendinopathie. De engineered steiger-vrij peesweefsel heeft de mogelijkheid om pees genezing te bevorderen in een rat patellar pees raam letsel model. Bovendien, eerder werk bleek de mechanische belasting kon de mechanische eigenschappen van gekweekte pees te verbeteren. Zo biedt dit protocol een reproduceerbare methode voor gerichte differentiatie van TSCs in peesachtig weefsel, zodat het eenvoudig en haalbaar kan worden gebruikt voor potentiële gemanipuleerde peescultuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het onderzoek werd uitgevoerd terwijl de auteur in ontvangst van "een Universiteit van West-Australië International Fee Scholarship en een University Postgraduate Award aan de Universiteit van West-Australië". Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81802214).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper's knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper's knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), Bristol, Avon. 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), Oxford, England. 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), Oxford, England. 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), Bristol, England. 014109 (2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), Cambridge, England. 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

Tags

Geneeskunde Probleem 162 Mechanische belasting stamcel van pees tendinopathie bioreactor differentiatie pees stamcel
Toepassing van een drie-dimensionale uniaxiale mechanische stimulatie bioreactor systeem om tenogene differentiatie van pees-afgeleide stamcellen induceren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen,… More

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter