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Aplicando um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional para induzir a diferenciação tenogênica de células-tronco derivadas do tendão

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61278
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia
* These authors contributed equally

Summary

Um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional é um bioreator ideal para diferenciação tenogênica específica de células-tronco derivadas do tendão e formação de neo-tendões.

Abstract

Tendinopatia é uma doença crônica comum relacionada à inflamação e degeneração em uma área ortopédica. Com alta morbidade, capacidade limitada de auto-reparação e, o mais importante, sem tratamentos definitivos, a tendinopatia ainda influencia negativamente a qualidade de vida dos pacientes. As células-tronco derivadas do tendão (TDSCs), como células precursoras primárias das células tendinosas, desempenham um papel essencial tanto no desenvolvimento da tendinopatia, quanto na restauração funcional e estrutural após a tendinopatia. Assim, um método que pode imitar in vitro a diferenciação in vivo de TDSCs em células tendinosas seria útil. Aqui, o presente protocolo descreve um método baseado em um sistema de alongamento uniaxial tridimensional (3D) para estimular os TDSCs a se diferenciarem em tecidos semelhantes a tendões. São sete estágios do presente protocolo: isolamento de TDSCs camundongos, cultura e expansão de TDSCs de camundongos, preparação de meio de cultura de estimulação para formação de folhas de células, formação de folhas de células por cultivo em meio de estimulação, preparação de construção de células-tronco tendinosas 3D, montagem do complexo de estimulação mecânica de alongamento uniaxial e avaliação do tecido mecânico estimulado in vitro como tendão. A eficácia foi demonstrada pela histologia. Todo o procedimento leva menos de 3 semanas. Para promover a deposição da matriz extracelular, utilizou-se ácido ascórbico de 4,4 mg/mL no meio da cultura de estimulação. Uma câmara separada com motor linear fornece carregamento mecânico preciso e é portátil e facilmente ajustada, que é aplicada para o bioreator. O regime de carregamento no presente protocolo foi de 6% de tensão, 0,25 Hz, 8h, seguido de repouso de 16h durante 6 dias. Esse protocolo poderia imitar a diferenciação celular no tendão, o que é útil para a investigação do processo patológico da tendinopatia. Além disso, o tecido semelhante ao tendão é potencialmente usado para promover a cicatrização do tendão na lesão tendinosa como um enxerto autólogo projetado. Resumindo, o presente protocolo é simples, econômico, reproduzível e válido.

Introduction

Tendinopatia é uma das lesões esportivas comuns. Manifesta-se principalmente por dor, inchaço local, diminuição da tensão muscular na área afetada e disfunção. A incidência de tendinopatia é alta. A presença de tendinopatia de Aquiles é mais comum para corredores de média e longa distância (até 29%), enquanto a presença de tendinopatia patelar também é alta em atletas de vôlei (45%), basquete (32%), atletismo (23%), handebol (15%) e futebol (13%)1,2,,3,,4,5. No entanto, devido à limitada capacidade de auto-cura do tendão e à falta de tratamentos eficazes, a tendinopatia ainda influencia negativamente a vida dos pacientes6,7. Além disso, a patogênese da tendinopatia permanece incerta. Tem havido muitas investigações sobre sua patogênese, principalmente incluindo "teoria da inflamação", "teoria da degeneração", "teoria do uso excessivo", e assim por diante8. Atualmente, muitos pesquisadores acreditavam que a tendinopatia era devido à falha no auto-reparo das micro-lesões causadas pelo carregamento mecânico excessivo das experiências tendinosas9,,10.

As células-tronco derivadas do tendão (TDSCs), como células precursoras primárias das células tendinosas, desempenham um papel essencial tanto no desenvolvimento da tendinopatia quanto na restauração funcional e estrutural após tendinopatia11,,12,,13. Foi relatado que a estimulação do estresse mecânico poderia causar a proliferação e diferenciação de osteocitos, osteoblastos, células musculares lisas, fibroblastos, células-tronco mesenquimais e outras células sensíveis à força14,,15,,16,,17,18. Portanto, os TDSCs, como uma das células mecanosensíveis e multipotentes, podem ser estimulados a diferenciar-se por carregamento mecânico19,,20.

No entanto, diferentes parâmetros de carga mecânica (força de carga, frequência de carga, tipo de carga e período de carregamento) podem induzir TDSCs a se diferenciar em diferentes células21. Assim, um regime de carregamento mecânico eficaz e válido é muito significativo para a tenogênese. Além disso, existem diferentes tipos de bioreatores como sistemas de estimulação atualmente utilizados para fornecer carregamento mecânico para TDSCs. Os princípios de cada tipo de bioreator são diferentes, de modo que os parâmetros de carregamento mecânico correspondentes a diferentes bioreatores também são diferentes. Portanto, é procurado um protocolo de estimulação simples, econômico e reprodutível, incluindo o tipo de bioreator, o meio de estimulação correspondente e o regime de carga mecânica.

O presente artigo descreve um método baseado em um sistema de alongamento uniaxial tridimensional (3D) para estimular os TDSCs a se diferenciarem em tecido semelhante ao tendão. São sete estágios do protocolo: isolamento de TDSCs camundongos, cultura e expansão de TDSCs de camundongos, preparação de cultura de estimulação para formação de folhas de células, formação de folhas de células por cultivo em meio de estimulação, preparação de construção de células-tronco tendinosas 3D, montagem do complexo de estimulação mecânica de alongamento uniaxial e avaliação do tecido mecânico estimulado in vitro. Todo o procedimento leva menos de 3 semanas para obter o construto de células 3D, que é muito menor do que alguns métodos existentes22,23. O presente protocolo tem sido provado ser capaz de induzir TDSCs a diferenciar-se em tecido tendão, e é mais confiável do que o sistema de alongamento bidimensional (2D) atualmente usado21. A eficácia foi demonstrada pela histologia. Em suma, o presente protocolo é simples, econômico, reproduzível e válido.

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Protocol

Os métodos descritos foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos do Comitê de Ética Animal da Universidade da Austrália Ocidental.

1. Isolamento de TDSCs de camundongos

  1. Eutanize os camundongos C57BL/6 de 6-8 semanas por luxação cervical.
  2. Colher tendões patelares24 e tendões de Aquiles25.
  3. Digestão de tendões de um com 6 mL de colagenase tipo I (3 mg/mL) por 3h.
    NOTA: Como o tamanho do tendão do mouse é pequeno, todos os tendões colhidos de um rato devem ser usados nesta etapa.
  4. Colete as células e a cultura em meio essencial mínimo completo (Alpha-MEM) contendo 10% do soro bovino fetal (FBS) e 1% da mistura de estreptomicina e penicilina por 7 dias.
  5. Identificar TDSCs usando a triagem celular ativada pela fluorescência por citometria de fluxo (expressão de marcadores de superfície celular incluindo CD44, CD90 e Sca-1; falta da expressão de CD34 e CD45).
  6. Células de passagem e congelamento (as células de passagem 4 serão usadas para novas etapas).

2. Cultura e expansão de TDSCs de camundongos

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

  1. Leve as células aquecidas (camundongos TDSCs, 1 milhão de células, passagem 4, a 37 °C).
  2. Adicione lentamente 4-5 mL extras de meio essencial mínimo completo (Alpha-MEM).
  3. Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 15 mL com uma pipeta.
  4. Cubra com médio a 8 mL total com uma pipeta.
    1. Meio pré-aquecido em uma incubadora de forno de 37 °C.
  5. Coloque o tubo em centrífuga e equilibre.
  6. Centrífuga e células de pelota a 347 x g por 5 min.
  7. Tire depois da centrífuga e verifique a pelota na parte inferior.
  8. Decante as células congelantes e resuspende suavemente em 1-2 mL de meio completo (evite fazer muitas bolhas).
  9. Transfira células resuspended para um frasco T-75 por uma pipeta.
  10. Use uma pipeta para adicionar o Medium Alfa-MEM completo ao frasco para atingir um volume total de 10 mL com concentração final de 13.000 células/cm2.
  11. Coloque o frasco na incubadora e cultura a 37 °C com 5% de CO2.
  12. Troque o meio a cada 3 dias.
  13. Observe e monitore as células sob um microscópio ao alterar o meio até que as células sejam cultivadas para 100% de confluência (cerca de 40.000 células/cm2).

3. Preparação do meio de cultura de estimulação para formação de folhas de células

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

  1. Despeje 15 mL de meio Alfa-MEM completo em um tubo estéril de 15 mL.
  2. Adicione 6 μL de ácido ascórbico (11 mg/mL) em 15 mL de meio para uma concentração final de 4,4 μg/mL.
    NOTA: Além disso, adicionar 25 ng/mL de fator de crescimento do tecido conjuntivo no meio da cultura de estimulação pode acelerar todo o processo de crescimento e diferenciação.
  3. Misture suavemente invertendo para cima e para baixo.

4. Formação de folhas de células por cultivo em meio de estimulação

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

  1. Descarte cuidadosamente o meio alfa-MEM completo normal e evite tocar nas células presas à parte inferior do frasco.
  2. Adicione 10 mL de meio de estimulação lentamente e evite causar qualquer perturbação às células totalmente confluentes.
  3. Cultura as células em meio de estimulação por 9 dias (mude o meio a cada 3 dias) para gerar suficientemente a folha celular a 37 °C com 5% de CO2.
    NOTA: A matriz extracelular ficará espessa e presente para ser nublada quando observada a partir da parte inferior do frasco após estimulada pelo ácido ascórbico, o que significa que a folha celular é suficientemente gerada.

5. Preparação da construção de células-tronco tendinosas 3D

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

  1. Tire o frasco da incubadora.
  2. Descarte completamente o meio de estimulação.
  3. Lave a folha de células de monocamadas com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) girando o frasco.
  4. Descarte completamente o PBS.
  5. Use uma pipeta para adicionar 1 mL de 0,25% de trippsina no canto do frasco.
  6. Toque no canto do frasco para desacoplar a folha de células da monocamada até que o canto da folha de células esteja fora da parte inferior do frasco.
  7. Adicione imediatamente 9 mL de meio Alfa-MEM completo para parar a trippsinização.
  8. Continue girando o frasco para descascar completamente a folha de células da monocamada.
  9. Despeje a folha de células totalmente desarmada em uma placa de Petri com meio.
  10. Use uma pinça estéril para pegar um canto da folha de celular e girar no sentido horário por 15 vezes.
  11. Pegue outra extremidade da folha de células e gire em sentido anti-horário por 10 vezes para gerar firmemente uma construção in vitro semelhante ao tendão(Figura 1A).

6. Montagem do complexo de estimulação mecânica de alongamento uniaxial em bioreator projetado único

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

  1. Conecte os ganchos pelo conector e ajuste à distância desejada (2 cm) entre dois ganchos.
  2. Enrole suavemente os TDSCs 3D construídos no gancho montado por 3 vezes em cada gancho(Figura 1B).
  3. Fixar os ganchos com construção celular na câmara do bioreator apertando os parafusos em duas extremidades.
    NOTA: Toda a câmara, incluindo parafusos e ganchos, é estéril (autoclave por 1,5 h a 134 °C e raios ultravioleta (UV) expõem por 24 horas antes do uso). Para o suporte metálico das câmaras, a luz UV expõe por 48 horas antes do uso.
  4. Encha a câmara com o meio Alfa-MEM completo.
  5. Conecte o atuador à câmara de cultura por cabo.
  6. Corte o conector dos ganchos por uma tesoura estéril.
  7. Ligue a potência e o controlador de canal correspondente para iniciar a estimulação mecânica.
  8. Coloque a tampa na câmara.
  9. Verifique as luzes indicadoras e assegure que o bioreator possa funcionar corretamente.
  10. Coloque o bioreator na incubadora e submia a construção de células 3D ao alongamento mecânico por 6 dias (alongamento de 6%, 0,25 Hz, 8h, seguido de 16h de repouso).

7. Avaliação do tecido mecânico estimulado in vitro semelhante ao tendão

  1. Solte os parafusos por uma chave de fenda e retire o conjunto com cuidado.
  2. Coloque o tecido tendinoso em 4% de paraformaldeído para fixação por 15 minutos.
  3. Coloque o tecido fixo do tendão em um de biópsia com almofadas de espuma biópsia.
  4. Processo para desidratar a amostra e, finalmente, avaliar por manchas histológicas de H&E.
  5. Repita todo o protocolo e extraia RNA do tecido semelhante ao tendão para avaliar a expressão de marcadores tenogênicos por PCR quantitativo (qPCR). Os primers dos genes selecionados estão listados na Tabela 1.
    NOTA: O protocolo de histologia e o protocolo qPCR são padrão e seguem um estudo anterior21.

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Representative Results

Antes da estimulação mecânica, os TDSCs foram cultivados para 100% de confluência em meio completo e apresentaram uma morfologia ultraestrutural desorganizada(Figura 2A). Após 6 dias de carga mecânica de alongamento uniaxial, a matriz extracelular (ECM) e os alinhamentos celulares foram bem orientados(Figura 2B). As células estavam bem povoadas e bem envoltas em ECM após o carregamento mecânico. A morfologia celular foi apresentada para ser alongada e mais semelhante à célula tendinosa normal em comparação com a sem alongamento(Figura 2C). A densidade celular na construção celular com carga foi maior do que na sem carga. Os resultados do QPCR mostraram que o presente método aumentou a expressão dos marcadores tenogênicos, incluindo Scleraxis, Mohawk, Tenomodulin e COL1A1(Figura 3) em comparação com os tratados pela cultura estática.

Figure 1
Figura 1: Montagem de célula tridimensional (3D) construída sobre os ganchos do bioreator. (A) Visão geral da construção da célula 3D sobre os ganchos. (B) O diagrama para montar a construção da célula 3D sobre os ganchos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Morfologia celular antes e depois da estimulação mecânica. (A) As células-tronco derivadas do tendão foram cultivadas para 100% de confluência em meio completo e apresentaram uma morfologia ultraestrutural desorganizada antes da estimulação mecânica. (B) Imagens histológicas mostraram a coloração de H&E da construção celular após estimulação mecânica. (C) Imagens histológicas mostraram a coloração de H&E de uma célula de controle cultivada em bioreator por 6 dias sem estimulação mecânica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Nível de expressão de marcadores de tenogênese. Os níveis individuais de expressão genética foram primeiro normalizados contra o controle interno, 36B4, e depois normalizados contra os níveis de expressão genética de culturas estáticas. Os resultados de 3 experimentos são mostrados. As sequências de primer utilizadas para análise qPCR são fornecidas na Tabela 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: O sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gene Sequência de primer
Forward 5'->3' Reverso 5'->3'
COL1A1 TGACTGGAAGAGCGGAGAGT GTTCGGGCTGATGTACCAGT
Scleraxis CCCAAACAGATCTGCACCTT GGCTCTCCGTGACTCTTCAG
Mohawk GTCCGGCAGCCAGATTTAAG TCGCTGAGCTTCTCTTTA
Tenomodulina CCGCAGAAAAAGCCTATTGAA GACCACCCATTGCTCATTCT
36B4 CTTCCCACTTGCTGAAAAAGG CGAAGAGACCGAATCCCATA

Tabela 1: Sequências de primer usadas para análise qPCR

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Discussion

O tendão é um tecido conjuntivo fibroso mecanosensível. De acordo com pesquisas anteriores, o excesso de carga mecânica poderia levar à diferenciação osteogênica das células-tronco tendinosas, enquanto o carregamento insuficiente levaria à estrutura de fibra de colágeno desordenada durante a diferenciação do tendão21.

Uma visão comum é que a chave para um bioreator ideal é a capacidade de simular o microambiente celular in vitro que as células in vivo sofrem. Portanto, imitar o ambiente de estresse normal in vivo in vitro é a chave para estimular a diferenciação de linha única dos TDSCs em células tendões. No presente protocolo, a largura do contomídico TDSC foi de 2 cm, e a amplitude de movimento do gancho foi de 0,12 cm, o que significa que a cepa foi de 0,12/2 (%). Em conclusão, os TDSCs foram mecanicamente estimulados em um bioreator por 6 dias (6%, 0,25 Hz, 8h, seguidos de 16h de repouso) no presente protocolo. Após a avaliação, os parâmetros de carregamento mecânico utilizados neste protocolo têm sido comprovados para induzir TDSCs a gerar tecido semelhante ao tendão. Deve-se notar que os parâmetros do bioreator devem corresponder especificamente ao tipo correspondente de sistema de alongamento. Por exemplo, os parâmetros adequados para alongamento de células monocamadas são diferentes da atual folha de células 3D que se estende26,27. Uma possível razão são os diferentes modos de força21. No sistema de alongamento da monocamada 2D, as células se conectam ao substrato de cultura por aderências focais na parte inferior e se conectam entre si através de junções célula-célula. No entanto, em uma folha de células 3D, há também muito mais conexões célula-ECM formadas como resultado do nicho 3D, o que significa que as células estão sob pressão além de alongamento.

A eficácia do presente protocolo foi demonstrada pela morfologia e pelo nível de expressão dos marcadores tenogênicos. Em termos de morfologia, além da histologia, usar microscopia de imunofluorescência confocal para detectar colágeno I é uma maneira comum de caracterizar a organização do colágeno e, em seguida, avaliar o alinhamento do ECM. Estudo anterior confirmou a formação bem alinhada do feixe de colágeno tipo I no conto TDSC com 6% de estimulação mecânica uniaxial por 6 dias, mas não no sem carregar21. Marcadores tenogênicos foram usados para identificar células tendinosas, incluindo Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX), Tenomodulin (TNMD) e COL1A1. Apenas o TNMD foi um fator de não transcrição, e o resto deles são fatores de transcrição28. Foram todos bem reconhecidos. A SCX poderia regular o desenvolvimento do tendão no estágio embrionário29,enquanto o MKX poderia regular a diferenciação e a maturação dos tendões no estágio pós-natal30. Além disso, as propriedades mecânicas (carga máxima e rigidez) do tecido semelhante ao tendão também foram avaliadas em estudos anteriores, e mostraram que as propriedades mecânicas da construção de TDSC com carregamento foram melhores do que no sem carregar21.

O meio pode afetar o crescimento celular e a diferenciação. No presente protocolo, a fim de formar a folha de células de forma adequada, os TDSCs foram cultivados para 100% de confluência em frascos de plástico não revestidos padrão em meio completo, e então os TDSCs foram estimulados a promover a deposição do ECM adicionando ácido ascórbico de 4,4 mg/mL para 6 d. Vários fatores de crescimento, incluindo o fator de crescimento semelhante à insulina I, fator de crescimento endotelial vascular, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento do fibroblasto básico, fator de crescimento transformador e fator de diferenciação de crescimento 5, desempenharam um papel importante na formação e cura do tendão31,,32,,33,,34. Além disso, a adição de 25 ng/mL fator de crescimento do tecido conjuntivo no meio da cultura de estimulação como Ni et al. relatou poderia acelerar todo o processo de crescimento e diferenciação35.

Atualmente, a folha de células 2D, também conhecida como célula monocamada, é o sistema mais comum usado para investigações mecânicas. O estiramento biaxial proporciona tensão multidirecional, tanto longitudinal quanto lateralmente, pois o trecho uniaxial só proporciona tensão longitudinal36. Assim, a cultura celular monocamada com estiramento biaxial poderia imitar o ambiente de crescimento de alguns tipos de células, como cardiomiócitos e células epidérmicas. No entanto, a construção celular 3D é mais semelhante à forma real de um tendão, e o estiramento uniaxial é mais semelhante às características de estresse das células tendinosas, em comparação com a folha de células 2D e o estiramento biaxial. Assim, a combinação da construção celular 3D e do alongamento uniaxial é mais competente para uma melhor compreensão do tendão e seu microambiente mecânico. Isso fornece uma base teórica para o uso de um sistema de alongamento uniaxial 3D para estimular a diferenciação de TDSCs. Assim, a folha de células 2D foi finalmente enrolada em uma construção de célula 3D e passou por um trecho uniaxial no presente protocolo.

O bioreator utilizado no presente protocolo consistiu na câmara atuante e cultural (Figura 4). Os detalhes do presente bioreator estão disponíveis em um estudo anterior37. Atualmente, os atuadores mais comuns utilizados para tendão incluíam atuadores pneumáticos, motores lineares e parafusos de motobol38,,39,,40. As câmaras incluíram câmaras integradas e separadas41,42. Entre eles, uma câmara separada com motor linear forneceu carregamento mecânico preciso e foi portátil e fácil de ser ajustado43.

Exceto os TDSCs, outros tipos de células-tronco podem ser uma fonte celular potencial a ser usada no método atual. Pesquisas anteriores mostraram que outros tipos de células-tronco podem ter capacidade terapêutica potencial e melhorar a regeneração dos tendões. Em comparação com os tendões equinos feridos tratados com o manejo convencional nãocelular, a taxa de re-lesão dos tendões tratados pelos BMSCs foi menor44,45. Além disso, a injeção intratendinária de BMSCs em um modelo de tendinopatia poderia efetivamente induzir a regeneração tendinosa46. Células-tronco derivadas de adiposos poderiam efetivamente tratar tendinopatias equinas levando à recuperação completa e retorno à atividade normal em cavalos47. Juntos, havia evidências suficientes para sugerir que células-tronco, exceto TDSCs, poderiam tratar a degeneração dos tendões. No entanto, como nota de precaução, o transplante de BMSCs em tendões lesionados tem sido demonstrado para induzir a diferenciação osteogênica ectópica em um modelo de coelho, sugerindo que as células-tronco de um tecido específico podem ter uma tendência a se diferenciar em células indesejadas de seu tecido deorigem 48. Em pesquisas anteriores, o tratamento privado de carga para TDSCs poderia resultar em osteogênese também21, o que levou à proposta de que o método atual tem o potencial de induzir a tenogênese de outras células-tronco e evitar a osteogênese com regime de carregamento específico. Mais pesquisas são necessárias para explorar esses regimes específicos de carregamento para outros tipos de células-tronco. Se esse cenário se mantiver, mais fonte celular para tratar tendinopatia estará disponível.

Ainda há algumas limitações a serem reconhecidas. Primeiro, embora um material não corrosivo e autoclavável, aço inoxidável, foi usado para construir o sistema bioreator, as condições de cultivo e o meio de cultura ainda corroem a câmara, incluindo o parafuso e o gancho. Assim, é necessária uma inspeção de rotina da câmara e a remoção oportuna da ferrugem. Em segundo lugar, a fim de tornar o atual bioreator econômico e portátil, não há um sistema de controle ambiental e de média circulação nele. Assim, o operador precisa transportar o bioreator e abrir a câmara para troca média a cada 3 dias, o que aumenta o risco de contaminação. O operador deve sempre prestar atenção para manter o ambiente TDSCs estéril.

Para o tratamento da tendinopatia, é vital esclarecer o processo patológico de uma perspectiva não cirúrgica. Em termos de tratamento cirúrgico, um método eficaz é o uso de enxertos autólogos projetados. O processo de estimular os TDSCs a imitar a diferenciação in vivo é útil para a investigação do processo patológico da tendinopatia. O tecido tendão sem andaimes projetado tem a capacidade de promover a cicatrização do tendão em um modelo de lesão da janela do tendão patelar de rato. Além disso, trabalhos anteriores comprovaram que o carregamento mecânico poderia melhorar as propriedades mecânicas do tendão cultivado. Assim, este protocolo fornece um método reprodutível para diferenciação direcionada de TDSCs em tecido tendinoso para que possa ser usado de forma simples e viável para a cultura potencial do tendão projetado.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

A pesquisa foi realizada enquanto o autor estava recebendo "uma Bolsa de Estudos de Taxa Internacional da Universidade da Austrália Ocidental e um Prêmio de Pós-Graduação universitária na Universidade da Austrália Ocidental". Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81802214).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Medicina Edição 162 Carga Mecânica célula-tronco derivada do tendão tendinopatia bioreator diferenciação tendão células-tronco
Aplicando um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional para induzir a diferenciação tenogênica de células-tronco derivadas do tendão
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Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).

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